材料与试剂
0.2 mL PCR 管（USA Scientific，目录号： 1402-2900）
灭菌、低保留、LTS 移液器吸头（ Rainin ，目录号：30389213、30389240、30389226）
1.5 mL Eppendorf Safe-Lock 离心管（USA Scientific，目录号：4036-3204）
Falcon 15 mL 锥形离心管（Corning 目录号：352097）
Falcon 50 mL 锥形离心管（Corning，目录号：352098）
Accutec剃须刀刀片（ ThermoFisher Scientific，目录号：S17302）
14 mL 培养管（Avantor/VWR，目录号：60818-689）
封口膜（ThermoFisher Scientific，目录号：S37440）
96 孔、细胞培养处理的平底微孔板（Corning，目录号：3903）
5 mL、10 mL、25 mL 和 50 mL 血清移液器（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-200279、sc-200281、sc-200283、sc-213234）
Countess 细胞计数室载玻片（ThermoFisher Scientific，目录号：C10228）
无菌 96 孔 V 形底聚丙烯板（Corning，目录号：3357）
50 mL、250 mL、500 mL 和 1000 mL Nalgene Rapid-Flow 无菌一次性真空过滤装置（ThermoFisher Scientific，目录号：5640020、5680020、5660020、5670020）
23G 无菌钝针（ThermoFisher Scientific，目录号：NC9031029）
NORM-JECT鲁尔锁无菌注射器（Avantor/VWR，目录号：53548-023）
90 微米尼龙网（Elko Filtering，目录号：03-90/49）
聚丙烯微量滴定管（“子弹头”）（ThermoFisher Scientific，目录号：02-681-376）
带细胞滤网盖的 5 mL 圆底聚苯乙烯（Corning，目录号：352235）
MultiScreenHTS HV 无菌滤板，0.45 µm（Millipore Sigma，目录号：MSHVS4510）
铝箔（Avantor/VWR，目录号：89125-940）
脱盐、定制合成的寡核苷酸（参见步骤 A1）
pCRISPRi /a v2 [ Addgene ，目录号：84832，并在Horlbeck 等人中描述。 (2016) , 储存于-20 °C ]
快速文摘 BstXI （ ThermoFisher Scientific，目录号：FD1024，储存于 -20 °C ）
FastDigest Bpu1102I/ BlpI （ ThermoFisher Scientific，目录号：FD0094，储存于 -20 °C ）
琼脂糖 LE（ Goldbio ，目录号：A-201-100）
SYBR Safe DNA 凝胶染料（ThermoFisher Scientific，目录号：S33102）
EZNA 凝胶提取试剂盒（Omega Bio-Tek，目录号：D2500-02）
EZNA 质粒 DNA 迷你试剂盒 I（Omega Bio-Tek，目录号：D6942-02，试剂盒的某些成分需要在 4 °C 下储存）
异丙醇（Millipore Sigma，目录号：59304）
1 kb DNA ladder（ Goldbio ，目录号：D010-500，在 -20 °C 下长期储存，在 RT 下短期储存）
KOPTEC 无水乙醇（Avantor/VWR，目录号：89125-172）
醋酸钠（Millipore Sigma，目录号：S2889）
TempPlate无裙边 96 孔 PCR 板，0.2 mL（USA Scientific，目录号：1402-9596）
粘性 PCR 板箔密封件（Avantor/VWR，目录号：60941-076）
醋酸钾（Millipore Sigma，目录号：P1190）
HEPES（ Goldbio ，目录号：H-400-100）
Tris 碱基（ Goldbio ，目录号：T-400-500）
浓盐酸（Avantor/VWR，目录号：JT9535）
氢氧化钾（Millipore Sigma，目录号：P5958）
醋酸镁（Millipore Sigma，目录号：M5661）
T4 DNA 连接酶（New England BioLabs ，目录号：M0202L，将酶和缓冲液储存在 -20 °C ）
One Shot Mach1 T1 抗噬菌体化学感受态大肠杆菌（ThermoFisher Scientific，目录号：C862003，储存在-80 °C ）
混合并开始！大肠杆菌转化试剂盒（ Zymo Research，目录号：T3001，试剂盒的某些成分需要在 4 °C 下储存）
LB 肉汤（Millipore Sigma，目录号：L3522）
羧苄青霉素（ Goldbio ，目录号：C-103-5，储存于-20 °C ）
LB-琼脂平板 carbenicillin-100（ Teknova ，目录号：L1010，在 4 °C 下储存）
Zyppy-96 质粒试剂盒（ Zymo Research，目录号：D4042，试剂盒的某些成分需要在 4 °C 下储存）
实验室标记物（ThermoFisher Scientific，目录号：13-379-4）
甘油（Millipore Sigma，目录号：G2025）
HEK-293T 细胞（ATCC，目录号：CRL-3126，储存在 -80 至 -150 °C ）
GlutaMax补充剂的 Gibco 高葡萄糖 DMEM （ ThermoFisher Scientific，目录号：10569010，4 ° C 避光保存）
GlutaMax补充剂的 Gibco 低葡萄糖 DMEM （ ThermoFisher Scientific，目录号：10567014，4 ° C避光保存）
热灭活胎牛血清 (FBS) ( Axenia Biologix ，目录号：F002，等分试样并储存在 -20 °C ）
脂蛋白耗尽的 FBS（Kalen Biomedical，目录号：880100，等分试样并储存在 -20 °C ）
人 3,3'-二十八烷基二甲羰花青低密度脂蛋白（ DiI -LDL ）（Kalen Biomedical，目录号：770230-9，4 ° C避光保存）
Clorox 漂白剂（Office Depot，目录号：217595）
慢病毒包装载体：pCMV-dR8.91 和 pMD2.G（ Addgene ，目录号：12259，描述于（Gilbert 等人，2014），储存在 -20 °C ）
ViralBoost试剂（ Alstem ，目录号：VB100，在 4 °C 下储存）
Opti-MEM I 还原血清培养基（ThermoFisher Scientific，目录号：31985062，避光储存在 4 °C ）
TransIT-LT1 转染试剂（ Mirus Bio，目录号：MIR2300，储存于 4 °C ）
嘌呤霉素（ Invivogen ，目录号：ant-pr-1，储存于 -20 °C ）
牛血清白蛋白（Millipore Sigma，目录号：12659，在4 °C 下储存）
无菌试剂容器（Corning，目录号：4870）
聚凝胺感染/转染试剂（ThermoFisher Scientific，目录号：TR-1003-G，储存在-20 °C ））
含酚红的胰蛋白酶-EDTA (0.25%)（ThermoFisher Scientific，目录号：25-200-114，长期储存在 -20 °C，短期储存在4 °C ）
磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，pH 7.4，无菌（ThermoFisher Scientific，目录号：10010049）
Accutase （Innovative Cell Technologies，目录号：AT104，长期储存在 -20 °C，短期储存在4 °C ）
Gibco 100 ×青霉素 - 链霉素（ThermoFisher Scientific，目录号：15140122，长期储存在-20 °C，短期储存在4 °C ）
DNase I（ Goldbio ，目录号：D-300-100，储存于 -20 °C ）
CRISPRi -ready细胞（dCas9-BFP-KRAB HepG2 细胞描述于（Smith 等人，2022），储存在 -80 至 -150 °C ）
Ghost Dye red 780（ Tonbo Biosciences，目录号：13-0865-T100，储存在-20 °C ）
人 LDLR Alexa Fluor 647 偶联抗体（R&D Systems，目录号：FAB2148R，储存于4 °C ）
人TfR Alexa Fluor 488 偶联抗体（R&D Systems，目录号：FAB2474G，储存于4 °C ）
二甲基亚砜（Millipore Sigma，目录号：D2650）
16% 甲醛溶液（Avantor/VWR，目录号：100503-917）
2 ×退火缓冲液（见配方）
50 × TAE 缓冲液（参见配方）
293T 生长培养基（见食谱）
病毒收获培养基（见食谱）
HepG2 生长培养基（参见食谱）
甾醇耗尽培养基（见食谱）
FACS 缓冲液 (FB)（参见配方）
DiI -LDL 标记培养基（见食谱）

