材料和试剂

A. 培养细胞系

1. 10 厘米组织培养皿（ Sarstedt ，目录号：83.3902）
2. 6 孔细胞培养板（ Sarstedt ，目录号：83.3920.005）
3. 细胞计数载玻片（双室）（Bio-Rad，目录号： 1450015）
4. 0.45 µm 过滤器（Whatman，目录号：10462100）
5. 海拉翻转输入 TRex细胞系（Invitrogen，目录号：R71407）
注意：此协议是为 HeLa FlpIn建立的 TRex细胞系。它可以转移到适合显微镜的其他细胞系。
6. HEK 293T 细胞（人胚肾 293T）（ATCC，目录号：CRL-3216）
7. RPMI 1640 培养基（+L-谷氨酰胺）（ Thermo Fisher Scientific，目录号：21875-034）
8. DMEM 培养基（+L-谷氨酰胺）（ Thermo Fisher Scientific，目录号 41966029)
9. 胎牛血清（FBS）（ Thermo Fisher Scientific，目录号：10270-106）
10. 胰蛋白酶-EDTA（0.25%）、酚红（ Thermo Fisher Scientific，目录号：25200056）
11. Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（ Thermo Fisher Scientific，目录号：14190-169）
12. 台盼蓝溶液（Sigma-Aldrich，目录号：T8154）

B. 稳定和可诱导的 MTS- eGFP细胞系生成

1. 15 mL 管（Greiner，目录号：188271-N）
2. Lipofectamine 2000 转染试剂（ Thermo Fisher Scientific，目录号：11668027）
3. 嘌呤霉素（ InvivoGen ，目录号：ant-pr-1）
4. Opti-MEM I（ Thermo Fisher Scientific，目录号：31985-047）
5. 聚凝胺（Sigma-Aldrich，目录号：TR-1003-G）
6. pHDM -VSV-G（ Addgene ，目录号：164440）；编码VSV-G蛋白
7. pHDM-Hgpm2（ Addgene ，目录号：164441）；编码密码子优化的 HIV gag-pol
8. pHDM-tatIB （ Addgene ，目录号：164442）；编码 HIV-1 Tat 辅助蛋白
9. pRC -CMV- revIB （ Addgene ，目录号：164443）；编码 HIV-1 Rev 辅助蛋白
10. pLD -puro-MTS-EGFP（ Addgene ，目录号：190270）；包含四环素/多西环素诱导型 MTS- eGFP和慢病毒包装信号

C. MTS- eGFP线粒体导入分析

1. 细胞培养微孔板，96 孔，黑色（Greiner，目录号：655090）
2. MitoTracker TM深红 FM（ Thermo Fisher Scientific，目录号：M22426）
3. 多西环素（0.25 µg/mL 原液，无RNAse H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：D9891-10G）
4. 羰基氰 3-氯苯腙（CCCP）（Sigma-Aldrich，目录号：C2759）
注意：CCCP 吞咽有毒。处理后避免皮肤接触并彻底洗手。
5. 用于细胞培养的二甲基亚砜（DMSO）（VWR，目录号：A3672.0100）
6. 伽米替尼-三苯基磷(GTPP)（定制合成）

设备

1. -80 °C 冰箱（Ewald，目录号：V86-520.1）
2. TC20 自动细胞计数器（Bio-Rad，目录号：1450102）
3. 倍的活细胞显微镜（488 nm、640 nm 激光）
4. eGFP （CQ-1，Yokogawa）的发射滤光片 525/50 nm
5. MitoTracker TM Deep Red FM (CQ-1, Yokogawa)发射滤光片 685/40 nm
6. 哺乳动物细胞培养箱（ Thermo Fisher Scientific，目录号：16416639）

