材料和试剂

A. 植物栽培

1. 1.5 mL Eppendorf 管（Sarstedt，目录号：72.708）
2. 12 N 或 37% 盐酸（Carlo Erba，目录号：524526）
3. 1.5 mL Eppendorf 管架（Ratiolab 纸板网格，冷冻箱插入物，目录号：5020147）
4. 拟南芥幼苗的方形塑料培养板，垂直培养（VWR，目录号：391-0444）
5. 漂白剂（Orapi Europe，目录号：OR0011）
6. Murashige 和 Skoog（MS）培养基 + 维生素（Duchefa Biochemie，目录号：M0222.0050）用于幼苗
7. 用于育苗和嫁接的植物琼脂（Duchefa Biochemie，目录号：P1001.1000）
8. Anapore 胶带（Euromedis，目录号：135320）用于密封培养板
9. 氢氧化钾
10. 用于种子灭菌的漂白剂溶液（配方 1）
11. 用于育苗和嫁接的培养基（配方2）
a. 幼苗用半强度 MS 培养基
b. 嫁接用水介质

B. 转基因品系

对于嫁接实验，我们使用了 35S::HDEL_mRFP 和 35S::HDEL_YFP 系，它们具有强烈的荧光表达（Nelson 等人，2007 年；Lee 等人，2013 年）。两条线都显示了一个荧光信号，该信号很容易通过带有变焦显微镜的目镜看到，该显微镜具有中等预设水平的激发功率和适配的滤光片。

C. 植物嫁接

1. 圆形培养皿，90 × 14.2 mm，用于嫁接（通常用于细菌培养）（VWR，目录号 391-0439）
2. 中性尼龙膜 hybond-N（GE Healthcare，目录号：RPN 203 N）
3. 石蜡膜（Bemis，Parafilm 'M'）切成约 1 厘米宽的条状以密封培养皿

D. 高压冷冻 (HPF)

1. 螺旋盖 2 mL 管（Sarstedt，目录号：72.693）
2. 牙签
3. 牛血清白蛋白 (BSA) 组分 V（Sigma-Aldrich，目录号：05482）
4. 甲基环己烷 (MCH)（Merck Schuchardt OHG 85662 Hohenbrunn，德国）
5. 蒸馏水切割样品
6. 膜载体（100 μm 深，1.5 mm 直径）（Leica Microsystems，产品目录号码：16707898）
7. 在 HPF 期间用于冷冻保护的 20% BSA 溶液（参见配方 3）

E. 冷冻替代（FS）

1. 一次性常规移液器，1、2 和 3 mL（VWR，目录号：612-2850、612-2851 和 612-1681）和 FS 专用 1 mL 细吸头移液器（Ratiolab，目录号：2600155）
2. 用于低温混合液制备的带有卡口盖的惠顿玻璃样品瓶（DWK Life Sciences， WHEATON，目录号：225536）
3. 个人墨盒半面罩 6100（Honeywell International，目录号：1029471）
4. 铝箔
5. 乙酸铀酰粉末（默克公司，目录号：8473）
6. 纯甲醇（Fisher Scientific，目录号：M/4062/17）
7. 超纯 100% 乙醇和丙酮（VWR，目录号：83813.440 和 20066.558，分别）
8. 彩色指甲油（颜色无所谓）
9. 带螺帽的 12.5 mL 试剂容器（Leica Microsystems，目录号：16707158）
10. HM20 树脂（Electron Microscopy Sciences，目录号 14345）
11. 试剂浴（Leica Microsystems，目录号：16707154）
12. 塑料模具流通环（Leica Microsystems：16707157）
13. 低温替代醋酸双氧铀原液 (20%)（参见配方 4）
14. 冷冻替代混合物（参见配方 5）
15. HM20 解决方案（参见配方 6）

F. 超薄切开术

1. 结晶皿（Fisher Scientific，目录号：11766582）
2. 快速吸水纸过滤器（Whatman，Filter papers 41）（GE Healthcare，目录号：1441-070）
3. 玻璃棒（Fisher Scientific，目录号：12441627）
4. Gilder 标准六角形 200 目铜网格（Electron Microscopy Sciences，目录号：G200HS-Cu）涂上 parlodion 或带有 formvar 的商业网格（Electron Microscopy Sciences，目录号：FCFT200-CU）
5. 用于粗块制备的剃刀刀片（Electron Microscopy Sciences，目录号：71990）
6. 巴斯德吸管（VWR，目录号：612-1720）
7. 0.2 μm 注射器过滤器（VWR，目录号：514-0061）
8. 10 mL 注射器（Terumo，目录号：SS+10ES1）
9. Solid parlodion（Electron Microscopy Sciences，目录号：19220）
10. 乙酸异戊酯（Sigma-Aldrich，目录号：W205532）
11. 甲苯胺蓝粉末（Sigma-Aldrich，目录号：T3260）
12. 硼酸钠粉末
13. 超纯 (Milli-Q) 水
14. 用于网格拍摄的 2% parlodion 溶液（参见配方 7）
15. 甲苯胺蓝溶液（参见配方 8），用于在树脂块研磨期间在台式显微镜上筛选块切片

G. 电子显微镜

1. 金胶体 5 nm（BBI 溶液，目录号：EMGC5）
2. 黄金基准溶液（参见配方 9）

设备

A. 植物栽培

1. 干燥器用作密闭室
2. 通风柜
3. 玻璃结晶皿
4. 冰箱春化
5. -80°C冷冻灭菌

B. 植物嫁接

1. 最小工作距离为 5 cm 的解剖显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica MZFLIII）
2. 用于用乙醇对工具进行灭菌的玻璃烧杯
3. 乙醇喷雾
4. 解剖微型刀 15° 5 mm（Fine Science Tools，目录号：72-1551）
5. 精密镊子 [EMS 样式 5X，目录号：78320-5X（软）和 78520-5X（硬）]

C. 荧光筛选

1. 变焦显微镜 (Zeiss Axiozoom.V16) 配备 0.5倍物镜，数值孔径为 0.125。荧光部分由荧光源Optoprim sola SE II和滤光片组组成（GFP滤光片组：激发窗口在460-480nm之间，发射窗口在500-548nm之间；mRFP滤光片组：激发窗口在540-580nm之间，发射窗口高达 593 nm）。

D. 高压冷冻 (HPF)

1. 液氮、液氮容器和改装的个人防护装备
2. 空压机 (JUN-AIR)
3. Leica EM-PACT1 机器（Leica Microsystems）
4. 徕卡加载系统
5. Pod 支架（徕卡，目录号：16706832）
6. 豆荚（徕卡，目录号：16706838）
7. 常规生物分子移液器，范围从 2 到 1,000 µL
8. 用于牙根解剖的透射照明双筒望远镜（Nikon，型号：SMZ-10A）
9. 加热表面用于在会议期间快速干燥豆荚和豆荚支架
10. 用于在液氮中操作的绝缘镊子（德国 VOMM，22 SA ESD）
11. 用于冷冻样品转移的金属容器和用于提升程序的相关螺丝刀（随 EMPACT1 提供）
12. 扭矩螺丝刀（TOHNICHI，扭矩螺丝刀 RTD60CN）设置为 30 N.cm

E. 冷冻替代（FS）

1. Leica 自动冷冻替代 AFS2（Leica Microsystems，型号：Leica AFS2）
2. Leica 冷冻替代处理器 FSP（Leica Microsystems，型号：Leica FSP）
3. 模具容器用金属插座
4. 用于从冷冻样品中分离膜载体的微针 [微针 0.025 mm（Electron Microscopy Science，目录号：62091-01）和 5 µm（Ted Pella，目录号：13625）]
5. 通风橱

