材料与试剂

黑色不透明亚克力或塑料板（高：18 厘米；宽：6 厘米；厚度：2 毫米）
亚克力板（21.5 × 13 厘米，1 毫米厚）制成的三角形天花板（YSTIME，目录号：B08NPMVJGQ）
透明亚克力铰链（IVYTOHO，目录号：B07SMSJJK2）
0.5 毫米厚的高密度白色聚乙烯塑料板（ Polymersan ，目录号：0714038308181）
40 × 40 × 40 mm 聚氨酯橡胶块（ Tokyu Hands，目录号：4989606010889）
焊锡丝（ Editone ，Adafruit，目录号：SAC305）
连接线轴组，22AWG 实芯，10 × 25 英尺（Adafruit，目录号：3174）
瞬时按钮开关 NO NC AC 5 A/120 V（ DIYhz ，目录号：B079D923V9）
DB9 D-SUB RS232 适配器 9 针信号端子分线塑料盖 2 排（公头带螺丝）（ Daier ，目录号：B01C2V2E8BU）
带优质线头末端的 IR 断束传感器，3 毫米 LED（Adafruit，目录号：2167）
MPR121 12 键电容式触摸传感器分线器（Adafruit，目录号：B0778WYR5D）[备选方案：适用于 Arduino 的 Adafruit 12 ×电容式触摸屏 – MPR121（Adafruit，目录号：2024）]
Adafruit LED 亮片 [发光强度：最小值 = 250 mcd，最大值 = 350 mcd，IF（正向电流）= 20 mA；发光强度测量余量为± 10%]、暖白色（Adafruit，目录号：1758）
扬声器8Ω 8W（ Akizukidenshi ，目录号：F00805）
Amazon Basics USB 2.0 打印机电缆 - A 型到 B 型电缆（Amazon Basics，目录号：B00NH11KIK）
白色棉/涤纶针织手套（ Setaria Viridis ，目录号：B08QHLCZ11）
双面胶带（3M，目录号： 0888519024546 ）
杜邦线鳄鱼皮（ Oiyagai ，目录号：B07CXLMBY7）
成年小鼠（8 周龄至 18 周龄）
70%乙醇溶液

设备

模块化腔室（ Lab-hacks，型号：STCHK0001 ）
带橡胶塞和水管的水壶（CLEA Japan，目录号：CL-0917）
鼠标用声音衰减隔间（ Med associates，型号：MED-OFA-022 ）
独立厌恶刺激器/扰频器 (115V/60Hz)（ Med associates，型号/目录号：ENV-414S ）[备选方案：精密动物电击器（Coulbourne Instruments，Harvard Apparatus，目录号：H13-15）]
Arduino Mega2560 Rev3（Arduino，目录号：A000067）
Raspberry Pi 3 型号 B+ [Raspberry Pi，目录号：(Digi-Key)2648-RASPBERRYPI3MODELB+-ND]
带有标准 T18-D16 尖端的数字正品 Hakko（Hakko，目录号：FX-888D）

软件

Arduino IDE（Arduino， https: //www.arduino.cc/en/software ）
蟒蛇（Anaconda， https: //www.anaconda.com/ ）
Spyder IDE（包含在 Anaconda 中， https://www.spyder-ide.org/ ）
Python 3 ( https://www.python.org/downloads/ )
Python 库： pyserial 3.5 ( https://pyserial.readthedocs.io/en/latest/pyserial.html )； csv、time 和os模块是 Python 标准库的一部分
Excel（微软， https://www.microsoft.com/fr-ww/microsoft-365/excel ）
棱镜 9（GraphPad 软件， https: //www.graphpad.com/company/ ）
SPSS 23.0（IBM， https://www.ibm.com/analytics/spss-statistics-software ）
Arduino 和 Python 脚本 ( https://github.com/YuYuB/Bio-Protocol-ConditionedLickSuppression )