软件

1. ImageJ（美国国立卫生研究院，版本：1.53e）

程序

A. 生成稳定且可诱导的 MTS- eGFP细胞系

注意：A 部分中描述的所有步骤都必须在批准用于慢病毒工作的实验室中进行。
1. 3.5 × 10 6 个HEK 293T 细胞，以在第二天获得 80% 的汇合密度。
2. 播种后第二天用 9 mL 预热 DMEM (v/v) 1% FBS 交换介质。
3. pHDM -VSV-G（比例：2、0.4 µg）、pHDM-Hgpm2（比例：1、0.2 µg）、 pHDM-tatIB （比例：1 ）的相应比例（ 10 厘米培养皿的总 DNA 为5微克）混合, 0.2 µg), pRC -CMV- revIB (比率: 1, 0.2 µg), 和pLD -puro-MTS-EGFP (比率: 20, 4 µg) 与 500 µL Opti-MEM I 在管号 1。
4. 将 15 μL 的 lipofectamine 2000 转染试剂与 500 μL 的 Opti-MEM I 在管号 2 中混合。
注意：可以使用其他转染试剂代替 Lipofectamine 2000。
5. 将 1 号管中的 DNA 混合物加入到 2 号管中，混匀，室温孵育 10 分钟。
6. 以逐滴方式将混合物添加到细胞中，使其总量达到 10 mL。
7. 6 小时后，用 10 mL 预热 DMEM（v/v）10% FBS 交换介质。
8. 48 小时后通过收集介质收获慢病毒颗粒。
9. x g旋转收集的上清液3 分钟，以沉淀转移的 HEK 293T 细胞。将含有慢病毒颗粒的上清液转移到新管中。
注意：或者，0.45 µm 过滤器可用于去除转移的 HEK 293T 细胞。
10. 将含有上清液的慢病毒颗粒在 4°C 下储存长达一周，或在-80°C 下储存更长时间。
11. 种子 2 × 10 6 HeLa FlpIn 含有 RPMI (v/v) 10% FBS 培养基的 10 cm 组织培养皿中的TRex细胞在第二天获得 60% 汇合的密度。
12. 加入0.8-1 mL 含有慢病毒颗粒的上清液（最终浓度为 8 µg/mL）。
注意：在加入含有慢病毒颗粒的上清液之前不要去除培养基。此外，没有必要确定上清液中慢病毒颗粒的浓度。
13. 用慢病毒颗粒孵育细胞 48 小时。
注意：如果细胞出现应激迹象，则在孵育期间将培养基更换为新鲜、预热的 RPMI (v/v) 10% FBS 培养基。
14. 开始选择慢病毒感染的 HeLa FlpIn TRex细胞通过嘌呤霉素添加（最终浓度为 1 µg/mL）到 RPMI（v/v）10% FBS 培养基，转导后 48 小时。
15. 选择慢病毒感染的细胞总共 11 天，并在 RPMI（v/v）10% FBS 培养基中至少选择三个通道，其中含有 1 μg/mL 嘌呤霉素。
注：生成的细胞系稳定，可在-80 °C 下冷冻于含 10% DMSO (v/v) 的 RPMI (v/v) 10% FBS 培养基中，并在≤-150 °C 下储存。完成嘌呤霉素筛选 11 天后，可以在常规 RPMI (v/v) 10% FBS 培养基中培养细胞。

B. 细胞接种

1. FlpIn的 10 cm 组织培养皿中吸取培养基携带基因组整合的 MTS-eGFP 报告基因的 TRex 细胞在RPMI ( v /v) 10% FBS 中以 60% – 80% 的汇合度生长。
注意：此步骤是使用上一步中获得的细胞执行的，即在嘌呤霉素选择 11 天后。
2. 用 5 mL 室温 PBS 清洗细胞层一次并吸出。
3. 在细胞层中加入 1 mL 的 0.25% 胰蛋白酶，并在培养箱中孵育板 5 分钟。
4. 添加 9 mL 的 RPMI (v/v) 10% FBS 以停止胰蛋白酶反应，并通过反复上下移液来重新悬浮细胞。
5. x g离心3 分钟来收集颗粒细胞。
6. 通过反复上下移液，在 5 mL 的 RPMI（v/v）10% FBS 中吸出上清液并重新悬浮细胞。
7. 将 5 μL 的细胞悬浮液转移到 1.5 mL 管中，并与 5 μL 的台盼蓝溶液混合。
8. 将 8.5 μL 的染色细胞悬浮液转移到计数幻灯片并计数活细胞。
9. 在 RPMI (v/v) 10% FBS 中的黑色 96 孔细胞培养微孔板中每孔接种10 – 20,000 个活细胞，并在培养箱中过夜培养细胞。