F. 超薄切开术

1. 大块持有人
2. 金刚石修边刀，用于到达样品的第一步铣削（Drukker 8 mm Histoknife Dry，已停产）
3. 金刚石刀 Trim20 干式（硅藻土，目录号：DTB20）、超湿 45°（硅藻土，目录号：DU4530）和 Histo 湿式（硅藻土，目录号：DH4560）
4. ELMO 辉光放电器（可选）（CORDOUAN Technologies）
5. 用于网格存储的网格载体
6. Leica Ultracut UC7（徕卡显微系统公司，型号：Leica Ultracut UC7）
7. 台式显微镜（奥林巴斯，型号：CX-41）
8. 用于 parlodion 称重的精密体重秤（Sartorius，型号：TE124S）

G. 共聚焦显微镜

1. 灵敏的共聚焦显微镜（Zeiss Microscopy，型号：Zeiss LSM 880）和 63 × NA 1.4 油浸物镜

H. 电子显微镜

1. FEI Tecnai G2 Spirit 120 kV 配备 Eagle 4K × 4K 高灵敏度 CCD 相机
2. 高级断层扫描支架（Fischione instruments，型号：2020）

软件

1. Zeiss Zen Dark 2.3 版软件 ( https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html ) 用于共聚焦采集
2. Tecnai 成像和分析 ( TIA) 4.5 版软件与透射电子显微镜 (TEM) 用户界面软件4.5 版结合使用，以使用电子显微镜控制和获取显微照片 ( https://www.fei.com/software/ )
3. Xplore 3D 4.5 版 ( FEI) 用于自动倾斜系列采集 ( https://www.fei.com/software/ )
4. ImageJ版本 1.53n ( https://imagej.nih.gov/ij/download.html ) 使用 Bio-Form 6.9 版插件 ( https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/ ) 打开和处理 Zeiss .czi文件并打开 .mrc 倾斜系列文件和断层图。
5. IMOD 套件版本 4.11.6 ( http://bio3d.colorado.edu/imod/ )。断层扫描的所有处理都是使用 IMOD 套件（Kremer等人， 1996 年）完成的，从倾斜序列的对齐到断层扫描重建
6. 出于可视化目的，Adobe Photosh op 版本 23.0.1用于使用 photomerge 功能进行 TEM 马赛克组装。
7. IC Y 版本 2.4.2.0及其插件 ec-CLE M 版本 1.0.1.5 ( https://icy.bioimageanalysis.org/plugin/ec-clem/ ) 用于 LM 和 TEM 相关

程序

A. 植物嫁接

拟南芥下胚轴移植程序根据Melnyk (2017a)协议的两段茎根移植部分进行了调整和优化。找到合适的湿度水平是 Melnyk 方案中最具挑战性的部分。在我们手中，用水基琼脂培养基代替浸水的 Whatman 纸是嫁接后几天保持恒定湿度的关键，并将我们的嫁接成功率从 50% 提高到 80%。以 CLEM 的移植物界面为目标，我们移植了表达融合到内质网保留基序 HDEL（35S::HDEL-YFP 和 35S::HDEL-mRFP1.2）的荧光蛋白的转基因系（Dean 和 Pelham，1990；Knox 等等人，2015 年；Chambaud 等人，2022 年）。组成型 35S 启动子用于确保强烈的初始荧光信号。

图 1. 种子灭菌程序。 (A) 1.5 mL 样品管中适当数量的种子以进行适当的灭菌。 (B)对于气体灭菌，将它们打开放在管架中。 (C)漂白剂的玻璃结晶盘。 (D)在玻璃结晶盘、管架和含有种子的开放式 Eppendorf 管中装有漂白剂的密封室。 (E)将漂白剂与盐酸混合时，溶液变成黄色（白色箭头），可见淡黄色的氯化物气体混浊。

1. 植物栽培
a. 用氯气对拟南芥种子进行消毒（改编自Lindsey等人，2017 年）。
i. 将少量种子（大约 100–150）等分到 1.5 mL 离心管中，用永久性笔标记（用胶带覆盖以避免墨水被洗掉），盖上盖子，然后将它们放在 - 中 20 分钟80°C 冰箱（图 1A）。
ii. 灭菌将在通风橱下的密封室中进行，通常是玻璃干燥器。在干燥器中，放置一个装有 50 mL 漂白剂溶液的小玻璃结晶盘（参见配方 1）（图 1C 和 1D）。
iii. 在将离心管放入腔室的管架之前，先打开离心管的盖子。将 1.5 mL 的 12 N盐酸添加到结晶盘中的漂白剂溶液中，无需混合，然后迅速关闭腔室。此时应该可以看到氯气的黄色烟雾（图 1E）。让种子在室内放置 4 小时至过夜（例如，下午 6 点至上午 9 点）。
iv. 打开腔室并关闭离心管。将腔室在通风橱下打开一天，直到盐酸和漂白剂之间的反应结束。该反应产生氯气、氯化钠和水。然后您可以丢弃该解决方案。请注意，如果种子发芽似乎受到影响，则孵育时间应减少至 1-3 小时。
b. 在层流罩下，将种子轻轻撒在含有半强度 MS 培养基和维生素的方形培养皿上。由于氯化物气体灭菌，干燥种子的均匀分布很容易实现。用 anapore 胶带密封板。
c. 对于春化和分层，在 4°C 下将平板水平放置，种子放在上面，在黑暗中最多放置 2-5 天。
d. 将板转移到温度为 20 – 23°C 且光合光子通量密度 (PPFD) 为 100 µmol · m -2 · s -1的生长室中。将盘子垂直放置，使下胚轴尽可能笔直地生长。请注意，短日照生长条件（例如每天 8 小时光照）会产生更细长的下胚轴，这有利于嫁接程序和显微镜实验（Melnyk，2017a，2017b）。一旦第一片真叶在双目显微镜下刚好可见，就可以进行嫁接了（图2）。一般来说，在短日照或长日照（即 8 小时和 16 小时光照）下生长的幼苗必须分别长到 5 天或 7 天才能嫁接。在任何时候，您都需要监测植物生长情况，以便在更合适的时间进行嫁接。

图 2.用于嫁接的理想拟南芥幼苗。用于嫁接的理想拟南芥幼苗具有直的下胚轴、非常小的第一片叶子（白色箭头）和不应在下胚轴上弯曲的子叶（白色箭头）。比例尺：500 µm 。

2. 嫁接

图 3. 嫁接实验的工作流程

如果您不打算将移植物在体外保存超过六天，则培养基和移植培养基中不含蔗糖，因此可以在非无菌条件下进行移植。在我们的嫁接研究中，我们在非无菌条件下在工作台上进行嫁接，因为我们在嫁接后三天和六天对样品进行了处理。尽管如此，我们还是在 70% 乙醇预清洁工作台上使用经过消毒的工具来限制污染。
使用的解剖显微镜必须具有至少 5 厘米的工作距离（镜头与其焦平面之间的距离），以便为操作留出足够的空间。我们通常使用 6倍到 20倍的放大倍率，并使用环形照明或光纤系统。进行嫁接是乏味的，需要精确和快速的操作。在尝试嫁接实验之前，尽量避免喝咖啡和其他兴奋剂。通过实践，移植技术可以让您以每小时 70 次移植的速度达到 80% 到 90% 的成功率。遵循建议的嫁接实验工作流程（图 3）可以帮助您安排日程。在嫁接日，预订落射荧光变焦显微镜和体视显微镜并准备材料（图4）。