程序

处理和禁水

如果小鼠是从供应商处订购的，则将同性小鼠（每笼 3-4 只）饲养在温度/湿度受控（分别为 25 ± 2 °C，40% - 60%）的环境中，不受限制地获取食物和水, 12 小时反向光/暗循环室（从晚上 7 点到早上 7 点光照）至少一周。如果小鼠是在实验室出生的，请确保它们与同性动物（每笼 3-4 只）一起饲养，在三周大断奶后，在温度/湿度条件下可以无限制地获取食物和水 -受控（分别为 25 ± 2 °C，40% – 60%），12 小时反向光/暗循环室（从晚上 7 点到早上 7 点光照）。整个过程应在光照周期的黑暗阶段（即早上 7 点到晚上 7 点之间）进行。早上在上下文 A 和下午在上下文 B 中运行实验 3 中的小鼠。在黑暗周期内运行实验 1 和 2 中的每只小鼠，大约与第一次适应期（ ± 3 小时）同时进行。
在黑暗周期中，将所有老鼠单独安置并至少连续三天处理它们 5 分钟。要使鼠标习惯于处理，请用一只手从尾巴上拿起它，然后戴上棉/涤纶针织手套将其放在另一只手上。当鼠标站立或行走时，一只手轻轻地握住尾巴，以防止逃脱。在至少连续处理三天后，当老鼠停止试图跳出手时，处理被认为是完成的。
在小鼠处理后的第二天，在实验开始前 24 小时，在黑暗周期中，从他们的笼子里取出水瓶。
将小鼠 (N = 7–11) 分配给八组中的一组 (图 1):
仅上下文条件：实验组
仅上下文条件：无处理对照组
仅上下文条件：未配对的控制组
Cued-Only 条件：实验组
Cued-Only 条件：无治疗对照组
仅提示条件：未配对的对照组
复合条件：实验组
复合条件：无处理对照组

图1 。该过程的示意图。每个条件和组的实验流程图。左边的最后三列代表程序的三个不同阶段（适应、调节和测试）。插图转载自Bouchekioua等人。 (2022)。

适应阶段（第 1 天至第 5 天）

连续五天在声音衰减隔间内的调节室内给每只老鼠 30 分钟的适应期（图 1）。在适应阶段，老鼠可以通过杂志接触到装满水的舔管。记录舔次数和杂志条目。在适应环境的前两天，在杂志内留下两滴水。
在整个实验过程中，用 70% 的乙醇溶液清洁动物之间的腔室。
确保适应脚本“ SPC_Acclimation.ino ”（ https://github.com/YuYuB/Bio-Protocol-ConditionedLickSuppression ）已上传到 Arduino。
如果已连接，请断开 USB 电缆从 Arduino 到您的 PC（Mac OS 或 Windows）或 Raspberry Pi 的 USB 端口。
如果您使用 PC（Mac OS 或 Windows），请打开 Arduino IDE，左键单击菜单栏中的工具，然后将鼠标光标放在端口行上（图 2）。记下显示的端口名称（如果有）。将 Arduino USB 电缆连接到您的 PC，然后返回到“工具”菜单的“端口”行。记下出现的新端口名称。它对应于您的 Arduino 连接到的端口名称。

图 2. Arduino IDE 中 USB 端口名称的显示。 (A) 将 Arduino 连接到 PC 之前的端口名称列表。 (B) 将 Arduino 连接到 PC 后的端口名称列表，包括 Arduino 使用的端口名称（即本例中的“/dev/cu.usbserial-14110”）。

如果您使用带有 Linux 的 Raspberry Pi（或任何带有 Linux 操作系统的 PC），请打开命令终端，输入“ls /dev/ tty *”，然后在将 Arduino 连接到 USB 端口之前按键盘的 Enter 键树莓派。记下显示的端口名称。将 Arduino USB 电缆连接到您的 Raspberry Pi，然后在命令终端上重复使用命令“ls /dev/ tty *”。记下出现的新端口名称。
打开 Python 3 IDE（PC 上的 Spyder 和 Raspberry Pi 上的 Python 3 IDLE）并打开适应阶段“Acclimation.py”的 Python 数据收集脚本（ https://github.com/YuYuB/Bio-Protocol-ConditionedLickSuppression ） .通过按 Spyder 上的“运行文件”图标（绿色向右箭头）（图 3）或左键单击菜单栏中的“运行”，然后左键单击 Raspberry Pi 的 Python3 IDLE 上的“运行文件”行，开始运行此 Python 脚本。或者，您只需按键盘上的 F5 键即可开始运行脚本。