设备
2 µL、20 µL、200 µL 和 1000 µL LTS Pipet-Lite XLS+ 手动单道移液器（ Rainin ，目录号：30386597）
10 µL、20 µL 和 200 µL Pipet-Lite XLS+ 手动 12 通道移液器（ Rainin ，目录号：17013807、17013808、17013810）
Pipet-Aid XP2（USA Scientific，目录号：4440-5010）
Milli-Q Direct 16 净水系统（Millipore Sigma，目录号：ZR0Q016WW）
ProFlex 3 × 32 孔 PCR 热循环仪（ThermoFisher Scientific，目录号：4484073）
Mini-Sub Cell GT 水平电泳系统和PowerPac基本电源（Bio-Rad，目录号：1640300）
带蓝光底座的 E-Gel 成像系统（ThermoFisher Scientific，目录号：4466612）
带 1.5 mL 微量离心管块的干式加热器（Avantor/VWR，目录号：75838-318、13259-286）
QIAVac 24 Plus 真空歧管（Qiagen，目录号：19413）
微量离心机（Eppendorf，目录号：5425）
NanoDrop 2000 紫外-可见分光光度计（ThermoFisher Scientific，目录号：ND-2000）
Heratherm紧凑型微生物培养箱（ThermoFisher Scientific，目录号：50125590）
New Brunswick Innova 44R 培养箱摇床（Eppendorf，目录号：M12820006）
Binder CO 2培养箱（Avantor/VWR，目录号：CB170）
涡旋混合器（Avantor/VWR，目录号：10153-838）
FiveEasy pH 计（Mettler Toledo，目录号：30266626）
-20 °C实验室冰箱（ ThermoFisher Scientific，目录号：02LFEETSA）
冰桶（Avantor/VWR，目录号：10146-188）
带有 SX4400 和 S606 转子的 Allegra X-30R 台式离心机（Beckman Coulter，目录号：B06320）
Scotsman FLAKER 制冰机（ CurranTaylor ，目录号：SCF1415A）
用于 0.2 mL PCR 管的铝合金冷却块（ThermoFisher Scientific，目录号：13-131-013）
实验室冰箱（ThermoFisher Scientific，目录号：TSG25RPGA）
超低温冰箱（ ThermoFisher Scientific，Forma 目录号：995）
Countess II FL 自动细胞计数器（ThermoFisher Scientific，目录号：A32136）
流式细胞仪，例如：带 HTS 采样器的LSRFortessa (BD Biosciences)、LSRII (BD Biosciences) 或CytoFLEX (Beckman Coulter)
高压灭菌机
组织培养罩
实验室显微镜（用于组织培养）
化学通风柜
软件
ApE ，一种质粒编辑器（描述于（Davis 和 Jorgensen，2022 年） https://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ ）
流式细胞仪采集软件： FACSDiva （BD Biosciences， https ://www.bdbiosciences.com/en-us/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software ）或CytExpert （Beckman Coulter， https://www. beckman.com/flow-cytometry/research-flow-cytometers/cytoflex/software ）
棱镜（GraphPad， https: //www.graphpad.com ）
FlowJo （BD Biosciences， https: //www.flowjo.com ）
Excel（微软， https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel ）

程序
先决条件：执行主要CRISPRi /a 屏幕并确定命中以进行进一步验证。

验证 sgRNA 慢病毒载体的克隆

注意：此克隆协议已从h ttps://weissman.wi.mit.edu/crispr/的资源中修改，为方便起见转载于此。
寡核苷酸设计
使用以下模板从所选供应商处订购标准脱盐寡核苷酸，以 100 µM 浓度预悬浮，每个 sgRNA 一对（“顶部”和“底部”）进行测试。寡核苷酸被设计为退火成BstXI和BlpI的双重消化物（图 1）。

核糖核酸模板LDLR 1 （示例）
原型间隔子(20 nt )N 1 ,N 2 …N 20GTTACCTGCAGTCCCCGCCG公司
“顶级”寡核苷酸（33 nt ）ttg (N 1 ,N 2 …N 20 ) gtttaagagc ttgGTTACCTGCAGTCCCCGCCGgtttaagagc
“底部”寡核苷酸（40 nt ）ttagctcttaaac (N 1 ,N 2 …N 20的 RC ) caacaagttagctcttaaacCGGCGGGGACTGCAGGTAACcaacaag
RC = 反补