图 4。嫁接工具。 (A) 1. 用于嫁接的解剖微型刀； 2、工具灭菌用玻璃烧杯； 3. 用于标记培养皿的永久性记号笔； 4.用于嫁接的圆形培养皿； 5. 用乙醇喷洒工具和工作台清洁； 6、细镊子； 7. 铝箔包裹无菌尼龙膜； 8.要嫁接的植物。 (二) 嫁接后用封口膜封住培养皿。（C）移植前尼龙膜的定位。

a. 嫁接前
i. 将尼龙膜切成 2 × 5 厘米的碎片，然后用铝箔包裹。
ii. 在蒸馏水中用 1.6% 的植物琼脂制备嫁接介质，并在 pH 5.8 下用 1 N KOH 缓冲。
iii. 将接枝介质和用铝箔包裹的尼龙膜片在 120°C 下高压灭菌 20 分钟。
iv. 当嫁接介质可处理时（避免高压灭菌后灼伤），在层流罩下用大约 20 mL 的琼脂填充圆形培养皿。
b. 对于嫁接步骤
i. 使用激发功率设置在中等预设水平的荧光变焦显微镜，识别显示具有激发功率的强烈荧光表达的植物。
ii. 收集培养皿、微型刀、镊子、尼龙膜、永久笔和封口膜条（图 4）。
iii. 通过喷洒 70% 乙醇清洁解剖显微镜、微型刀和镊子，并在使用前让它们完全干燥。如果您必须移植两个以上的板，请每两个板重复一次清洁步骤。
iv. 用你将用作接穗和砧木的植物系标记你的培养皿。
v. 在每个盒子的上部放一块尼龙膜（图 4C）。
c. 在荧光植物中，选择大小均匀、下胚轴尽可能直、子叶不弯曲下胚轴的植物（图 2）。将它们排成一排放在膜上（图 5）。要移动它们，您可以使用不会夹住纸巾的镊子或牙签。请注意，您必须避免对下胚轴、芽和根造成任何损害。如果您想使用这两种基因型作为接穗或砧木，您可以将第一种基因型的六株植物放在同一行的第二种基因型的六株植物中（图 5A）。如果您希望将一个基因型仅用作接穗而另一个仅用作砧木，则可以将植物分成两排，每排 12 株植物（图 5B）。
d. 该膜用作切割表面。切割它以避免损坏微型刀。
笔记：
i. 如果微型刀使用得当，每把可用于大约 400-500 个移植物。它必须允许仅在一次运动中进行锐利的切片。在清洁的解剖显微镜下，切断并丢弃一个子叶（选择在下胚轴上弯曲的最小、受损最严重的子叶），使幼苗平躺在膜上（图 6A、B、C）。横向穿过下胚轴，就在子叶下方，不要压碎植物（图 6D）。
ii. 将下胚轴切得太低可能会影响嫁接的成功，因为接穗会形成不定根（视频 1）。

视频 1.拟南芥下胚轴嫁接

e. 用闭合的镊子将叶柄提起接穗，并将其放在另一株植物的砧木上（图 6F 和 6G）。两个截面部件的大部分表面必须接触。您可以通过使用闭合的镊子将切割的接穗轻轻推向切割的砧木来改善定位，使两个合作伙伴直接接触（图 6G 和 6H）。
注意：我们建议您将直径相似的下胚轴嫁接在一起，避免移动切割的砧木，它非常脆弱。水分含量在接枝结合形成过程中至关重要。嫁接到嫁接介质（含 1.6% 琼脂的水）上可保持水分含量恒定，并允许在嫁接后六天将移植物保持在体外。

图 5。嫁接准备。 (A)当希望保留两个移植方向（基因型 1/基因型 2 和基因型 2/基因型 1）时，可以使用 6/6 移植方案。接穗和砧木将在两种基因型之间准备、切割和交换。 (B)当需要单一方向的嫁接时（如上所述基因型 1/基因型 2），可以使用 12/12 嫁接方案。在切割和丢弃根部之前，将接穗放在顶行（基因型 1）。底行（基因型 2）包含砧木。它们的顶端部分将被切割并丢弃。从基因型 1 制备的接穗将被移动并嫁接到基因型 2 的砧木上。

f. 重复步骤 c.、d. 和 e。直到所有植物嫁接完毕。为了节省时间，您可以连续执行此操作：(1) 剪下并丢弃每株幼苗的一个子叶，(2) 剪掉所有的芽，(3) 将它们移到准备好的砧木旁边，(4) 对齐并推入接穗到砧木上。

嫁接完成后，小心操作盘子，避免突然移动，以免接穗从砧木上脱落。盖上盖子并用封口膜条密封盘子。您可以在板上标上移植结束的时间，以便了解移植物的年龄。在 100 µmol · m -2 · s -1光的短日照或长日照条件下，小心地将板垂直放回生长室中，温度为 20 – 23°C。注意：如果移植正确，则可以在移植后 48 小时开始操作移植物（即在显微镜下观察、固定组织、转移到新培养基等）。 3 天后，移植物变得稍微更坚固，因为韧皮部应该连接起来。 6-7天后，木质部相连，嫁接植株变得相当健壮。在开始嫁接实验时，您可能需要首先评估您的嫁接成功率。您可以依靠几个标准来评估嫁接成功(Melnyk, 2017b) ，例如根系生长的恢复，通常伴随着侧根的出现，以及接穗中没有不定根形成。您还可以通过嫁接表达 pSUC2::GFP [即韧皮部特异性 SUC2 启动子下的绿色荧光蛋白 (GFP)] 并观察 GFP 向砧木的移动，或通过应用羧基荧光素二乙酸酯 (CFDA) 来监测韧皮部连接如Melnyk (2017b)所述，对接穗或砧木评估韧皮部和木质部的连通性。

图 6. 嫁接的分步过程。将两株植物并排放置在尼龙膜上，沿黑色虚线（A 和 B）切下每株植物的一个子叶，然后丢弃（C）。下胚轴沿着白色虚线（D 和 E）在子叶叶柄正下方切割。通过将接穗粘在镊子(F)的尖端来在植物之间交换接穗。用镊子(G)的尖端小心地将接穗靠近砧木。正确移植后，移植物连接处（黑色箭头）几乎不可见(H) 。

B. 克莱姆

在固定之前，确保通过目镜可以轻松看到具有非破坏性观察（立体显微镜或肉眼）的单个样品的荧光信号。
1. 高通滤波器
注意：HPF 是使用 Leica EM-PACT1 机器完成的（Studer 等人，2001）。 Nicolas 等人描述了详细的协议。 (2018) 。该程序涉及液氮的操作；如果您不熟悉其处理方式，请参阅官方指南。此外，我们建议按条件修复大约 10 个样品，并在修复下一个条件之前将一个条件的所有样品作为一个批处理。它将帮助您避免混淆不同的移植物。此外，我们建议在周一或周二启动 HPF 和 FS，以便在下周四或周五完成区块准备工作（表 2）。
a. 准备 EM-PACT1 机器，方法是 (1) 用液氮填充杜瓦瓶，(2) 填充 MCH 室，以及 (3) 通过两次空白射击将空气排出电路。
b. 在徕卡加载系统上为膜载体（100 µm 深载体）充电。
c. 从培养皿中挑选一株嫁接植物，并在双目变焦显微镜下将其放在覆盖有水的载玻片上。
注意：应尽快执行以下步骤，以限制切割和 BSA 干燥的生物反应。
d. – 2 µL 移液器在水中填充 20% BSA 的载体，直到液体表面在载体的井中呈圆顶状。确保没有气泡。
e. 在双目变焦显微镜下，用刀片在载玻片上解剖水中的移植物界面，然后用牙签小心地将其捡起。
f. 在使用徕卡加载系统将膜载体推入吊舱之前，将移植物界面放入膜载体中的 BSA 中。
g. 使用扭矩螺丝刀（设置为 30 N.cm）关闭吊舱并拆下徕卡加载系统。
h. 将样品装入 EM-PACT1 机器并拍摄。
i. 通过确保在达到最低温度之前达到大约 20 毫秒的最大压力，检查屏幕上的冻结速率和压力升高。
j. 在 FS 步骤之前，将冷冻样品至少储存在 -90°C 下。
k. 重复步骤 B1b – j，直到所有样品都冷冻。

