材料和试剂
1.窄果蝇小瓶（Genesee Scientific，目录号： 32-116SB）
2.Flugs ® 窄塑料瓶（Genesee Scientific，目录号：4 9-102）
3.方底果蝇瓶（ Genesee Scientific，目录号：32-130）
4.Flugs ® 塑料飞瓶（Genesee Scientific，目录号：4 9-100）
5.圆形合成画笔（Lowell hillcrest，尺寸 4/0 或 3/0）
6.Kimtech TM science kimwipes（Kimberly-Clark Professional，目录号： 34155，4.4” × 8.4”）
7.粗棉布（Genesee Scientific，目录号：53 -100）
8.宿主培养物：黑腹果蝇的幼虫和蛹（Canton S 菌株，布卢明顿股票中心）
9.寄生蜂幼虫： Leptopilina boulardi （Lb17 株）或L. heterotoma （Lh14 株）（从亚利桑那大学的 Todd Schlenke 实验室获得）
10.蛹寄生蜂： Trichopria drosophilae （Trical 品系）（来自Todd Schlenke 的实验室）
11.未经过滤的生蜂蜜（Nature Nate's Honey Co.）
12.工业级二氧化碳 (CO 2 )（Airgas，Air Liquide 公司）
13.用水稀释的 Wescodyne® Plus 的玻璃烧杯和塑料漏斗）
14.乙醇，70%，实验室级
15.果蝇培养基（玉米面糖蜜酵母培养基）（见食谱）
a.石花菜琼脂（MoorAgar，目录号：41076）
b.酵母（Lesaffre 的 Phileo，目录号：73050 SafPro Relax+YF）
c.玉米（MP Biomedicals，目录号：0290141180）
d.糖蜜（Reinhart Foodservice，目录号：DW816）
e.丙酸（Fisher Scientific，目录号：A258-500）
f.4-氢苯甲酸甲酯（NIPAGIN）（Sigma-Aldrich，目录号：H5501）

设备
1.立体显微镜（蔡司，型号：Stemi 2000）
2.光纤光源（Fisher Scientific，型号：Laxco TM PIFOS150IB）
3.具有受控温度 (25 °C ) 、湿度 (60%) 和 12:12 小时光/暗循环的培养箱（Percival Scientific，型号：DR41VL）
4.具有受控温度 (25 °C ) 、湿度 (60%) 和 12:12 小时光/暗循环的飞行室
5.飞垫， CO 2麻醉装置（Genesee Scientific，目录号：59-119）

软件
1.Prism 9（GraphPad Software, LLC，加利福尼亚州圣地亚哥， https://www.graphpad.com ）
2.OriginPro（OriginLab Corporation，马萨诸塞州北安普敦， https: //www.originlab.com ）
3.生物渲染器（BioRender， https://biorender.com ）

程序
第一部分：培养寄生蜂（图 1）

图 1. 实验室条件下寄生蜂培养的流程图

A.宿主小瓶的准备

1.在实验室中，在含有标准玉米面糖蜜酵母培养基（见食谱）的塑料飞瓶中培养野生型果蝇（菌株 Canton S）并保持在 12:12 小时光照/黑暗循环控制的培养箱中，温度为 25°C 和 60% 相对湿度，除非另有说明。
2.为避免过度拥挤和库存维护，在产卵四天后将亲蝇（P0，大约 25 只雌性和 10 只雄性）转移到新鲜的蝇瓶中。
3.在25°C 时，成年果蝇后代 (F1) 在 9-10 天内开始从培养瓶中的蛹壳中脱落。
4.用CO 2麻醉一瓶 F1 成年果蝇（最好是 3-10 天大的），然后将果蝇放在蝇垫上。
5.使用显微镜和画笔，将麻醉的 F1 成人（15 名女性和 8 名男性）转移到装有新鲜苍蝇食物的小瓶（称为宿主小瓶）中，并让苍蝇在25°C 下产卵三天（图 2C） –左）。
6.三天后，要么将 F1 成人从宿主瓶中丢弃到苍蝇太平间，要么将 F1 成人转移到新鲜食物瓶中以准备新的宿主瓶。