图 1. pCRISPRi /a-v2 的载体图谱。突出显示了BlpI和BstXI的切割位点。

为“顶部”和“底部”寡核苷酸订购单独的 96 孔板，将配对排列在互补板的匹配孔中。
注意：此板中 sgRNA 目标的方向可以在整个协议中进行。最终表型实验应包含多个对照 sgRNA，包括那些预期会产生表型效应（生物对照）和那些预期会产生无效效应（非靶向对照）的 sgRNA。在 96 孔板的每一行的最后一个孔中包括非靶向控制，允许每个板进行八次生物复制（图 2）。

图 2 。 96 孔板的样品布局。每个实验样本都对应一个独特的 sgRNA，并为生物对照（预期会产生功能获得或丧失的 sgRNA）和非靶向对照（预期会产生无效效应的 sgRNA）保留空间。在全基因组筛选后，通常每个基因验证两个 sgRNA。

矢量消化
在 PCR 管中结合以下试剂。为每个所需的 5 µg 载体消化物设置单独的管。
试剂数量
10 × FastDigest绿色缓冲液5 µL
pCRISPRi /a-v25微克
BPI2.5 µL
BstXI2.5 µL
Milli-Q H 2 O总共 50 µL
注意：每个 96 孔板的 sgRNA 需要 5 µg 纯化的消化载体。

在 37 °C 的 PCR 热循环仪中孵育反应 1 小时。
在 80°C 下加热 10 分钟使反应失活。
在 TAE 缓冲液中运行的 0.7% 琼脂糖凝胶上解决整个消化，可视化并切除包含线性化载体的条带。根据制造商的说明，凝胶使用凝胶纯化试剂盒纯化切除的带。
NanoDrop紫外-可见分光光度计量化纯化、消化的载体的浓度。
寡核苷酸退火
使用多通道移液器将以下组件组合在新鲜的 96 孔 PCR 板中：
试剂数量
2 ×退火缓冲液20 µL
顶级寡核苷酸 (100 µM)0.8 微升
底部寡核苷酸 (100 µM)0.8 微升
Milli-Q H 2 O18.4 µL
总容积40 µL

在 95 °C 的 PCR 热循环仪中孵育反应 5 分钟。
在仍处于 95°C 时从热循环仪中取出板，并在工作台上冷却至室温 (RT) 15 分钟。
在新鲜的 96 孔 PCR 板中，在 19 µL Milli-Q H 2 O 中稀释 1 µL 退火寡核苷酸混合物。
注意：退火的寡核苷酸可以储存在-20 °C。
结扎
为每个 96 孔结扎板创建结扎主混合物，如下所示：
注意：创建两个主混合物允许 T4 DNA 连接酶与消化载体分开，直到存在寡核苷酸插入，减少自连接。
试剂最终量（每孔）MM 1 （每 96 孔板）MM 2 （每 96 孔板）
10 × T4 连接酶缓冲液（新鲜）1 ×60 微升40 µL
消化的pCRISPRi /a-v2 载体50纳克5微克-
T4连接酶0.5 µL-50 µL
Milli-Q H 2 O至 10 µL至 500 µL310 微升
总容积10 µL500 µL400 微升

对于放置在冰上的 96 孔 PCR 板的每个孔，等分 5 µL 结扎 MM 1 ，然后 1 µL 稀释退火寡核苷酸混合物，然后 4 µL 结扎 MM 2 。
密封板的顶部，并在16°C 下孵育过夜。
可选：孵育后，在 65°C 下热灭活 T4 连接酶 10 分钟。
转型
在冰上，等分 10 µL 的主管Mix & Go！ Mach1大肠杆菌细胞到 96 孔板的每个孔中。
注意：感受态大肠杆菌可以直接从供应商处获得，或者可以使用 Mix & Go!转化套件，根据制造商的说明。如果加热，感受态细胞将很快失去能力，因此快速移液。将接收板和移液器吸头预冷至4 °C也可以提高转化体的产量。
将每个结扎反应的 1 µL 添加到感受态细胞中。在冰上孵育 30 分钟。
如果使用 Mix & Go，则可选！细胞：在 42 °C的 PCR 热循环仪中将 96 孔板中的细胞热休克45 秒，然后立即放回冰中 2 分钟。
将 LB-羧苄青霉素琼脂平板分成 12 个部分。每个 96 孔板的 sgRNA 需要八个板。
在边缘发现 5 μL 的感受态细胞，并用移液器尖端向板的中心划线（图 3）。

图 3. 分区的 LB 琼脂平板。每个 LB 琼脂平板分为 12 个部分。转化后的混合物点在边缘，然后在分区内划线，以允许选择单个克隆。在分区区域内划线将降低质粒之间污染的风险。

在 37 °C 下孵育板过夜，以允许菌落生长。
注意：避免长时间孵育，因为非常大的菌落大小会使选择克隆变得困难并增加交叉污染的风险。
克隆质粒分离
从 Zyppy-96 质粒试剂盒中接种 96 孔培养块的每个孔，该试剂盒含有 760 μL 的 LB-carbenicillin（100 μg/mL），每个 sgRNA 编码质粒都有一个菌落。菌落采摘后将培养板储存在 4 °C。
注意：为每个 sgRNA 选择两个克隆进行小规模培养生长，每个克隆在单独的 96 孔块的相应孔中，将提高获得所需 sgRNA 序列的机会。
根据制造商的说明用透气盖密封板，并在摇床中以 220-300 rpm和37 °C孵育过夜（ 12-18小时）。
过夜生长后，制备甘油原液以方便质粒的再生。将 10 µL 的每种培养物转移到 PCR 板中的 10 µL 无菌 50% 甘油（在 H 2 O 中）。盖上板盖，并储存在-80 °C。
根据制造商的说明，使用 Zyppy-96 套件从 96 孔块中的培养物中分离质粒。
使用NanoDrop分光光度计确定分离质粒的浓度和纯度。
将用于 Sanger 测序的样本提交给选择的供应商。以下寡核苷酸可用作测序引物，以读出每个克隆的最终原型间隔序列：
5' - CGCCAATTCTGCAGACAAA-3 ' 。
使用序列比对软件 ( ApE ) 比对序列，并确定哪些菌落具有正确的 sgRNA 序列。
对于所选克隆都没有正确序列的 sgRNA，从储存的培养板上的单个菌落中选择四个额外的小规模（即 2-5 mL）培养物过夜，然后使用标准的 Mini-Prep 程序纯化质粒，和通过 Sanger 测序确认正确的测序。
获得所有所需的质粒后，在无菌组织培养罩中的新鲜 96 孔板中创建 sgRNA 传递质粒的主阵列。使用 Milli-Q H 2 O 或洗脱缓冲液将质粒浓度标准化为 25 ng/µL 。密封板，并储存在-20 °C 。
注意：如果需要，此阵列提供了重新定向 96 孔板中 sgRNA 的机会。