表 1. 植物相关光电子显微镜 (CLEM)：冷冻替代 (FS) 和树脂聚合程序与标准植物和酵母 CLEM 程序相比

2. 冷冻替代（FS）
注意：我们的 FS 和嵌入协议基于Kukulski 等人发布的协议。 (2012 a and 2012b);它最初是为酵母和哺乳动物细胞设计的，我们将其改编为我们的植物组织（表 1）。在 FS 期间和样品脱水之前，将样品保持在 -80°C 下以避免形成冰晶至关重要。为此，每个容器、介质和工具都必须在接触冷冻样品之前进行预冷。此过程涉及液氮、醋酸双氧铀和 HM20 的操作。如果您不熟悉这些化合物的处理，请参阅官方指南。醋酸双氧铀应避光保存，以防止形成沉淀。然而，没有必要在黑暗中工作；尽可能避免用乙酸双氧铀溶液直接和长时间曝光就足够了。我们可以处理每个 FS 实验的一到四个不同条件，每个条件有五到十个样本。为了简化操作，将条件完全相同的样品在同一个 FS 试剂浴中混合在一起（图 7）。在每次洗澡之间，不要去除所有液体，系统地让液体背景避免样品干燥。

图 7. 冷冻替代 (FS) 。 (A) 1. 用于转移的螺丝刀； 2. Leica 传输系统和 3. 它的盖子(B) 4. 一个用铝箔覆盖的自动 FS 2盖子。 (C) 5. 含有膜载体的 Leica 试剂浴； 6.流通式环模； 7.绝缘镊子。试剂浴和流通环模具标有指甲油，以识别不同的条件（黑色箭头）。

a. 用液氮填充 AFS2 杜瓦瓶并将其温度设置为 -90°C。如果设备处于室温，则可能需要半个多小时。
b. 对于每种情况，使用彩色指甲油标记一个试剂浴并将它们放置在 AFS2 室中（图 7C）。
c. 在化学防护罩下并远离直射光，在带卡扣盖的玻璃样品瓶中准备 FS 的低温混合物（参见配方 5）。计划有 2.5 毫升/条件。确保 AFS2 灯已关闭，并将装有 FS 混合物的封闭小瓶转移到 AFS2 室。通过在 AFS2 室中处理，使用巴斯德移液器将 2.5 mL 的 cryomix 分配到每个试剂浴中。再次确保 AFS2 灯已关闭，并通过放置先前用铝箔覆盖的盖子来关闭其腔室（图 7B）。在执行以下步骤之前，如果 AFS2 已经处于 -90°C，请确保至少等待 10 分钟以预冷 FS 混合物。
d. 当 AFS2 室的温度达到 -90°C 时，使用预冷 Leica 支架（图 7A）将冷冻样品从液氮快速转移到 AFS2 室。使用预冷镊子，将包含冷冻样品的膜载体发送到相应的浴槽中（图 7C）。在关闭 AFS2 室之前，在将用于后续步骤的补充 FS 浴中准备一定量的纯丙酮（计划有 2.5 mL/每个条件）。
注意：如有必要，您可以在 AFS2 腔室处理过程中打开 AFS2 的灯。处理完成后不要忘记将其关闭。
e. 启动程序前按如下方式设置 AFS2：
温度期间
-90℃ 30小时
+3°C/小时 13小时
-50℃ 支持

f. 在 cryomix 中 43 小时 FS 后，当温度达到-50°C 时，通过移除 cryomix 并将其替换为 2.5 mL 预冷纯丙酮来清洗样品。用新体积的纯丙酮重新填充无样品的补充 FS 浴。等待 10 分钟以冷却丙酮。
g. 重复步骤 B2.f。两次。
h. 第三次用纯丙酮清洗后，用纯乙醇填充补充 FS 浴，等待 10 分钟冷却，然后再使用乙醇清洗不同的样品。重复乙醇洗涤两次。
i. 根部的一个可选步骤，但对于下胚轴和移植接口等更大的样品也非常鼓励，包括在最后一次乙醇清洗期间使用微型工具小心地将样品与膜载体分离。此步骤有助于优化树脂对生物组织的渗透。 Nicolas 等人描述了此过程的分步指南和说明。 (2018) 。
j. 要释放 AFS2 室中的空间，请移除用于冲洗的补充试剂浴。对于每种情况，使用彩色指甲油标记试剂浴和流通环（图 7C）。将它们放入 AFS2。用 2.5 mL 的纯乙醇填充它们，等待 10 分钟让它们冷却下来。如果您有两种以上不同的情况，您可以依次向 AFS2 腔室中添加更多试剂浴，以避免腔室过满，这会妨碍操作。
k. 使用 3 mL 的一次性移液器移取样品（它必须靠近移液器的尖端），将样品从 FS 浴转移到塑料模具流通环的一个位置。对于保存在载体中的样品，使用预冷镊子并将样品放在流通环的一个位置的上表面。
l. 使用 AFS2 双筒望远镜，使用微型工具将每个样品置于其流通环的中心。
m. 在化学罩下，在 Leica 试剂容器中为树脂嵌入程序（纯乙醇中 25% 的 HM20）准备第一个混合物。计划为每个模具使用 2.5 mL。在摇动容器并将其放入 AFS2 室进行预冷之前关闭容器。 10 分钟后，通过缓慢移液将每个模具中的纯乙醇替换为嵌入混合物。
n. 要逐步形成纯 HM20 浴，请按照以下步骤对其他包埋混合物（2. 至 6.）重复最后一步：
混合温度期间
1. HM20 25% -50℃ 2小时
2. HM20 50% -50℃ 2小时
3. HM20 75% -50℃ 过夜
4. HM20 100% -50℃ 2小时
5. HM20 100% -50℃ 2小时
6. HM20 100% -50℃ 6小时

o. 当到达最后一个包埋浴（第六浴）时，安装紫外线灯并将 AFS2 设置为最后一个包埋步骤和 UV 下的树脂聚合：
混合温度期间
HM20 100% + 紫外线关闭 -50℃ 6小时
HM20 100% + 开启紫外线 -50℃ 24小时
HM20 100% + 开启紫外线 +60°C/小时 ~1 小时
HM20 100% + 开启紫外线 20℃ 12小时

注意：对于根尖等较薄的样品，第三次 HM20 浴可以减少到 2 小时。
对于我们的协议，我们还减少了紫外线下的聚合时间，以限制荧光蛋白的紫外线暴露。在 -50°C 下聚合 24 小时，然后在 20°C 下聚合 12 小时，树脂块的硬度足以进行超薄切片术。
p. 树脂聚合后，从 AFS2 室中取出树脂块，并将它们储存在黑暗中的 -20°C 冰箱中，以防止荧光光氧化。
注意：对于我们的移植接口，在存储一到两年的样本中，YFP 信号往往很弱甚至检测不到，而红色荧光蛋白 (RFP) 信号似乎保存得更好。我们认为，为确保 CLEM 方法的成功，应尽快完成嵌入样本的处理和观察。