B.培养幼虫寄生蜂

1.在果蝇产卵三天并从宿主瓶中取出 F1 成虫后，将 3-4 滴蜂蜜按 1:1 稀释在宿主瓶塞内侧的蒸馏水中，作为果蝇的食物来源成年黄蜂。
2.使用 CO 2 ，麻醉 5–10 天大的成年幼虫寄生蜂——Leptopilina boulardi (Lb17) 或Leptopilina heterotoma (Lh14) ——并对雄性和雌性寄生蜂进行分类（图 2A 和 2B）。识别雌性和雄性Leptopilina相对容易：雄性寄生蜂的触角比雌性更长，身体更小。此外，在腹部的后腹侧，雌性黄蜂有一个特殊的针状结构，即产卵器，它们将其插入宿主体内以产卵。
3.轻轻地将成年拟寄生物（12 只雌性和 8 只雄性）转移到含有发育中的果蝇幼虫的宿主小瓶中。
4.放置补充蜂蜜的塞子并将宿主小瓶（称为感染小瓶）放在一边，直到寄生蜂从 CO 2中恢复过来曝光（图 2C -右）。否则，麻醉的黄蜂可能会掉入直立小瓶中的湿/湿食物中，随后在醒来时无法自拔。
5.在飞行室或具有受控条件的孵化器中维护黄蜂感染的小瓶，直到成年寄生虫出现（图 2D）。

图 2. 寄生蜂幼虫–受感染的宿主小瓶。雌性（左）和雄性（右）幼虫寄生蜂的图像：(A) L. boulardi (Lb17) 和 (B) L. heterotoma (Lh14)。 (C) 新鲜准备的用于产卵的宿主小瓶的图像（左）和L. boulardi –包含发育中的幼虫阶段的感染宿主小瓶（右）。 (D) L. boulardi的图像——感染小瓶，在果蝇蛹的情况下，黄蜂发育的早期（左）和晚期（右）阶段。请注意逃脱寄生物攻击或抑制感染的成年果蝇（左）和受感染小瓶中新出现的黄蜂（右）。

C.培养蛹寄生蜂
1.产卵三天后，将成年 F1 苍蝇从宿主瓶中丢弃或转移到新的食物瓶中。让幼虫阶段在25°C 的宿主瓶中发育约 3-4 天。
2.当第三龄幼虫在宿主小瓶中开始化蛹（前蛹）时，取下塞子并加入3-4 滴用蒸馏水稀释的蜂蜜。
3.麻醉 5-10 天大的成虫蛹寄生蜂 [果蝇毛滴虫(Trical)] 使用 CO 2并在飞垫上对雄性和雌性寄生蜂进行分类。与Leptopilina一样，Trical 雄性也比雌性具有更长的触角和更小的身体（图 3A）。
4.类似于幼虫寄生虫感染，小心地将 Trical 黄蜂（12 只雌性和 8 只雄性）转移到含有果蝇预蛹和发育幼虫阶段的宿主小瓶中。
5.用补充蜂蜜的塞子盖住新感染的宿主小瓶，并将小瓶放在一边。
6.寄生蜂从 CO 2暴露中醒来后，将小瓶垂直放置，并将感染黄蜂的小瓶放置在苍蝇室或条件受控的培养箱中（图 3B）。

图 3. 蛹寄生虫感染的宿主小瓶。 (A) T. drosophilae雌性（左）和雄性（右）蛹寄生蜂和 (B) 寄生虫感染小瓶的图像，在蝇蛹案例中具有早期（左）和晚期（右）发育阶段。请注意用于感染蝇蛹的黄蜂（左）和受感染小瓶中新出现的黄蜂（右）。