慢病毒生产

× 10 4 个细胞处理 96 孔板，加入 100 µL 生长培养基（含 10% FBS 的高葡萄糖 DMEM）。在 37 °C的 5% CO 2中过夜生长。
注意：目标是细胞在转染时达到 70% – 80% 的汇合度。要优化病毒生产，请使用以前未生长到过度汇合的低传代 HEK-293T 细胞。确认细胞在转染前形态正常。
在转染当天，在组织培养罩中的无菌 96 孔 V 底板中制备 DNA 和转染试剂，如下所示：
使用多通道移液器将每个标准化 sgRNA 向量（100 ng）的 4 μL 分装到无菌的 96 孔板中。
OptiMEM中分别制作包装质粒和包膜质粒以及稀释的转染试剂的主混合物。将转染试剂逐滴添加到OptiMEM中，然后轻轻轻弹试管进行混合。让稀释的转染试剂在室温下孵育 5 分钟。
试剂最终量（每孔）毫米1 （对于 120 孔）毫米2 （对于 120 孔）
pCMV-dR8.9190纳克10.8 微克-
pMD2.G11纳克1.32 微克-
反式LT10.6 µL-72
优化内存至 14 µL至 600 µL528 微升
总容积14 微升600 微升600 微升

简单地涡流质粒混合，并使用多通道移液器将其中的 5 μL 等分到板的每个孔中。
将 5 μL 的稀释转染试剂分装到板的每个孔中。简而言之，通过轻敲板的侧面来混合。覆盖板的顶部，并在 RT 下孵育 30 分钟。
使用多通道移液器，将所有 14 μL 的转染混合物转移到先前播种的 HEK-293T 细胞板的相应孔中。
5% CO 2下孵育细胞和 37 °C 6 – 8 小时。
C从每个孔中彻底去除转染混合物和生长培养基。小心更换为 100 µL 病毒收获培养基（含 11 g/L BSA 的生长培养基），辅以 1× ViralBoost （每 100 µL 培养基0.2 µL 500× ViralBoost ）。
注意：倾斜板并将尖端置于孔底部以避免吸出细胞。沿着井的一侧慢慢吸取更换介质，以避免移动细胞。
将板返回到 5% CO 2和37 °C 的培养箱中。
转染后 48 小时，再加入 100 µL 含有 1 × 对每个孔进行ViralBoost 。
可选：如果证明病毒产量不足，则可以进行双重收获：可以去除含有病毒的培养基，并用100 µL 新鲜病毒收获培养基（使用ViralBoost ）代替，条件培养基储存在 4 °C，待与随后的收获汇集在一起。
注意：用 10% 的漂白剂溶液净化所有与病毒接触的吸头。在通风橱中放一小容器漂白剂是处理吸头和收集废弃的含病毒液体的便捷方法。
– 72 小时收获含有病毒的上清液：
将培养基转移至无菌MultiScreenHTS过滤板，以 500 x g离心1 分钟，并回收含病毒的滤液。盖板并储存在 4 °C以供短期使用（24 小时内）；否则，储存在 -80 °C 。
注意：将CRISPRi /a-ready 细胞的转导时间安排在最终收获的当天，可以实现最高病毒滴度的转导。一般不需要正式滴定慢病毒，含有病毒的上清液可直接用于转导。
可选：如果过滤板不可用，可将培养基转移到无菌 96 孔 V 形底板中，并以 1,250 × g离心5 分钟以沉淀残留细胞或碎片。产生的上清液可以转移到新的平板上进行储存。
注意：如果需要更大体积的病毒上清液，则可以轻松扩展此程序以针对每个 sgRNA 转染一个以上的 HEK-293T 细胞 96 孔板。

CRISPRi /a-ready 细胞的转导

注意： CRISPRi (dCas9-BFP-KRAB) HepG2 细胞用于本协议，但任何粘附的CRISPRi /a-ready 细胞系都应适用于此程序。为了减少 HepG2 细胞随着时间的推移发生的结块，在传代时将细胞通过 20 – 23G 针头 3 次。
在转导前一天，在 96 孔板中的 100 μL 适当生长培养基中播种CRISPRi /a-ready 细胞。目标是在转导当天达到 50% 的汇合度。对于 dCas9-BFP-KRAB HepG2 细胞，在含 10% FBS 的低葡萄糖 DMEM 中每孔接种 5 × 10 4 个细胞。
注意：接种细胞密度将取决于特定的细胞大小和类型。
在转导当天，将聚凝胺添加到每孔 8 μg/mL 的最终浓度，同时考虑到 100 μL 的生长介质和额外的病毒上清液。将 10 mg/mL 聚凝胺原液的 40 µL 稀释到 460 µL 无菌 PBS 中，以获得 100 ×溶液，然后将其中的 1.5 – 2 µL 等分到每个孔中。
将 50 – 100 µL 的病毒上清液直接添加到每个孔中。
可选：通过在 RT 下以 800 × g离心板 60 分钟对细胞进行Spinfect ，以适度提高转导率。如果需要获得足够的转导，可以在旋转感染后去除培养基，并用新鲜培养基和额外的病毒上清液代替。
在 37 °C 下用 5% CO 2孵育细胞48 小时。
转导后 48 小时，将细胞按 1:2 分成新的 96 孔板：
从每个井中取出介质，并用 100 μL 的 PBS 清洗细胞。
通过添加 50 μL 的 0.25% 无菌胰蛋白酶-EDTA 溶液来分离单层。在 37 °C 下用 5% CO 2孵育5 – 10 分钟。
通过添加 150 μL 的生长培养基来淬火胰蛋白酶。通过上下吹打完全悬浮细胞。
将每种悬浮液（约 95 μL）的 50% 转移到新鲜的组织培养板中。
在 37 °C 下将板返回到含有 5% CO 2的培养箱中。
可选：如果细胞对胰蛋白酶特别敏感，请考虑用 50 μL 生长培养基淬灭胰蛋白酶，将细胞转移到无菌 96 孔 V 型底板，并在造粒细胞后去除含有胰蛋白酶的上清液（500 × g 5 分钟） .然后可以将细胞重新悬浮并转移到新鲜的组织培养板中。
分裂后二十四小时，选择使用嘌呤霉素成功转导：
小心地取出细胞顶部的条件培养基。
替换为终浓度为 2 µg/ mL 的含有嘌呤霉素的新鲜生长培养基。
在 37 °C 下将板返回到含有 5% CO 2的培养箱中。
注意：如果下游表型实验将直接比较同一孔内的转导细胞与非转导细胞（这可以通过含有 sgRNA 的pCRISPRi /a-v2 载体诱导的TagBFP水平来区分），则应省略嘌呤霉素选择。如果预计嘌呤霉素会导致不良表型，则添加过量的病毒可以确保转导细胞的百分比很高。在这种情况下，为了评估转导效率，应保留一个测试井用于嘌呤霉素选择，无论是在同一板块内还是平行培养。
嘌呤霉素选择后四十八小时，去除嘌呤霉素，并将细胞交换到新鲜的生长培养基中。
监测细胞生长并为表型实验准备细胞。当细胞接近汇合时，按照上述步骤分裂细胞。
注意：在此阶段，创建板的三个“副本”是有帮助的：1) 用于繁殖的维护板，2) 用于进行表型实验的实验板，以及 3) 冷冻培养基中的储存板（含有 10 的生长培养基） % DMSO) 可在 -150 °C 下长期储存。