图 3. Spyder 的菜单栏。 Spyder 菜单栏的屏幕截图。运行文件图标以红色圆圈突出显示。

输入您的 Arduino 连接到的 PC/Raspberry Pi USB 端口名称，然后按 Enter。
键入新文件名并按 Enter。
最后，以秒为单位键入会话时间，然后按 Enter。
将鼠标放在声音衰减隔间内的调节室中，松开鼠标并关闭调节室的前门后，立即按下连接到 Arduino 的启动按钮。按下开始按钮将打开杂志线。没有其他灯用于灯罩。
将上下文 A 用于仅上下文条件的实验组和无处理对照组的小鼠（图 4）。

图 4. 环境 A 在适应阶段。 (A) 图片（从上方）显示用于上下文 A 的调理室的配置。红色箭头突出显示一块用作支架并放置在杂志内的透明丙烯酸，以方便老鼠进入水口。 (B) 图片（从腔室内部，面向杂志）显示了用于上下文 A 的调节室的配置。红色箭头指向杂志灯、两个扬声器、水口和光束中断传感器（红外灯在杂志的另一侧）。扬声器的底部和顶部分别距离网格地板 3.5 厘米和 8 厘米。使用螺钉将扬声器固定在墙壁（杂志侧）的中间面板（即顶部的第二个面板）上 [cf., ChamberSideView (Water bottle and Speakers).jpeg, https://github.com/YuYuB/Bio-Protocol-ConditionedLickSuppression/tree/main/BioProtocol%20Github ]。光束中断 LED 的底部和顶部分别用强力胶和热胶固定在距网格地板 1.5 厘米和 2 厘米处。水口的底部和顶部分别距离网格地板 2.5 和 3 厘米。使用传统的钻头和钻头在铝制弹匣上钻出用于光束中断 LED 和水口的孔。扬声器、水口和光束中断 LED 的位置对于两种情况（即，情况 A 和 B）都是相同的。

将上下文 B 用于仅上下文条件的未配对控制组的小鼠，以及仅提示条件的实验、无处理控制和未配对控制组的小鼠（图 5）。

图 5. 上下文 B。图片（从上方）显示用于上下文 B 的调节室的配置。红色箭头突出显示白色塑料地板、三角形天花板（由两块 1 毫米厚的亚克力板与两个透明连接亚克力铰链并形成 80 °角），出水口，以及用于防止逃生的白色塑料板到达三角形天花板的顶部。

每天运行两次复合条件下的所有小鼠（即实验组和无处理对照组）。在早上使用上下文 A，在六个小时后的下午使用上下文 B（图 1）。
在 30 分钟会议结束时将鼠标从腔室中取出。
每次会话后，在“仅上下文”和“仅提示”条件下，让小鼠在家里的笼子里喝水 30 分钟。在一天的最后一次会议后，让条件化合物中的小鼠在家里的笼子里喝水 30 分钟。

恐惧调节阶段（第 6 天）

将黑色不透明塑料/丙烯酸板放在弹匣前，以防止弹匣进入和接触注水舔管（图 6）。

图 6.调节阶段的上下文 A。 (A) 图片（从上方）显示在调节阶段用于上下文 A 的调节室的配置。通过在它前面添加一个不透明的塑料板来防止接近杂志。 (B) 从房间内部拍摄的图片，面向杂志。