植物相关光学和电子显微镜 (CLEM)的低温固定和冷冻替代 (FS) 时间表

3. 超薄切开术
注意：在以下步骤中，通过限制超薄切片机光的功率和在不切片时在树脂块上放置不透明盖来防止树脂块暴露在光线下。我们建议在同一天执行切片步骤和共聚焦观察，以避免与切片的氧气暴露相关的荧光损失。然而，如果切片提前几天准备好，我们建议将它们储存在 -20°C 的黑暗环境中以减缓光氧化反应。
在大多数情况下，超薄切片的常规厚度（从 60 到 90 nm）不允许我们检测到足够的荧光信号。为了增加我们切片中荧光蛋白的数量，我们将它们的厚度增加到 150 nm，在我们的条件下，这是共聚焦显微镜下信号量与 120 kV TEM 下分辨率之间的最佳平衡。较厚的部分电子透光率较低，低信噪比会影响分辨率。增加常规厚度会导致分辨率损失，这可以通过为 TEM 和电子断层扫描过程使用更高的电压来补偿。请注意，如果您的荧光信号非常强，您可以减少切片的厚度并达到更好的分辨率。总而言之，您必须为您的样品找到一个良好的平衡点，以便在不影响您在 TEM 上的最终分辨率的情况下在要检测的部分中有足够的荧光蛋白。
由于样品嵌入 HM20 中，因此需要在涂膜网格上采集切片。 Nicolas 等人描述了网格拍摄和树脂块制备的详细协议。（2018 年）。我们建议使用带有细条的 200 平方网格铜网格，这样可以在视野和稳健性之间取得良好的折衷。
a. 为避免切片过程中块上发生冷凝，请将其从冰箱中取出并在避光的地方（例如抽屉）在室温下放置几分钟。
b. 在 ultramicrotome 上将速度设置为 500 毫米/秒，将厚度设置为 500 纳米。
c. 用低温修剪刀修剪您的块，去除多余的树脂并塑造您的金字塔。
d. 当你开始切割你的样品时，用组织刀替换 cryotrim。将速度设置为 1 mm/s，将厚度设置为 500 nm，并在触摸屏上设置带有“开始”和“结束”的切割窗口。在用甲苯胺蓝染色之前制作 500 nm 的部分，以控制您到达感兴趣区域 (ROI)。
e. 当达到 ROI 时，用超刀替换 histoknife 以制作 150 nm 厚的部分。
f. 在涂有 parlodion 的铜网格上收获部分，并在黑暗中储存直至干燥，以确保它们在进行显微镜观察之前完美附着在 parlodion 薄膜上。
4. 继续安装载玻片和盖玻片之间的部分。
由于网格和部分的弱点，这一步很微妙。为了与别有用心的断层扫描采集兼容，网格必须尽可能保持平坦。注意只用细钳子在其外围操作网格。此外，该部分的均匀水浸似乎对于确保良好的共聚焦采集至关重要。在荧光采集之前的网格浸入过程中，要特别注意避免截面和盖玻片之间形成气泡（图 8）。

图 8. 安装步骤中形成的气泡。由于折射率不同，安装过程中气泡的形成会降低光学显微镜采集的质量。比例尺：20 µm 。

a. 可选：辉光放电
如果您在防止气泡形成方面遇到困难，请使用辉光放电器使 parlodion 和切片亲水。在安装之前，将您的网格一个接一个地发光，因为效果只会持续大约 30 分钟。
i. 打开辉光放电系统。
ii. 通过执行空白循环清洁辉光放电室：将盖玻片放入真空钟内并关闭腔室。关闭空气阀，让压力下降到 2 × 10 -1毫巴。按下高压按钮并调节电压，直到电流达到15-20毫安。在 30 秒内保持高压，然后通过缓慢打开空气阀逐渐打破真空，以避免盖玻片因高减压而飞行。
iii. 打开真空钟并将网格放在盖玻片上。关闭空气阀，让压力下降到 2 × 10 -1 mbar。按下高压按钮并在 1 分钟内保持高压。通过非常缓慢地打开空气阀逐渐打破真空，然后拿起你的网格。
b. 安装用于共聚焦显微镜的网格以防止气泡（图 9A - 9F，视频 2）。

视频 2. 安装用于共焦成像的 TEM 网格

图 9. 用于光学显微镜 (LM) 观察的透射电子显微镜 (TEM) 网格的安装和卸载。 (A–F) TEM 网格的安装。 (A)在观察之前，用乙醇清洁幻灯片以消除可能污染 TEM 网格的灰尘。然后，用注射器滴一滴过滤水。您可以弄湿两侧的 TEM 网格，以便以后更容易将其放入水中。将超薄部分放在顶部，以便观察荧光信号，即使对于位于 TEM 网格条上的部分也是如此。 (B)接近盖玻片，直到它接触到水。 (C)用非常薄的镊子小心地将网格放在载玻片和盖玻片之间。将网格浸入水中，避免在网格表面形成气泡。 (D)从镊子上松开网格，用镊子的尖端将网格固定在水中，这样当躺在盖玻片上时网格就不会移动。 (E)从尖端释放网格，并使用尖端作为指南慢慢放置盖玻片。 (F)最后，在成像前用吸墨纸擦干多余的水。 (G–L)卸载 TEM 网格。（G 和 H）用注射器将过滤水加入盖玻片的一侧并等待几分钟。 (I)过量的水有助于轻松地将盖玻片从载玻片上分离。慢慢倾斜载玻片，直到盖玻片的一角位于载玻片外。 (J)非常小心地取下盖玻片。在此步骤中，不应有任何阻力，以免破坏 parlodion 薄膜。 (K – L)添加更多过滤水，直到 TEM 网格从幻灯片上脱落，然后再用镊子取出。

对于此步骤，我们建议使用默认关闭的倒置镊子。
i. 用镊子取出网格并将镊子放在桌子上。
ii. 使用注射器和 0.2 µm 过滤器，将一滴水放在用乙醇预清洁的显微镜幻灯片上。
iii. 将盖玻片倾斜地靠近载玻片，直到它接触到水滴。
iv. 小心地拿起带有网格的钳子，将网格浸入载玻片和盖玻片之间的水滴中。慢慢打开钳子释放网格，网格应浸入水中，然后用镊子的尖端将网格固定在水中，并将盖玻片放在钳子上。
v. 用吸水纸或纸巾去除载玻片上多余的水。您现在可以将幻灯片放在 LM 下方并进行观察。