细胞表型：受体标记

注意：低密度脂蛋白和转铁蛋白受体的表面水平在本协议中进行了评估，但任何抗体可检测细胞表面标记的标记应该是可行的。在可用流式细胞仪的检测能力范围内选择用于受体标记、 TagBFP水平和活/死染色的正交荧光团。对于每个板，包括一个用于每个单一染色控制和荧光减去一个（FMO）控制的井，以及两个用于完全未染色控制的井。亲本（即非 sgRNA 转导的） CRISPRi 就绪细胞通常可用于这些对照。还应包括两个额外的完全染色控制（包含控制 sgRNA），以评估流式细胞术开始和结束时的仪器漂移。这些额外的孔中的每一个都可以包含在板内或平行培养。
根据表型实验的需要，从 C 部分准备实验板，并避免过度汇合。对于 HepG2 衍生细胞，诱导甾醇饥饿会上调 LDL 受体丰度（Horton 等人，2002）。
注意：为了增加吞吐量，对实验板进行胰蛋白酶消化，并播种三个子板以一式三份地进行实验。
从细胞中取出介质，用 100 μL 的 PBS 清洗，并用每孔 75 μL 的甾醇耗尽介质（低葡萄糖 DMEM，含 5% 脂蛋白缺乏血清）替换。
将板放回含 5% CO 2的 37 °C培养箱中，孵育过夜。
收获细胞
从细胞中取出介质，并用 100 μL 的 PBS 清洗。
加入 40 μL 的Accutase ，并在 RT 的轨道振动筛上孵育板 15 分钟。
注意：与非酶促或物理解离方法相比， Accutase对通过抗体标记检测到的 LDL 或转铁蛋白受体的水平没有影响。确认这种分离方法不会影响感兴趣的表面蛋白/表位。
在每口井中加入 50 μL 的 FACS 缓冲液（含 1% FBS 和 10 U/mL DNase I 的 PBS），并用力上下移液以分离细胞。
通过贴在放置在冰上的 V 形底板顶部的 90 µm 尼龙网过滤细胞（图 4）。

图 4. 细胞过滤。过滤是最大化单峰和防止流式细胞仪堵塞的关键步骤。握住网状物的两侧使其保持拉紧，同时用移液器吸头轻轻按压网状物，使液体能够穿过网状物并进入孔中。如果液体积聚在网格顶部，它会与相邻的孔混合并污染。

× g离心板和 4 °C 1 – 2 分钟。移除网格并丢弃上清液。
注意：翻转板并快速但有力地向下摇动以去除上清液。细胞将保留在孔的底部。
通过将细胞重新悬浮在 200 μL 的 FACS 缓冲液中来清洗细胞。以 2,000 × g再次离心板和 4 °C 1-2分钟，并丢弃上清液。
用活/死染色标记细胞：
在 PBS 中以 1:1,000 稀释的 Ghost Red 780 染色的 50 µL 中重新悬浮细胞。遮光并在冰上的轨道摇床上孵育板 10 分钟。为活死染色阴性对照保留一个孔，为每个单染色抗体对照保留一个孔，为完全未染色的对照保留两个孔——这些孔应重新悬浮在 50 μL 的 PBS 中。
注意：活/死染色的选择取决于用于标记的荧光团。
添加 200 µL FACS 缓冲液，以 2,000 × g离心板和 4 °C 1 – 2 分钟，并弃去上清液。
通过将细胞重新悬浮在 200 μL 的 FACS 缓冲液中来清洗细胞。以 2,000 × g再次离心板和 4 °C 1-2分钟，并丢弃上清液。
用适当的荧光团偶联抗体标记细胞表面受体：
在 40 μL 的 FACS 缓冲液中重新悬浮细胞，其中含有 1:50 稀释的抗 LDLR-A647 和 1:100 稀释的抗 TFR-A488。遮光并将板在冰上的轨道摇床上孵育30-45分钟。为每个单染色抗体对照（LDLR 和 TFR）保留一个孔，为每个抗体阴性 FMO 对照（LDLR 阴性和 TFR 阴性）保留一个孔，为完全未染色的对照保留两个孔——这些孔应重新悬浮在 FACS 缓冲液中视情况含有 1:50 稀释的抗 LDLR-A647、1:100 稀释的抗 TFR-A488 或不含抗体。
注意：抗体和荧光团的选择取决于实验。所需的稀释和孵育时间也可能因抗体对其靶标的亲和力而异。
添加 200 µL FACS 缓冲液，以 2,000 × g离心板和 4 °C 1 – 2 分钟，并弃去上清液。
通过将细胞重新悬浮在 200 μL 的 FACS 缓冲液中来清洗细胞。以 2,000 × g再次离心板和 4 °C 1-2分钟，并丢弃上清液。
可选（固定）：在 50 µL PBS 中重悬细胞。在通风橱中，将甲醛添加到细胞悬浮液中，最终浓度为 4%。在 RT 下固定细胞 15 分钟。离心细胞，并将上清液丢弃在适当的废物容器中。用 200 μL 的 PBS 清洗细胞，再次离心，并将上清液丢弃在适当的废物容器中。然后可以如下重悬细胞，如果在 4°C 下储存，则可以重悬于 PBS 中。如果要使用的抗体与固定兼容，则可以在抗体标记之前进行固定。
将细胞重新悬浮在 75 – 100 µL 的 FACS 缓冲液中，然后转移到流式细胞仪进行分析。将盘子放在冰上并避光。
注意：如果细胞在标记后被固定和储存，而不是立即分析，则在流式细胞术之前立即重复过滤步骤。