上传与鼠标所属条件相对应的 Conditioning Arduino 脚本（至 Arduino），并确保足震器已打开，连接到 Arduino，并设置为 0.5 mA。将脚本“SPC_Phase_2_CS-US_30min.ino”上传到 Arduino，用于组实验和不处理条件 Cued-Only 和 Compound，并将脚本“SPC_Phase_2_US_30min.ino”上传到 Arduino，用于组实验和不处理条件上下文-仅 ( https://github.com/YuYuB/Bio-Protocol-ConditionedLickSuppression )。将脚本“SPC_Phase_2_US-CS_30min.ino”上传到 Arduino，用于条件为 Cued-Only（ https://github.com/YuYuB/Bio-Protocol-ConditionedLickSuppression ）的未配对组小鼠。
除 Cued-Only 条件下的未配对组外，所有组和条件的小鼠在以下开始时接受 1 秒、0.5 毫安的足部电击：5.15、9.15、14.15、17.15、21.15 和 25.15 分钟进入会议。
处于 Cued-Only 状态的未配对组的小鼠在以下开始时接受 1 s、0.5 mA 的足部电击：8.5、11.7、15.9、18.3、22.25 和 23.8 分钟进入会话。
在 Cued-Only 和 Compound 条件下所有组的小鼠在以下开始时收到 10 s、12 kHz 纯音：5、9、14、17、21 和 25 分钟进入会话，即 9 秒前每只脚电击的开始。
将 Arduino 连接到 PC/Raspberry Pi。
对所有组和条件的小鼠使用上下文 A（图 1）。
将鼠标放在声音衰减隔间内的调节室中，并在释放鼠标后立即按下连接到 Arduino 的启动按钮。
在 30 分钟会议结束时将鼠标从腔室中取出。
每次会议后，让所有老鼠在家里的笼子里喝水 30 分钟。

测试阶段（恐惧消退：第 7至10 天）

给每只老鼠一个 30 分钟的恐惧消退期，在声音衰减隔间内的调节室中，对于未配对的控制组的小鼠，只持续一天，对于所有其他组的小鼠，连续四天（图 1）。在测试阶段，老鼠可以通过弹匣接触到装满水的舔管。记录舔次数和杂志条目。
按照步骤 B.1.a 进行操作。到 B.1.g，除了 Arduino 的脚本和 Python 数据收集脚本应该对应于测试阶段、条件和组。
Acclimation.ino ”上传到 Arduino，用于所有处于“仅上下文”状态的小鼠 ( https://github.com/YuYuB/Bio-Protocol-ConditionedLickSuppression )，并在您的 PC 上使用 Python 脚本“Acclimation.py”/ Raspberry Pi 用于数据收集。所有小鼠在仅上下文条件下的测试会话与适应会话相同。
将脚本“ SPC_TEST.ino ”上传到 Arduino，用于所有处于 Cued-Only 状态的小鼠和所有处于 Compound 状态的小鼠，用于 am 会话（ https://github.com/YuYuB/Bio-Protocol-ConditionedLickSuppression ）并使用 Python 脚本用于数据收集的“TEST.py”。所有处于 Cued-Only 条件下的小鼠和所有处于 Compound for am 条件下的小鼠的测试会话包括一个音调提示传递，由在杂志内花费的累积五秒触发多达五次。如果触发了五个音调提示，或者在 30 分钟后，会话结束。
条件化合物中所有小鼠的测试会话与上午的适应会话（即步骤 C.2.a）和下午的仅提示测试会话（即步骤 C.2.b）相同。

数据分析

纳入标准

在第 1 天和第 2 天无法从充满水的舔管（即0 次舔）中喝水的老鼠。

数据处理

将在要分析的会话期间收集的 CSV 文件放入与 Python 脚本相同的文件夹中，以根据您正在分析的条件和组进行数据处理。使用 Python 3 进行数据处理。数据处理有两个Python脚本：
使用 Python 脚本“Contextual fear extinction.py” ( https://github.com/YuYuB/Bio-Protocol-ConditionedLickSuppression )分析在上午会议中从所有条件上下文组和所有复合组收集的数据（即，对于上下文恐惧消退）。打开由 Python 脚本生成的文件，其名称在原始 CSV 文件名后添加了“bin”。 30 分钟会话期间的舔次数出现在标题为“舔#”的栏下。
使用另一个 Python 脚本“Cued fear extinction.py” （ https://github.com/YuYuB/Bio-Protocol-ConditionedLickSuppression ）分析从所有条件 Cued-Only 组和所有条件化合物组收集的数据下午会议（即，提示恐惧消退）。触发的每个音调的抑制比显示在 Python 脚本生成的 CSV 文件的标题为“抑制比”的列中。