D.收集和维护寄生蜂
1.Leptopilina雌性感染发育中的Drosophila幼虫阶段，而Trichopria雌性攻击果蝇蛹以产卵（Small 等人，2012 年）。成功的寄生虫感染会抑制宿主的免疫反应并延缓果蝇的发育。因此，寄生蜂卵孵化、发育和蜕皮，成年黄蜂从果蝇蛹壳中出现。根据寄生蜂种类和环境条件（温度和湿度），成年黄蜂在感染后 25-30 天封闭。
2.或者，如果宿主的免疫反应包裹寄生蜂卵，它会阻止黄蜂卵的发育，果蝇成虫就会正常出现（Carton 和 Nappi，1997）。
3.当寄生虫卵在宿主小瓶中发育时，成功抵御寄生虫感染或逃脱黄蜂攻击的果蝇后代在黄蜂出现之前就封闭了（见图 2D）。将这些成年果蝇丢弃到苍蝇太平间。
4.为了收集和维护成年寄生蜂，准备一个培养瓶，将折叠的 Kimwipe 片插入新鲜的苍蝇食品瓶中，以吸收多余的水分，并用稀释的蜂蜜补充插头。麻醉飞垫上受感染小瓶中出现的黄蜂，然后轻轻地将它们（大约 50 只黄蜂/小瓶）放入培养瓶中（图 4）。
5.每 4-5 天重复一次上述步骤，从受感染的小瓶中收集新出现的黄蜂，并将培养瓶保持在室温下。然后，收集的黄蜂用于实验（见下文）并通过感染宿主小瓶（图 2C 和 3B）开始新的黄蜂培养。
6.为避免成年寄生蜂因苍蝇食物变质、插头逐渐干燥或小瓶中水分积累而死亡，请根据需要将黄蜂转移到新鲜培养瓶中。

图 4.寄生虫培养瓶。新出现的图像男性和女性 L. boulardi （左）和T. drosophilae （右）从分别感染的宿主小瓶中收集的拟寄生物。

笔记
1.由于寄生蜂对 CO 2麻醉很敏感，因此我们建议使用比果蝇更低的 CO 2压力（大约 10 psi，取决于蝇垫和 CO 2站的设置），并避免长时间暴露在 CO 2中。另外，轻轻地处理黄蜂。
2.在将其用于寄生宿主之前，雌性黄蜂的交配至关重要。因此，允许新收集的雄性和雌性黄蜂在感染前在培养瓶中同居对于产生受精黄蜂卵很重要（图 4）。寄生蜂遵循单倍二倍体性别决定：雄性由未受精卵发育而成，为单倍体，而雌性由受精卵发育而成，为二倍体。在感染前留出时间进行黄蜂交配和卵子受精，可确保下一代黄蜂中有适当的雌性比例。这样，感染期间宿主小瓶中雌性与雄性拟寄生物的比例就不那么重要了。
3.如上所述，寄生蜂的存在会引发果蝇的各种行为和生理改变（Kacsoh 等人，2013 年；Robertson 等人，2013 年；Ebrahim 等人，2015 年；Kacsoh 等人，2015 年；Ebrahim 等人，2021 年；Sadanandappa 等人，2021 年）。因此，我们建议通过在不同位置维持黄蜂和果蝇培养物并使用专门的 CO 2站和处理黄蜂的材料来限制接触。否则，在黄蜂处理后用 70% 乙醇彻底清洁飞行站。

第二部分：果蝇产卵试验

A.培养实验种群

1.如前所述，在25°C 和 60% 相对湿度下，在 12:12小时光/暗循环控制的孵化器中培养所有实验性飞线。
2.为了实现苍蝇的年龄同步以进行行为分析，将所有成年苍蝇丢弃到苍蝇太平间，并在清除后 12 小时内将新封闭的苍蝇（男性和女性）收集到新鲜的苍蝇瓶中（大约 50 只苍蝇/瓶）。避免从旧的、拥挤的或受真菌感染的瓶子中收集实验性苍蝇。
3.维护这些装有 0-12 小时龄果蝇的瓶子，然后老化 5 天，然后再进行飞到生殖试验。