细胞表型：配体摄取

注意：协议中评估了DiI标记的 LDL （ Loregger等人，2017）的摄取，但任何荧光标记颗粒的摄取都应适用于此程序。有关荧光团和对照的重要注意事项，请参阅 D 部分下的注释。
从 C 部分准备适合表型实验的实验板，并避免过度融合。对于 HepG2 衍生细胞，除了其丰度外，诱导甾醇饥饿还会上调 LDL 受体功能（Horton 等人，2002）。
从细胞中取出介质，用 100 μL 的 PBS 清洗，并用每孔 75 μL 的甾醇耗尽介质（低葡萄糖 DMEM，含 5% 脂蛋白缺乏血清）替换。
将板放回含 5% CO 2和 37 °C 的培养箱中，孵育过夜。
用标记的 LDL 处理细胞：
从细胞中取出介质，用 100 μL 的温暖 PBS 清洗两次，丢弃洗涤液。
在含有 0.5% BSA 的低葡萄糖 DMEM 中加入 50 μL 的DiI -LDL（5 μg/mL）。在没有光的情况下孵育用 5% CO 2在 37 °C下处理 1 小时。为每个单一染色阴性对照保留一个孔，为完全未染色的对照保留两个孔——这些孔应使用含有 0.5% BSA 且不含DiI -LDL 的低葡萄糖 DMEM 进行处理。
DiI -LDL 标记1 小时后，收获细胞：
从细胞中取出培养基，用含有 0.5% BSA 的 PBS 洗涤两次，然后用 PBS 洗涤一次。
按照上面的步骤 D.2.b 到 D.2.f 执行剩余的收获。
按照上面的步骤 D.3.a 到 D.3.c，用活/死染色标记细胞。
可选（固定）：按照上述步骤 D.5 固定细胞。
将细胞重新悬浮在 75 – 100 µL 的 FACS 缓冲液中，然后转移到流式细胞仪进行分析。将盘子放在冰上并避光。

流式细胞术

注意：此协议旨在作为流式细胞仪分析的一般指南。遵循可用仪器的特定指南和说明。如果可能，请选择一种接受 96 孔板样品的仪器，以及合适的激光和通道来读出感兴趣的荧光团。如果机器上没有 96 孔板适配器，则可以通过转移到低容量 (1.2 mL) FACS 管（即“子弹”管）并放置在典型的 5 mL FACS 中来顺序运行样品管进行分析。
准备机器：
如有必要，清空废物容器，并添加漂白剂以填充约 10% 的容器体积。如果需要，重新填充鞘液储液器。
打开流式细胞仪及其相关计算机，并登录流式细胞仪软件（即FACSDiva 、 CytExpert等）。
为仪器执行适当的启动程序，通常包括启动流体和使用校准珠执行质量控制。
开始您的流式细胞术实验：
注意：确保细胞避光，直到准备好进行分析。活细胞也应保留在冰上直至分析。
在软件程序中打开一个新的实验。为您感兴趣的荧光团启用适当的通道和过滤器。
我。 TagBFP ： ex = 402 nm， em = 457 nm。
二. Alexa-488： ex = 490 nm， em = 525 nm。
三. DiI ： ex = 550 nm， em = 569 nm。
四. Alexa-647： ex = 650 nm， em = 665 nm。
v. Ghost Red 780： ex = 757 nm， em = 779 nm。
注意：查看荧光团的激发和发射光谱很重要，以确定合适的激光器和滤光片组。当在单个实验中使用多种颜色时，重叠的荧光团光谱可能会导致波长超出最大值，从而导致更具体的读数。如果获得单染色对照，可以在数据分析步骤中应用重叠光谱的补偿。
创建以下箱形图以适当地设置单元格：
我。前向散射区域 (FSC-A) 与侧向散射区域 (SSC-A) 的对比，以选择尺寸。
注：FSC 和 SSC 通常绘制在线性刻度上。
二.前向散射高度 (FSC-H) 与 FSC-A，用于双峰门。
注意：绘制前向散射宽度 (FSC-W) 与 FSC-A 或侧向散射高度 (SSC-H) 与 SSC-A 的关系图也可用于双峰门。
三. FSC-A 与活死通道（即， Ghost Red 780) 区域，用于检测活细胞/死细胞。
注意：荧光通道通常绘制在对数刻度上。
四. FSC-A 与TagBFP通道，用于成功转导细胞的门控。
v. 根据实验需要，额外的 FSC-A 与荧光团通道（即 Alexa-488、 DiI或 Alexa-647）。
注意：荧光团通道的直方图也可能有助于样品的实时评估。
六.荧光团与荧光团图，适用于具有两个或多个标记的实验染色的细胞。
七.绘制初步门（图 5），以提供实验读数的实时估计。

图 5. 流式细胞术的门控策略。表达 sgRNA 的 dCas9-BFP-KRAB HepG2 群体的代表性示例，具有细胞的顺序门（SSC-A 与 FSC-A，绿色门）、单细胞（SSC-H 与 SSC-A，门在紫色）、活细胞（FSC-A 对比 Ghost Red 780，橙色门）和 BFP+ 细胞（FSC-A 对比TagBFP ，蓝色门）。