5. 共聚焦显微镜
在 LM 分析期间，由于切片中的信号可能很低，您可能会认为荧光保存失败，但实际上并非如此。要检测荧光信号，您需要保存和收集样品为最终采集产生的最大光子。一般来说，对于 YFP，每个 ROI 只能进行一次 z 堆栈采集，并且具有方便的信噪比。使用弱透射光将您的 ROI 定位在视野的中心，而不是荧光激发源。为您的采集选择最灵敏的检测器（GaAsP 而不是传统的多碱光电阴极）。如果您的共焦配备了 AiryScan 检测器，则可以改善信号和分辨率。此外，为了让您的采集获得最佳分辨率，请选择具有最高数值孔径（1.3 到 1.4 之间）且具有良好荧光传输并经过校正以使用盖玻片的物镜。尽可能设置较大的发射窗口以收集最大的发射光子。您应该有一个电动载物台，并考虑进行 Z-stack 以收集该部分发射的最大光子。此外，为了促进相关性并确保对同一感兴趣区域的观察，进行平铺扫描（以获得具有良好分辨率的概览）和获取传输图像将有所帮助。
a. 通过具有低放大倍率物镜（例如 10 × ）的目镜和透射光开始您的观察，以找到并居中您的网格。
b. 要更轻松地定位您的部分，请关闭孔径光阑以增加对比度并找到部分的边缘。
c. 通过放置最佳目标来提高分辨率。调整样品在载物台上的焦点和位置，并正确设置孔径光阑（与物镜的数值孔径相同）。
d. 转移到共焦模式。仅打开 mRFP 激励线并激活传输位置的检测器以及最灵敏的荧光检测器。对于最后一个，通过将增益设置为 850 来推动信号放大。仅打开 mRFP 激发线和/或叶绿素以保持最大 YFP 荧光。使用传输和 mRFP 通道开始快速扫描以定位移植接口，并设置 Z 堆栈的上下 Z 窗口限制。避免设置太厚的 Z 堆栈，这会导致样品过度曝光，但效率低下。
e. 停止扫描并设置顺序模式采集：YFP 和叶绿素在一条轨道上，mRFP 在第二条轨道上。优化采集参数：针孔开口、像素大小、z 间隔和像素停留时间在 2 µs 左右，并推动激发功率（488 波长高达 12%，561 波长高达 3%）。
f. 当所有先前的参数都设置好后，开始您的 Z 堆栈采集。
g. 尽管该部分很厚，但并非所有荧光区域都在 Z 堆栈的同一切片上。为了便于可视化，在 Z 堆栈采集后系统地实现了 Z 投影；最大或总和投影都可以根据您的样本工作。此外，尽管为优化采集做出了所有努力，但 YFP 可视化可能需要压缩直方图的强度级别。
h. 移除 EM 网格（图 9G - 9L，视频 2）
在共聚焦显微镜下长时间观察会导致载玻片和盖玻片之间的水分蒸发，从而使 EM 网格有可能粘在玻璃上。当它粘在玻璃上时取下盖玻片会大大增加打破 parlodion 薄膜的机会。
i. 要在不破坏薄膜的情况下取下盖玻片，请使用注射器（和过滤器）在盖玻片周围放水，等待盖玻片漂浮在水面上。用镊子小心地取出盖玻片。
ii. 如果网格粘在盖玻片或载玻片上，在网格周围滴一滴水，等待网格自行分离并漂浮，然后用镊子尖轻轻取出。
iii. 通过在 Whatman 纸上垂直吸干网格并将它们放回网格盒中以进行后续 EM 观察来干燥网格。一定要记住你的样本在网格的哪一侧，这样你就可以在 EM 下观察同一侧（否则，你将得到样本的镜像，并且你感兴趣区域的相关性和定位将更加困难） .
在共聚焦显微镜下观察到的荧光图案允许根据形状在 EM 下识别细胞。
6. TEM 和电子断层扫描：
TEM 观察会损害分子构象。如果需要，必须在第一次 TEM 观察之前系统地进行荧光观察和免疫标记。对于相关性，可能需要 TEM 概述来匹配 LM 的视野以进行相关性。根据细胞的形状，用 LM 观察到的 ROI 在 TEM 下是有针对性的。为避免在 TEM 采集过程中发生错误调用和变形，请从显微镜设施的工作人员那里获得帮助，以确保 TEM 的正确对齐和 eucentric 高度的正确设置。对于需要高超微结构分辨率的研究，必须对感兴趣的结构进行电子断层扫描。它允许获得 3D 视图并恢复与较厚部分相关的分辨率损失。
a. 仅电子断层扫描需要：
i. O na parafilm 条放在工作台上，放一滴 20 µL 的金基准溶液（见配方 9）。
ii. 将感兴趣的网格放在水滴上，让它漂浮 1 分钟。
iii. 用镊子取出网格，并用 Whatman 纸小心地将其外围吸干，去除网格上残留的多余金基准溶液。
iv. 将网格的另一面放在水滴上，在重复步骤 iii 之前让它漂浮 1 分钟。
v. 在将网格插入 TEM 之前让网格干燥。
b. 将网格插入 TEM。根据细胞形状及其相对于网格网格的位置，以 LM 先前本地化的 ROI 为目标。
c. 获取一系列图像，以覆盖感兴趣的整体网格，并具有可引入物镜隔膜的放大倍率。它允许您获得具有足够对比度和分辨率的 ROI 的完整马赛克（图 10A）。
d. 增加放大倍数以观察您感兴趣的结构并获取数据。对于胞间连丝，我们将放大倍数提高到 41,000倍，并拍摄中间放大倍数的图像，以确保别有用心的相关性成功（图 11）。
e. 如果添加了珠子，则可以按照 Nicolas 等人的生物协议论文中描述的过程成功完成电子断层扫描采集。 (2018)（图 11D）。

图 10. 马赛克采集和合并允许为以后的关联提供大视野。 (A)在透射电子显微镜上使用物镜隔膜获取 16 张图像，以覆盖移植界面的大视野。 (B) Adob e 的 photomerge 功能自动排列图像 Photoshop。 (C) Photomerge 可以均匀化对比度和曝光并校正几何变形以实现无缝融合。

7. 相关性
在通过 LM 和 TEM/电子断层扫描获取图像后，需要执行两个显微镜的相关性，以充分利用 CLEM 方法。使用 Adobe Photoshop 软件的 photomerge 功能融合来自 TEM 的马赛克图像（在步骤 6c 中获取）（图 10）。它允许您拥有广阔的视野，最终包含整个移植界面。在此阶段，重要的是保留构成马赛克的原始图像以供日后分析，因为 Photoshop 无法保留图像校准。
Icy 软件（De Chaumont 等人，2012 年）的 ec-CLEM 插件（Paul-Gilloteaux 等人，2017年）执行的。在概述中，可以使用在 LM 和 TEM 中容易识别的细胞地标（例如质体、细胞核和细胞角，还有污垢颗粒）（图 11A）。提供了有关使用 ec-CLEM 和 Icy 软件的详细程序和视频教程( https://icy.bioimageanalysis.org/plugin/ec-clem/ )。这是关于其在嫁接下胚轴标本上使用的分步协议。

图 11. 从相关概述到高分辨率相关断层扫描图。 (A)感兴趣区域 (ROI) 的大型 CLEM 视野。 (B) (A) 中突出显示的区域的更高放大倍率。 (C) (B) 中突出显示的区域的更高放大倍数。 (D)对应于 (C) 的 ROI 的相关电子断层扫描图。刻度条：(A) 10 µm、(B) 5 µm、(C) 0.2 µm 和 (D) 0.05 µm。

a. 将您的 LM 和 TEM 采集复制到专用于相关性的新文件夹中，其中将存储由 Icy 软件生成的用于自动保存的自动 xml 文件。
b. 使用“图像”>“打开”或通过将图像拖放到软件中，在 Icy 中打开您的 TEM 和 LM 图像。
c. 打开图像后，运行 ec-CLEM 插件。如下设置插件：开始使用“2D，但让我自己更新”以避免由于转换的自动更新而导致的缓慢过程。当工作站不够强大时，此选项特别有用。
d. 根据 ec-CLEM 建议选择要处理的图像 [即，要转换的荧光显微镜 (FM) 图像和不修改的 TEM 图像]，然后按播放运行插件。
e. 将第一个点放在 TEM 图像上的地标上。调整 LM 图像上同一地标的位置。重复至少 10 个点，最好覆盖图像的每个区域，然后按更新转换。这将根据您放置的点转换和调整 FM 图像的大小。
f. 使用锁定按钮链接两个图像，以便它们的显示可以同步以更轻松地放置其他点。使用概览可以放置 10-25 个标记以获得更精确的相关性。
g. 放置所有点后，再次更新转换，然后在插件窗口中按停止按钮。这将自动生成您可以保存的相关图像。在此阶段，软件可能会显示一条错误消息，告知您相关性不完善。这是由于与电子束下的 HM-20 收缩相关的各向异性变形。
h. 要优化相关性，请在关闭图像之前返回 ec-CLEM 插件窗口并将转换更改为非刚性（2D 或 3D），按播放并更新转换。按停止生成相关图像。通过这种方法生成的图像将进行各向异性变换，因此每个相关点都可以匹配。您可以保存图像。

借助概述中的这种相关性，更高放大倍率的 TEM 图像或电子层析成像采集可用于生成高分辨率 CLEM 图像（图 11）。
请注意，生成相关图像仅用于可视化，不用于测量，因为像素的尺寸可以在过程的不同阶段修改（合并 TEM 图像、相关）。如果您想测量您感兴趣的结构的某些特征，例如我们案例中的细胞壁厚度或细胞器之间的距离，您必须返回原始原始 TEM 图像。