C. 处理、诱导 MTS- eGFP表达和线粒体染色

1. 制备含有适当浓度化合物或车辆的处理溶液和 0.25 µg/mL 多西环素，以在预热 RPMI (v/v) 10% FBS中诱导 MTS- eGFP表达。
注意：根据Moullan等人的说法。 (2015)，使用的多西环素浓度不应影响 HeLa 细胞的线粒体功能。
2. 通过吸出生长培养基并将处理培养基添加到 96 孔板中的细胞中，开始治疗和多西环素诱导。
注意：该协议使用 10 µM CCCP（一种线粒体解偶联剂）和 10 µM GTPP（一种线粒体伴侣抑制剂）进行了 6 小时的治疗测试，这两种方法都能迅速减少线粒体蛋白的输入，并可用作阳性对照（Michaelis 等人。 , 2022). DMSO 用作载体对照。
3. 治疗期间在培养箱中孵育细胞。
4. nM染色细胞 MitoTracker TM Deep Red FM在预热的 RPMI (v/v) 10% FBS 培养箱中孵育 20 分钟。
5. 吸出培养基，用 PBS 清洗细胞一次，然后添加新鲜的 RPMI (v/v) 10% FBS。

D. 活细胞成像

1. 将带有细胞的 96 孔板转移到预平衡至 37 °C、5% CO 2的横河电机 CQ-1 显微镜室。
2. 采集eGFP （488 nm 激发，525/50 nm 发射）和MitoTracker TM Deep Red FM （640 nm 激发，685/40 nm 发射）的活细胞图像，每次复制至少 100 个细胞，放大倍数为 60 倍，自动对焦（示例图片如图1)所示。
笔记：
a. 调整激光功率和曝光时间（最大 500毫秒）以获得非饱和图像。
b. 建议获取 z 堆栈以获得每个视场尽可能多的细胞的聚焦图像。 Z 堆栈通常是在中心焦点周围3 – 5 µm 半径范围内使用 6 – 10 张幻灯片获取的。

图1。 MTS- eGFP和MitoTracker TM Deep Red FM 在 DMSO 和 CCCP 处理后的活细胞图像。海拉翻转输入携带 MTS- eGFP的TRex细胞用多西环素和 10 µM CCCP 或1 µL/mL DMSO 作为载体对照处理 6 小时（左）。比例尺代表 25 µm。显示了使用 ImageJ Coloc2 进行的基于相关性的共定位分析的结果（右）。

数据分析

1. 使用 ImageJ（Schneider等人，2012 年）和已实施的 Coloc2 插件进行共定位分析。
2. 在 ImageJ 中打开相同视野的eGFP和MitoTracker TM Deep Red FM图像，然后启动 Coloc2，然后执行分析 - 共定位 - Coloc2。
3. 在通道 1 和通道 2 中选择要分析的图像；在 Coloc2 选择窗口中选择二分作为阈值回归和Manders的相关性（图 2）。
注意： Coloc2 还计算 Pearson 系数，这是基于另一种基于相关性的共定位方法。 Pearson 的系数范围为 -1 到 +1， Manders的系数范围为 0 到 1 。这些值与共定位的置信度相关。出于可视化目的，使用 ImageJ 中的背景减法功能对单个图像文件执行背景减法，并将图像的亮度调整为可比较的强度（图 3）。