调整实验的增益和电压，以实现适当的门控
我。打开仪器设置面板以调整适当通道的电压。
注意：电压调整仪器上检测器的灵敏度，较高的值会增加图轴上的事件值。与维护流式细胞仪的科学家讨论感兴趣的细胞类型的起始电压，因为这些通常取决于细胞大小。通常，旨在调整电压，使负事件的范围在任意单位的 10 1和 10 2之间，并且正事件可以清楚地识别，但仍保持在仪器的检测范围内。
二.将未染色的亲代细胞和完全染色的对照细胞各转移一口井至流式细胞仪使用的 96 孔板。
注意：在运行样品之前通过上下吹打重悬细胞，以防止细胞沉降。如果流式细胞仪上没有可用的 96 孔板模块，请将细胞转移到 1.2 mL“子弹头”管中，该管可装入典型的 5 mL FACS 管中（较大的 5 mL FACS 管可重复用于每个样品）。
三.开始以低速运行未染色的样本，并实时监控读数，但不记录数据。
注意：一旦建立电压就停止细胞流动，否则机器将继续吸出细胞并且在记录数据之前样品将被完全消耗。
四.调整 FSC 和 SSC 电压，将大部分细胞带入门控区域。根据需要实时调整浇口。
注意：碎片应该最终出现在 FSC-A 与 SSC-A 图的左下角，在单元门之外。
v. 调整TagBFP以外的活性荧光通道电压，使未染色细胞的值介于 10 1和 10 2之间。
六.调整TagBFP荧光通道电压，使未染色的亲本细胞的值介于 10 2和 10 3之间。
注意：亲代细胞包含 dCas9-TagBFP-KRAB 融合，并且对TagBFP呈阳性。然而，含有来自CRISPRi /a 载体的游离TagBFP蛋白的细胞的亮度明显高于具有TagBFP融合的亲代细胞。这允许从非转导细胞中区分转导细胞。
七.以低速运行完全染色的控制样本，并实时监控读数，但不记录数据。
八。确认 FSC 和 SSC 电压适用于完全染色的样品。
九。调整有源荧光通道电压，以实现能够清晰区分信号的值分布，同时保持在仪器检测的动态范围内。
注意：对于活死染色，最阳性的荧光细胞是无活力的，将被排除在分析之外。
X。保存软件上的实验模板以及仪器的电压，以便将来的实验可以轻松地重新加载。
运行并收集控制和实验样本的数据：
我。在软件上，为每个控制和实验样本创建和标记井（或“管”）。
二.设置从每个孔吸出的体积和运行样品的速度。
注意：预计在每个孔中留下约 10 µL 的样品，以避免将空气吸入流体管线。如果样品浓度更高并以更低的体积重新配制，样品将运行得更快。如果以更高的速度运行，样本也会运行得更快，但读数的准确性可能会降低。对于样品和使用的特定机器，这应该根据经验来确认。
三.设置要记录的事件数。通常，这是 1 × 10 5 事件总数，但如果需要（例如，如果可用于记录的细胞太少），或者如果需要“门控”事件（即细胞）的总数，则可以减少此数量。
四.突出显示并选择具有未染色细胞、亲本细胞和完全染色对照的水井。如果机器上可用，请使用自动记录功能运行这些示例。
注意：将实验开始时完全染色的控制结果与结束时的结果进行比较，将评估荧光通道中的任何漂移。
v. 使用多通道移液器，将一排细胞（12 孔）转移到 96 孔板中，用于流式细胞仪。
注意：对于活细胞，一次转移一行可以让细胞在冰上停留更长时间，直到准备好进行分析。对于固定细胞或流式细胞仪的 96 孔板模块是温度控制的，则不需要这样做。在每一行的末尾包括一个非靶向控制井，允许在收获和标记后在相似时间点分析的控制和实验 sgRNA 之间进行直接比较。
六.突出显示并选择要运行的孔。使用自动记录功能来运行和记录样品。
七.在实验结束时运行并记录最终的完全染色控制。
运行所有样品后，对仪器进行清洁和去污：
我。将每个井的原始数据导出为 .fcs 文件以进行数据分析。
注意：如果需要，也可以在机器的软件上进行数据分析。
二.运行仪器的清洁协议：
1).对于 96 孔板，这通常涉及 3-5个10% 漂白剂的孔，然后是 5 个水孔。
2).对于单个试管，这通常需要用 10% 漂白剂管高速冲洗 3-5 分钟，然后高速冲洗 5 分钟。
三.根据关机协议关闭机器。
数据分析