数据分析

我们的移植协议与 HPF 相结合，我们的 FS 协议适用于 CLEM，使我们能够保留样品的荧光以及良好的超微结构分辨率。在拟南芥的移植界面，现在可以使用每个伙伴的不同荧光蛋白的表达来确定细胞的来源，而不会产生任何歧义（图 11）。与含四氧化锇的标准 FS 相比，膜等脂质成分的对比度较低，但仍然清晰可见。此外，如有必要，可以应用电子断层扫描来提高分辨率（图 12），因为它可以恢复对比度质量，从而获得非常高的分辨率。传统电子显微镜观察到的细胞质和胞间连丝模糊不清，而使用电子断层扫描，它们看起来更清晰、对比度更高且分辨率更高。胞间连丝膜、透明核糖体（游离或与内质网结合）和小囊泡等细节清晰可见。电子断层扫描使我们能够达到感兴趣结构的高 3D 细节水平，例如胞间连丝，并在三个维度上研究它们的形状，而这在传统电子显微镜图像中是不可能的（图 12）。

图 12. 移植物界面处胞间连丝的电子断层扫描和分割。 (A)在移植界面 z = 0 nm 处观察到的胞间连丝断层图。 (B)在接枝界面 z = + 11 nm 处观察到的 PD 断层图。 (C)在接枝界面 z = + 31 nm 处观察到的 PD 断层图。 (D)断层图的分割允许在 3D 中可视化结构。比例尺 (A–C)：100 纳米。

此外，我们的协议保留了抗原性，从而能够对所需结构进行免疫标记，以便在电子显微镜下进一步识别（图 13）。最后，该 CLEM 方案成功应用于根等其他植物组织（Dragwidge 等人，2022 年；Gomez 等人，2022 年）。

图 13. 黄色荧光蛋白 (YFP) 的免疫定位。 (A) HDEL_YFP 嫁接在 HDEL_mRFP 上的嫁接界面的共聚焦观察和(B)相应的相关视图。 (C) (B) 中白色方块突出显示的区域的放大图，显示HDEL_mRFP（红色虚线平方）和 HDEL_YFP（绿色虚线平方）的内质网。 (D)这些区域的放大显示 HDEL_YFP 细胞的内质网中存在用金颗粒免疫标记的内质网，而 HDEL_mRFP 细胞的内质网中没有金颗粒。比例尺：（A 和 B）3 µm，（C）1 µm，（D）500 nm。

笔记

进行种子灭菌时，您需要分别使用漂白剂和酸，以防止两种试剂意外混合。始终使用适当的防护设备，如手套和实验室外套。

食谱

1. 种子杀菌漂白液
将一片（含 1.5 g 活性漂白剂）溶解在 50 mL 蒸馏水中（3% w/v 活性漂白剂）

2. 用于育苗和嫁接的培养基
a. 用于幼苗的半强度 MS 培养基 (1 L)
MS 培养基 + 维生素：2.2 克
植物琼脂：8克
用 1 N KOH 溶液调节 pH 值至 5.8
烧瓶在 120°C 下高压灭菌 20 分钟
b. 嫁接用水介质
体积（毫升） 100 200 300 40 500 1,000
培养皿的大概数量 5个 10 15 20 25 50
琼脂（克） 1.6 3.2 4.8 6.4 8个 16

用 1 N KOH 溶液将 pH 值调节至 5.8。
烧瓶在 120°C 下高压灭菌 20 分钟
将高压灭菌的介质放入培养皿中，同时它仍然是热的和液体的。根据计划的移植物数量，只准备您需要的培养基量。

3. 20% BSA 溶液，用于 HPF 期间的冷冻保护
称取 0.4 克 BSA 并将其放入 2 mL 螺旋顶样品管中。
加入最多 2 mL 的水（或您的培养基）。
交替快速离心和涡旋，直到 BSA 完全溶解。
如有必要，加水至 2 mL 以获得 20% 的最终浓度。

4. Cryosubstitution 醋酸双氧铀原液（20%，500 µL）
称取 0.1 克醋酸双氧铀粉末（需要手套和防尘面罩），放入 2 mL 螺帽管中。
添加纯甲醇（在通风罩下）高达 500 μL。
用锡纸包裹试管，并在 -20°C 的专用低温替代箱中避光保存。

5. 3 mL 的冷冻替代混合物
化合物（初始浓度）体积（毫升）终浓度
醋酸双氧铀粉末（20% w/v 纯甲醇） 0.015 0.1%
纯丙酮 2.985 -

6. HM20 解决方案
在 FS Leica 塑料溶剂容器中制备溶液，并在使用前在 AFS 室中冷却10-15分钟。
HM20浓度 HM20 体积 (mL) 纯乙醇 (mL)
20% 2个 8个
50% 5个 5个
75% 7.5 2.5

7. 用于网格拍摄的 2% parlodion 解决方案
只在小玻璃瓶中准备少量的 parlodion，因为它对湿度非常敏感，不能长时间保存。
切割后称量一小块固体 parlodion（约 0.01 克）。
添加最多 1 mL 的乙酸异戊酯（存放在通风的溶剂柜中并远离潮湿）。
用锡纸包裹烧瓶并用封口膜密封盖子。
首次使用前，搅拌均匀溶液。始终密封盖子并避光。

8. 甲苯胺蓝溶液
在 20 mL 蒸馏水中加入 1 g 甲苯胺蓝粉和 1 g 硼酸钠制成库存溶液。
稀释 25 倍配制工作液。

9. 黄金基准解决方案
在 MilliQ 水中配制 0.5% BSA 的溶液。
用连接到注射器的 0.2 µm 过滤器过滤溶液。
在 0.5% BSA（1:1 比例）中混合胶体金溶液。分装在 0.5 mL 样品管中并储存在 -20°C。

致谢

博士学位CC 的论文由题为“Etude des mécanismes de l'union grefon”的赠款资助 /porte-greffe”，50% 来自法国国家农艺研究所/INRAE 部门“植物生物学和育种/BAP”，50% 来自法国 Région Nouvelle Aquitaine。同样来自 BAP 的入门资助“Etude des mécanismes de l'union greffon/porte-greffe”提供了进一步的财政支持。葡萄与葡萄酒科学研究所 (ISVV) 资助 CC 前往 Charles Melnyk 的实验室学习嫁接程序的旅行补助金。感谢 Charles Melnyk 和 Remi Lemoine 邀请我学习拟南芥的嫁接程序。该项目已根据欧盟的地平线 2020 研究和创新计划获得欧洲研究委员会 (ERC) 的资助（授予 AB 的第 852136 号赠款协议）。所有样品制备和成像均在波尔多成像中心 ( http://www.bic.u-bordeaux.fr/ )的 Pôle Imagerie du Végétale 上完成。