B.进行产卵试验
1.使用微波炉（大约 30–45 秒），将食物液化在新鲜的果蝇瓶中，并立即将大约 1 mL 的介质倒入空的果蝇窄小瓶（称为产卵瓶）中。
2.为避免流浪苍蝇进入产卵小瓶并在食物凝固时积聚水蒸气，请用粗棉布盖住小瓶口。将装有产卵瓶的托盘在室温下放置 30–60 分钟。
3.当苍蝇培养基凝固时，取下粗棉布并将新塞子放入小瓶中。
4.使用 CO 2 ，从培养瓶中麻醉成年寄生蜂（推荐年龄：4-7 天）。使用画笔，将三只雌性Leptopilina或Trical寄生蜂轻轻放入产卵瓶中，并将它们放在一边。
5.麻醉所有年龄（5-6 天）和基因型匹配的果蝇（Canton S），并将五只雌性和两只雄性苍蝇转移到含有寄生虫（黄蜂暴露的小瓶）的产卵小瓶中。
6.要准备模拟小瓶（未暴露的控制），请按照上述步骤操作，除了引入拟寄生物。
7.当所有苍蝇从麻醉中恢复过来时，将黄蜂暴露和模拟小瓶放在不同的飞行架上，并在25°C、60% 湿度和 12:12 小时光照/黑暗循环的培养箱中不受干扰地放置它们。
8.24 小时后，将所有苍蝇（包括黄蜂）丢弃到苍蝇太平间，并使用立体显微镜手动记录每个小瓶中产卵的总数（图 5A 和 5B）。果蝇卵长约 0.5 毫米，呈卵形，前侧有背附器（图 5C）。
9.与未暴露的模拟对照（图 5A）相比，暴露24 小时的L. boulardi （图 5B）雌性果蝇的平均产卵量减少（图 6）（Sadanandappa 等人，2021 年）。
10.这种行为分析可以很容易地适应于研究环境——营养、温度、日光、感染等——或遗传对种系发育的影响(Kurz et al., 2017) 。通过将实验果蝇转移到新鲜的小瓶中，持续的产卵试验表明这些因素对产卵和繁殖行为的长期影响（Pang 等人，2022 年）。

果蝇产卵试验。代表性图像显示在 ( A ) 模拟和 (B) L. boulardi (Lb17) 寄生虫中 24 小时的产卵-暴露的小瓶。图片改编自Sadanandappa 等人。（2021 年， PLOS Genet ）在 CC BY 4.0 下。 (C)果蝇卵示意图。

笔记

1.在设置行为实验时，避免将模拟苍蝇暴露于黄蜂暴露组并限制长时间暴露于CO 2中，因为它会影响果蝇雌性的产卵。
2.从装有死苍蝇/黄蜂的小瓶中排除产卵文件。
3.为避免偏差，我们建议在记录之前对产卵瓶进行双盲，然后在计数后解码卵数数据。
4.用于暴露实验的寄生蜂没有被给予任何宿主进行感染，并且在测定后再也没有使用过。
5.以前的研究表明，果蝇成虫对雌性和雄性寄生蜂的反应不同。因此，我们在此协议中仅使用雌性拟寄生物。

数据分析

1.环境条件（飞行介质、温度、湿度、营养、过度拥挤）、感染和遗传背景的任何细微变化都可能影响产卵试验。我们建议每次复制至少 3-5个实验组以及未暴露的基因型对照，以确保再现性和准确性。
2.使用 Prism 或 OriginPro 软件，未暴露的对照和寄生蜂暴露的雌性产卵的平均数量可以绘制为柱状图，标准误差平均值是从至少三个独立实验计算得出的（图 6）。
3.执行双尾未配对t检验，以确定各组产卵方式之间的统计显着性。

果蝇产卵减少。直方图显示未暴露（浅灰色）和 Lb17 寄生蜂暴露（深灰色）野生型Canton S果蝇的 24 小时产卵百分比。产卵反应表示为模拟产卵的百分比，误差条为±标准误差平均值（N = 35，三个独立实验）。 ** p = 0.0098，使用双尾非配对t检验和 Welch 校正计算。

食谱

1.玉米面糖蜜酵母培养基
试剂终浓度数量
琼脂1%10克
棒子面7.6%76 克
糖蜜7.6%76 克
酵母5%50克
DDH 2 O不适用1 公升
全部的不适用1 公升

将苍蝇培养基煮至沸腾，然后冷却至 60 °C 以下，然后再加入 NIPAGIN（0.4%）和丙酸（0.2%）。
让瓶子或小瓶中的食物在室温下过夜干燥，盖上无菌粗棉布，然后用干净的塞子盖上。
苍蝇食物可以在 4 °C 至 18 °C 的冷藏室或冰箱中储存长达一周。在引入苍蝇之前，应将培养瓶和培养瓶置于室温且无冷凝。