图 2. Coloc2 选择窗口。在通道 1 和 2 中选择用于共定位分析的图像。显示用于共定位分析的参数。

图 3. 在 ImageJ 中通过背景减除、亮度和对比度调整进行图像调整。此图演示了如何访问已实现的功能以进行图形准备。

注意事项

该测定还可以与 siRNA 敲低结合使用。为此，在 siRNA 转染 2-4 天后，多西环素处理会诱导MTS- eGFP表达。

致谢

MTS- eGFP蛋白导入分析改编自 Chen等人。 (2003)。质粒慢病毒目的地 ( pLD ) 是按照Mak之前的描述建立的等。（2010）。 CM 感谢 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 1177（子项目 D08）项目 ID 259130777、Emmy Noether的支持计划项目 ID 390339347、DFG 卓越战略计划（ Exc 2026）和欧洲研究委员会 (ERC) 启动拨款 803565。该协议是作为以下研究论文的一部分建立的：Schafer 等。 (2022) 和 Michaelis 等人。 (2022)。图形摘要是使用 BioRender.com 创建的。

利益争夺

作者声明他们没有竞争利益。

参考

Chen, H.、 Detmer , SA、Ewald, AJ、Griffin, EE、Fraser, SE 和 Chan, DC (2003)。 Mitofusins Mfn1 和 Mfn2 协调调节线粒体融合，对胚胎发育至关重要。细胞生物学杂志 160(2)：189-200。
Dimogkioka , AR, Lees, J., Lacko , E. 和Tokatlidis , K. (2021)。线粒体生物发生中的蛋白质导入：由靶向信号引导并由专门的伴侣维持。 RSC Adv 11(51)：32476-32493。
Geissler, A.、Krimmer, T.、Bomer, U.、Guiard, B.、Rassow, J. 和 Pfanner, N. (2000)。膜电位驱动的蛋白质导入线粒体。细胞色素 b(2) 的排序序列调节基质靶向序列易位的 deltapsi 依赖性。分子生物学细胞11(11)：3977-3991。
Mak , AB, Ni, Z., Hewel , JA, Chen, GI, Zhong, G., Karamboulas , K., Blakely, K., Smiley, S., Marcon, E., Roudeva , D., 等人。（2010）。慢病毒功能蛋白质组学方法确定了对诱导多能性很重要的染色质重塑复合物。摩尔细胞蛋白质组学9(5)：811-823。
Michaelis, JB、Brunstein, ME、Bozkurt, S.、Alves, L.、Wegner, M.、Kaulich, M.、Pohl, C. 和 Munch, C.（2022 年）。蛋白质输入运动复合物通过减少蛋白质输入和激活线粒体自噬对线粒体错误折叠作出反应。 Nat Commun 13(1)：5164。
Moullan , N., Mouchiroud , L., Wang, X., Ryu, D., Williams, EG, Mottis , A., Jovaisaite , V., Frochaux , MV, Quiros , PM, Deplancke , B., 等。 (2015)。四环素干扰真核模型中的线粒体功能：生物医学研究中的谨慎呼吁。细胞代表10(10)：1681-1691。
Murschall, LM、Peker, E.、MacVicar, T.、Langer, T. 和 Riemer, J.（2021 年）。从人体细胞中分离出的线粒体中的蛋白质导入测定。生物协议11(12)：e4057。
Palmer, CS、Anderson, AJ 和Stojanovski , D. (2021)。线粒体蛋白输入功能障碍：线粒体疾病、神经退行性疾病和癌症。 FEBS 快报595(8)：1107-1131。
Poveda- Huertes , D.、Taskin, AA、 Dhaouadi , I.、 Myketin , L.、 Marada , A.、 Habernig , L.、 Buttner , S. 和 Vogtle, FN (2021)。早期 mtUPR 增加线粒体蛋白输入和心磷脂重塑。 PLoS Genet 17(7)：e1009664。
Schafer, JA、Bozkurt, S.、Michaelis, JB、Klann, K. 和 Munch, C. (2022)。全球线粒体蛋白质导入蛋白质组学揭示了翻译和易位机制的不同调节。分子细胞82(2)：435-446 e437。
Schmidt, O.、Pfanner, N. 和 Meisinger, C. (2010)。线粒体蛋白导入：从蛋白质组学到功能机制。 Nat Rev Mol 细胞生物学11(9)：655-667。
Schneider, CA, Rasband , WS 和Eliceiri , KW (2012)。 NIH Image to ImageJ：25 年的图像分析。国家方法9(7)：671-675。