利益争夺

作者声明没有竞争利益

参考

Bell, K.、Mitchell, S.、Paultre, D.、Posch, M. 和 Oparka, K.（2013 年）。树脂包埋植物材料中荧光蛋白的相关成像。植物生理学161(4)：1595-1603。
Bidadi, H., Matsuoka, K., Sage-Ono, K., Fukushima, J., Pitaksaringkarn, W., Asahina, M., Yamaguchi, S., Sawa, S., Fukuda, H., Matsubayashi, Y ., 等。 (2014)。 CLE6 表达恢复赤霉素缺陷以促进拟南芥芽的生长。植物杂志 78(2)：241-252。
Chambaud, C.、Cookson, SJ、Ollat, N.、Bayer, E. 和 Brocard, L. (2022)。相关光电子显微镜方法揭示了移植物界面处的胞间连丝超微结构。植物生理学188(1)：44-55。
De Chaumont, F.、Dallongeville, S.、Chenouard, N.、Herve, N.、Pop, S.、Provoost, T.、Meas-Yedid, V.、Pankajakshan, P.、Lecomte, T.、Le Montagner , Y., 等人。 (2012)。 Icy：一个开放的生物图像信息学平台，用于扩展可重复研究。国家方法9(7)：690-696。
Dean, N. 和 Pelham, HR (1990)。蛋白质从高尔基体循环到酵母中的内质网。细胞生物学杂志 111(2)：369-377。
Dragwidge, JM, Wang, Y., Brocard, L., De Meyer, A., Hudeček, R., Eeckhout, D., Chambaud, C., Pejchar, P., Potocký, M., Vandorpe, M.,等。 (2022)。 AtEH/Pan1 蛋白在植物内吞作用期间驱动 TPLATE 复合物和网格蛋白聚合的相分离。 BioRxiv ，2022.03.17.484738。
Gautier, AT、Chambaud, C.、Brocard, L.、Ollat, N.、Gambetta, GA、Delrot, S. 和 Cookson, SJ（2019 年）。合并基因型：嫁接结合形成和接穗-砧木相互作用。 J Exp Bot 70(3)：747-755。
Gomez, RE、Chambaud, C.、Lupette, J.、Castets, J.、Pascal, S.、Brocard, L.、Noack, L.、Jaillais, Y.、Joubes, J. 和 Bernard, A.（2022 年） ). Phosphatidylinositol-4-phosphate 控制拟南芥中自噬体的形成。 Nat Commun 13(1)：4385。
Lindsey, BE, 3rd、Rivero, L.、Calhoun, CS、Grotewold, E. 和 Brkljacic, J.（2017 年）。拟南芥种子高通量灭菌的标准化方法。 J Vis Exp (128)：56587。
Knox, K.、Wang, P.、Kriechbaumer, V.、Tilsner, J.、Frigerio, L.、Sparkes, I.、Hawes, C. 和 Oparka, K.（2015 年）。挤压 Plasmodesmata：网状纤维在初级 Plasmodesmata 形成中的作用。植物生理学168(4)：1563-1572。
Kollmann, R. 和 Glockmann, C. (1985)。嫁接工会研究。 I. 属于不同不相关类群的植物细胞之间的胞间连丝。原生质体124(3)：224-235。
Kollmann, R. 和 Glockmann, C. (1991)。贪污结合研究——Ⅲ．关于移植物界面胞间连丝二次形成的机制。原生质体165(1-3)：71-85。
Kollmann, R.、Yang, S. 和 Glockmann, C. (1985)。嫁接工会研究——二．移植物界面不同区域的连续和半胞间连丝。原生质体126(1-2)：19-29。
Kremer, JR、Mastronarde, DN 和 McIntosh, JR (1996)。使用 IMOD 的三维图像数据的计算机可视化。 J 结构生物学杂志116(1)：71-76。
Kukulski, W.、Schorb, M.、Kaksonen, M. 和 Briggs, JA（2012 年a）。时间分辨电子断层扫描揭示了内吞过程中的质膜重塑。单元格150(3)：508-520。
Kukulski, W.、Schorb, M.、Welsch, S.、Picco, A.、Kaksonen, M. 和 Briggs, JA（2012 年b）。使用荧光基准标记对 lowicryl 切片进行精确、相关的荧光显微术和电子断层扫描。方法细胞生物学111：235-257。
Lee, H.、Sparkes, I.、Gattolin, S.、Dzimitrowicz, N.、Roberts, LM、Hawes, C. 和 Frigerio, L.（2013 年）。拟南芥网状结构和 atlastin 同系物 RHD3-like2 共同作用形成管状内质网。新植醇197：481-489。
Marion, J.、Le Bars, R.、Satiat-Jeunemaitre, B. 和 Boulogne, C.（2017 年）。优化植物细胞的 CLEM 方案：GMA 嵌入和冷冻切片作为拟南芥根中 GFP 荧光保存的替代方法。 J 结构生物学杂志198(3)：196-202。
Melnyk, CW (2017a)。拟南芥嫁接。方法 Mol Biol 1497：9-18。
Melnyk, CW (2017 b)。监测拟南芥中的血管再生和木质部连通性。方法 Mol Biol 1544：91-102。
Melnyk, CW、Gabel, A.、Hardcastle, TJ、Robinson, S. 和 Miyashima, S.（2018 年）。拟南芥移植物连接处的转录组动力学揭示了一种激活血管再生的组织间识别机制。美国国家科学院院刊115(10)。 https://doi.org/10.1073/pnas.1718263115 。
Melnyk, CW、Schuster, C.、Leyser, O. 和 Meyerowitz, EM (2015)。拟南芥中移植物形成和血管再连接的发育框架。当前生物学25(10)：1306-1318。
Molnar, A.、Melnyk, CW、Bassett, A.、Hardcastle, TJ、Dunn, R. 和 Baulcombe, DC (2010)。植物中的小沉默 RNA 在受体细胞中是可移动的和直接的表观遗传修饰。科学328(5980)：872-875。
Mudge, K. (2009)。嫁接史。园艺评论35：437-494。
Nelson B. 和 Nebenführ (2007)。一组多彩的体内细胞器标记，用于拟南芥和其他植物的共定位研究。植物杂志 51:1126-1136。
Nicolas, WJ、Bayer, E. 和 Brocard, L.（2018 年）。电子断层扫描研究植物组织中胞间连丝的三维结构——从高压冷冻制备到超薄切片采集。生物协议8(1)：e2681。
Notaguchi, M.、Kurotani, KI、Sato, Y.、Tabata, R.、Kawakatsu, Y.、Okayasu, K.、Sawai, Y.、Okada, R.、Asahina, M.、Ichihashi, Y. 等阿尔。（2020）。 β-1,4-葡聚糖酶可促进植物嫁接中的细胞间粘附。科学369(6504)：698-702。
Paul-Gilloteaux, P.、Heiligenstein, X.、Belle, M.、Domart, MC、Larijani, B.、Collinson, L.、Raposo, G. 和 Salamero, J.（2017 年）。 eC-CLEM：用于相关显微镜的灵活多维配准软件。国家方法14(2)：102-103。
Pina, A.、Cookson, SJ、Calatayud, A.、Trinchera, A. 和 Errea, P.（2017 年）。移植相容性的生理和分子机制。第 5 章蔬菜嫁接。原则和实践。 132-154。
Studer, D.、Graber, W.、Al-Amoudi, A. 和 Eggli, P. (2001)。一种通过高压冷冻冷冻固定的新方法。 J Microsc 203（第 3 部分）：285-294。
特恩布尔，中广核 (2010)。嫁接作为一种研究工具。方法 Mol Biol 655：11-26。
Turnbull, CG、Booker, JP 和 Leyser, HM (2002)。用于测试拟南芥长距离信号的微移植技术。植物杂志 32(2)：255-262。
Wu, R.、Wang, X.、Lin, Y.、Ma, Y.、Liu, G.、Yu, X.、Zhong, S. 和 Liu, B. (2013)。种间嫁接引起茄科植物 DNA 甲基化的广泛和可遗传的改变。 PLoS 一8(4)：e61995。
Yang, Y.、Mao, L.、Jittayasothorn, Y.、Kang, Y.、Jiao, C.、Fei, Z. 和 Zhong, G.-Y。 (2015)。嫁接葡萄树中接穗和砧木之间的信使 RNA 交换。 BMC 植物生物学15(1)：251。
Zhang, W.、Kollwig, G.、Stecyk, E.、Apelt, F.、Dirks, R. 和 Kragler, F.（2014 年）。反向重复诱导的 siRNA 信号的移植物可传递运动进入花中。植物杂志 80(1)：106-121。