致谢

该项目得到了 MKS 人类前沿科学计划长期奖学金和美国国立卫生研究院先驱赠款 1DP1MH110234 和国防高级研究计划局向 GB 赠款 HR0011-15-1-0002 的支持，我们感谢 Todd Schlenke（University of Arizona) 提供了黄蜂品系，我们的实验室技术员 Victoria L. Marlar 提供了所有帮助。该协议改编自 Small 等人。 (2012) 和 Sadanandappa 等人。 (2021)。 BioRender.com 用于制作图形。

利益争夺

这项工作的作者没有要声明的利益冲突。

参考

Carton, Y. 和 Nappi, AJ (1997)。果蝇对寄生物的细胞免疫。 Parasitol Today 13(6)：218 - 227。
Ebrahim, SAM, Dweck, HKM, Stökl, J., Hofferberth, JE, Trona, F., Weniger, K., Rybak, J., Seki, Y., Stensmyr, MC, Sachse, S., 等。 (2015)。果蝇通过专用的嗅觉回路感知其化学信息来避免寄生蜂。公共科学图书馆生物学13(12)：e1002318。
Ebrahim, SAM, Talross, GJS 和 Carlson, JR (2021)。看到寄生蜂会加速性行为并上调果蝇中的微肽基因。 Nat Commun 12(1)：2453。
Fleury, F.、Ris, N.、Allemand, R.、Fouillet, P.、Carton, Y. 和 Boulétreau, M.（2004 年）。果蝇- 拟寄生物群落中的生态和遗传相互作用： D的案例研究。黑腹果蝇， D . simulans和它们在法国东南部常见的Leptopilina寄生蜂。遗传学120(1-3)：181 - 194。
Hwang, RY、Zhong, L.、Xu, Y.、Johnson, T.、Zhang, F.、Deisseroth, K. 和 Tracey, WD (2007)。伤害性神经元保护果蝇幼虫免受寄生蜂的侵害。当前生物学17(24)：2105 - 2116。
Kacsoh, BZ、Lynch, ZR、Mortimer, NT 和 Schlenke, TA (2013)。果蝇在看到寄生虫后给后代用药。科学339(6122)：947 - 950。
Kacsoh, BZ、Bozler, J.、Ramaswami, M. 和 Bosco, G.（2015 年）。捕食者引起的果蝇行为和种系生理学变化的社会交流。 e生活4：e07423。
Kurz, CL、Charroux, B.、Chaduli, D.、Viallat-Lieutaud, A. 和 Royet, J.（2017 年）。章鱼胺能神经元对肽聚糖的感知调节果蝇产卵。 e生活6：e21937。
Lynch, ZR、Schlenke, TA 和 de Roode, JC (2016)。果蝇对寄生蜂的行为和细胞防御的进化黑腹亚群。 J Evol Biol 29(5): 1016-1029。
Pang, L., Liu, Z., Chen, J., Dong, Z., Zhou, S., Zhang, Q., Lu, Y., Sheng, Y., Chen, X. 和 Huang, J.（ 2022 年）。搜索性能和章鱼胺神经元信号介导寄生蜂诱导果蝇产卵行为的变化。 Nat Commun 13(1)：4476。
Robertson, JL、Tsubouchi, A. 和 Tracey, WD (2013)。幼虫抵御寄生蜂的攻击需要伤害性神经元。 PLoS 一8(10)：e78704。
Sadanandappa, MK、Sathyanarayana, SH、Kondo, S. 和 Bosco, G.（2021 年）。神经肽 F 信号调节果蝇寄生蜂特异性种系发育和产卵。 PLOS 基因组 17(3)：e1009456。
Small, C.、Paddibhatla, I.、Rajwani, R. 和 Govind, S. (2012)。果蝇寄生蜂及其抗寄生虫免疫反应介绍。 J Vis Exp (63)：e3347。
B. 沃特海姆 (2022)。果蝇宿主-寄生蜂相互作用的适应和反适应：分子机制的进展。 Curr Opin Insect Sci 51：100896。