条件舔抑制比

基线分数
对于所有组条件仅上下文和复合（am 会话），通过在适应阶段的最后两天（即第 4 天和第 5 天）的 30 分钟会话期间平均舔率来计算基线分数。
对于仅提示和复合（下午会话）条件的所有组，基线分数是通过在音调提示开始之前的 5 秒内平均舔率来计算的。
性能得分
对于仅上下文和复合（am 会话）条件的所有组，通过平均测试阶段每天 30 分钟会话期间的舔率来计算性能分数。
对于仅提示和复合（下午会话）的所有条件组，性能得分是通过平均音调提示的前 5 秒内的舔率来计算的。每个触发的音调的条件抑制比已经由 Python 脚本计算，并且可以在生成的文件的“抑制比”列中找到，该文件的名称在原始 CSV 文件名中添加了“_analyzed”。计算每组的平均抑制比。
条件舔抑制比
对于每组计算平均条件舔抑制率如下：

Conditioned Lick Suppression Ratio=(Baseline - Performance)/(Baseline + Performance)

为了比较 Cued-Only 和 Compound 条件的实验和控制未配对组，仅使用第 7 天的第一个触发音调的抑制比（图 7）。

图 7 。在仅上下文条件下舔抑制比的表示。 (A) 与实验组小鼠相比，未治疗组小鼠（C57BL/6N 野生型雄性小鼠；N = 11）的上下文舔抑制比（仅上下文条件；第 7-10 天）[5- HT 2C R KO 雄性小鼠（RRID：IMSR_JAX：015821）； N = 11]。 (B) 对照组小鼠（C57BL/6N 野生型雄性小鼠；N = 9）与实验组小鼠 [5-HT 2C R KO 雄性小鼠（RRID：IMSR_JAX：015821）； N = 11]。插图转载自Bouchekioua等人。 (2022)。

存活率（存活概率）
对于仅提示和复合（下午会话）的所有条件组，存活率对应于测试会话期间触发的音调提示的数量。触发的音调提示数显示在 Python 脚本生成的文件的“Tone #”列中。存活率表示每组内触发的音调提示的百分比（图 8）。触发的音调提示数量少反映了对音调提示的更高恐惧。

图 8. Cued-Only 条件下存活率的表示。与实验组小鼠 [5-HT 2C ] 相比，未治疗组小鼠（C57BL/6N 野生型雄性小鼠；N = 9）的存活率百分比概率（仅提示条件；第 7-10 天） R KO 雄性小鼠（RRID：IMSR_JAX：015821）； N = 9]。 (A) 第 1 天的恐惧消退会议 (Ext D1)。 (B) 在第 2 天 (Ext D2) 提示恐惧消退会议。 (C) 在第 3 天 (Ext D3) 提示恐惧消退会议。 (D) 在第 4 天提示恐惧消退会议（Ext D4）。插图转载自Bouchekioua等人。 (2022)。

统计测试
使用未配对的双尾学生t检验，即在灭绝的第一天（第 7 天）进行舔抑制比的组间比较。由于来自实验组（第 7 天）的数据使用了两次，因此使用 Bonferroni 校正。
使用第 7 天的抑制率来比较仅上下文条件的实验组和无治疗组。
使用第 7 天第一个触发音调的抑制比仅用于比较未配对的实验组和控制组之间，以及 Cued-Only 条件的实验组和未治疗组之间的比较。
仅使用第 7 天第一个触发音调的抑制比来比较复合条件的实验组和未治疗组。
使用双向方差分析 (ANOVA) 进行重复测量，即用于跨测试会话（恐惧消退）的舔抑制比的组间比较。适用时进行 Bonferroni 事后检验以进行多重比较。如果 Mauchly 的球形检验显着，则使用 Greenhouse -Geisser校正。
在比较复合条件的实验组和无治疗组时，如果不是所有小鼠都触发相同数量的音调提示，则使用混合效应方差分析。
在比较 Cued-Only 和 Compound 条件的实验组和无治疗组之间的存活率表现时，使用对数范围 (Mantel-Cox) 测试。

笔记

将连接到 MPR121 传感器的电线直接焊接到注水舔管（图 9）。

图 9. 电线焊接到注水管上。图片显示电线 [将电容式触摸传感器 (MPR121) 连接到注水管] 直接焊接到注水管上。

使用热缩管隔离注水舔管并覆盖连接 MPR121 传感器和管的电线（图 10）。当小鼠从非隔离的注水舔管喝水时，如果任何身体部位（例如鼻子）在饮水时与管接触，电容式触摸传感器将只计算一次舔。通过隔离管，电容式触摸传感器仅检测舌头和管内球之间的接触（防止漏水）。热缩管还可以防止管子与弹匣直接接触。

图 10. 热缩管。图片显示了覆盖注水管的热缩管以及连接电容式触摸传感器和管的电线。

为了将水瓶保持在固定位置，同时注水管的喷嘴暴露在弹匣内，我们用强力胶粘了一个 40 × 40 × 40 毫米的聚氨酯橡胶块，该橡胶块之前以一定角度钻孔（直径 10 毫米）大约 45 ° [cf. “ ChamberSideView (Water bottle and Speakers).jpeg”，可在我们的Github中获取 ( https://github.com/YuYuB/Bio-Protocol-ConditionedLickSuppression/tree/main/BioProtocol%20Github )。或者，我们提供一个 *.STL 文件 (“ Lickometer MagAdapter.stl ”）在上面提到的Github中 3D 打印了一个支撑水瓶的杂志适配器，并包括一个注水管的指南。
将 Arduino 的接地（GND 引脚之一）连接到带有杜邦线鳄鱼的模块化腔室。我们发现它可以防止错误的电容式触摸信号。
直接通过其库调整传感器的灵敏度（参见“MPR121 Adafruit Doc”PDF 文件，第 15 页； https://github.com/YuYuB/Bio-Protocol-ConditionedLickSuppression ）。
用塑料或丙烯酸板盖住杂志的顶部，以防止从调理室逃脱。
使用白色塑料板覆盖杂志的较高部分（参见图 5），以防止老鼠逃到上下文 B 的三角形天花板的顶部。

致谢

这项工作得到了授予 YO 的 JSPS KAKENHI 赠款（编号：JP18K07545、JP19H04976 和 JP21K07473）和授予 YB 的 JSPS KAKENHI 赠款（编号：JP19K23377）的支持。 (2022)。我们感谢Nebuka博士、 Sasamori博士、 Sugiura女士、Sato 博士和 Yoshioka 教授对Bouchekioua等人研究的支持。 (2022)，当前的协议就是从中派生出来的。我们还感谢 QC Makerspace 负责人 Nick Normal 提供了 3D 打印机的访问权限。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

Bouchekioua等人使用的动物治疗。 (2022) 遵守北海道大学动物研究委员会实验动物护理和使用指南，所有程序均经北海道大学动物研究委员会批准（批准号 18-0070）。

参考

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Bouchekioua , Y.、 Nebuka , M.、 Sasamori , H.、 Nishitani , N.、 Sugiura , C.、Sato, M.、Yoshioka, M. 和 Ohmura, Y. (2022)。小鼠血清素 5-HT2C 受体敲除减弱了情境或线索中的恐惧反应，但不是复合情境线索恐惧条件反射。转化精神病学12(1)：58。
Browne, CJ、Ji, X.、Higgins, GA、Fletcher, PJ 和 Harvey-Lewis, C.（2017 年）。 5-HT2C 受体活性的药理学调节在 C57BL/6 小鼠中产生运动活性的双向变化、对条件强化剂和中脑边缘 DA 释放的反应。神经精神药理学42(11)：2178-2187。
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