将原始流式细胞术数据导入FlowJo分析软件，为实验样本、生物对照和非靶向对照创建组。
将来自给定板的所有非目标控制井文件的数据连接到一个单独的文件中。将此文件导入非目标控件组。
注意：此步骤创建一个控制样本，其中包含整个板上非靶向控制孔的所有事件。这可以提高检测实验 sgRNA 表型效应的灵敏度，前提是在实验过程中没有明显的荧光团漂移。否则，串联文件可能会掩盖真实效果。
可选：根据实验需要导出新参数。示例包括比例荧光水平（例如Alexa-648 LDLR /Alexa-488 TFR ）和针对细胞大小校正的荧光水平（例如Alexa-648 LDLR /FSC-A）。这些派生参数允许在单细胞水平上进行比例读数。
从第一个分析的非靶向 sgRNA 控制中打开文件，绘制门并执行模板分析：
细胞门（FSC-A vs SSC-A）、单峰（FSC-H vs FSC-A）、活细胞（FSC-A vs Ghost Red 780）和转导（FSC-A vs TagBFP ），并将轴调整为在联邦调查局。（见图 5）。
注意：活死细胞或转导细胞的门控也可以分别在 Ghost Red 780 或TagBFP通道的直方图上执行。这种门控应用起来更简单，但不考虑与细胞大小相关的通道输出差异。
在完全封闭的人群中，打开实验荧光通道和派生参数的直方图，以可视化数据的传播。
将所需的统计数据（即总计数、平均值、中值和标准偏差）应用于完全门控群体的所需荧光通道和派生参数。
通过将第一个非靶向 sgRNA 控制井与实验的最后一个非靶向 sgRNA 控制井进行比较，评估实验漂移。
注意：由于仪器漂移或荧光团随时间褪色，可能会出现这些样品之间的差异。两者都可以通过使用行匹配控件或匹配良好的非转导控件来最小化。
对两个孔应用相同的门和统计数据。
在箱形图和直方图上叠加来自两个井的数据，以可视化和定性评估任何差异。
量化荧光团通道的差异：
我。选择第一个控件的完全门控种群（转导的、活的、单线态细胞）后，在FlowJo中打开“比较种群”工具。
二.将最后一个非目标 sgRNA 控件的相同门控种群拖到“比较种群”窗口中。
三.选择所需的参数通道进行比较，以获得Tχ指标。
注意： Tχ指标将提供人口不同的统计可能性，但并不意味着存在生物学差异。统计检验必须与直方图的定性可视化以及对实验细节的了解相结合，以推断生物学效应是否显着。
确定每个荧光团通道的背景荧光。
将门和统计数据应用于每个实验参数（即 Alexa-488、 DiI或 Alexa-647）的 FMO 阴性对照样本。这些值的平均值和中值表示背景荧光。
如果 FMO 控制不可用，则可以使用完全未染色的控制。但是，只有使用 FSC 和 SSC 参数创建的门可用于识别所需的单元格。
评估是否由于通道之间的荧光“溢出”而需要额外补偿。
将 FMO 控件中的实验参数与完全染色的控件进行比较。对这些控件应用相同的门控和统计数据（如果尚未完成）。
将每个完全门控 FMO 控制的数据叠加到实验参数直方图中的完全染色控制，以定性评估差异。与 FMO 控制相比，完全染色控制中特定通道中直方图的偏移表明溢出。
可选：如果需要，可以通过比较人口来量化差异，如步骤 5.c 中所示。
FlowJo软件中的单染色控件创建补偿矩阵。然后可以将该矩阵应用于整个分析。
将每个实验样本中的实验参数与对照人群进行比较。
使用非靶向 sgRNA 作为对照：
我。将门和统计信息应用于第一个实验样本。
二.选择第一个实验样本的完全门控种群后，打开FlowJo中的“比较种群”工具。
三.将串联的非目标 sgRNA 控件的相同门控种群拖到“比较种群”窗口中。
四.选择所需的参数通道进行比较，以获得Tχ指标。
v. 将第一个实验样本的门控、统计和比较应用于所分析板的每一行的第一个实验或生物对照样本。
六.对于这些样本中的每一个，使用来自同一行板的非靶向 sgRNA 控制重复“比较人口”分析。
七.将分析的板的每一行中的第一个实验样本中的所有门、统计数据和比较应用于该行中的其余孔。
注意：第一次比较将针对串联文件进行，适用于所有实验或生物对照样本。第二个比较是与行匹配的非靶向 sgRNA 对照。
使用来自同一孔的非转导细胞作为对照：
注意：这种比较具有比较在同一孔中生长的细胞的优势，但如果进行了嘌呤霉素选择，则不能使用。
我。在第一个非靶向 sgRNA 控制样本中选择活细胞群（Ghost Red 780 阴性）。
二.在TagBFP + （转导）和TagBFP - （非转导）细胞上应用实验参数所需的统计数据。
三.执行TagBFP +单元格的“比较人口”分析到TagBFP -此示例的单元格，如 8.a 中所示。
四.对实验中执行的每个实验和控制样本应用相同的统计和比较。
以表格格式导出数据。在FlowJo中打开表格窗口，然后选择要导出的所需统计信息和比较指标。通常，这将包括每个总体的平均值、中位数、标准差、总计数和比例计数，以及每个比较的Tχ指标。
可选：为任何所需的生物控制或实验样本创建直方图的图形比较 [见图。 Smith 等人的 S1B 和 C、S5A–C、S7A 和 B、S9A&B、S10A–D 和 S11A–H 。 (2022)例如]。在FlowJo中打开布局窗口，将所需的种群拖到窗口中以创建所需的直方图。鉴于实验中分析的样本数量，每个样本的比较无法在单个图表上解释。
为了在给定实验中进行比较，请评估各个 sgRNA 的以下内容：
使用门控事件的总数来评估给定井中的数据是否可解释。
我。总门控计数 < 10% 的非靶向控制孔可能存在偏差，代表人口样本不足，应谨慎解释。
二.总门控计数低但活细胞比例正常表明孔存在技术问题。考虑审查这些井的数据。
三.活细胞比例低的总门控计数低表明 sgRNA 或基因敲低的毒性。
对于可解释的井，使用Tχ度量来评估效果的显着性。生物对照的Tχ指标可用作将统计显着性与效应的生物学相关性相关联的基准。
将每个实验参数的表格数据的统计数据（中位数、标准偏差、总计数）导入数据分析软件（例如 Prism）。
注意：考虑到流式细胞术直方图中通常存在的偏斜曲线，中位数而不是均值可能更好地代表数据。
标准化每个 sgRNA 的数据，使用背景荧光作为最小值和适当控制的结果（即，连接的非靶向 sgRNA 孔、行匹配的非靶向 sgRNA 孔或匹配良好的非转导样品）作为最大值。对这些控件中的每一个重复规范化。
注意：数据的标准化允许跨实验组合和比较数据。
通过对所选控件执行多个 t 测试来比较数据，调整多个比较测试的重要性。生物对照的效应强度（即倍数变化）和调整后的p值可用作实验 sgRNA 的基准。
要比较多个实验，请将规范化的表格数据导出到电子表格中。
注意：流式细胞术允许在单细胞水平上进行评估，因此每个“事件”都可以被视为生物复制。尽管如此，请考虑至少对实验进行三次重复，以确保结果的稳健性。
（Higgins 和 Green，2011 年）合并多个实验中的归一化数据ADDIN CSL_CITATION {"citationItems":[{"id":"ITEM-1","itemData":{"abstract":"Higgins JPT, Green S (editors). Cochrane Handbook for Systematic Reviews of Interventions Version 5.1.0 updated March 2011. The Cochrane Collaboration, 2011. Available from www.cochrane-handbook.org.","author":[{"dropping-particle":"","family":"Higgins JPT","given":"Green S (editors).","non-dropping-particle":"","parse-names":false,"suffix":""}],"container-title":"The Cochrane Collaboration ","id":"ITEM-1","issued":{"date-parts":[["2011"]]},"title":"Cochrane Handbook for Systematic Reviews of Interventions Version 5.1.0 ","type":"webpage"},"uris":["http://www.mendeley.com/documents/?uuid=6fb66f00-854b-457d-af48-ae5e941e664e"]}],"mendeley":{"formattedCitation":"(Higgins JPT, 2011)","manualFormatting":"(Higgins and Green, 2011)","plainTextFormattedCitation":"(Higgins JPT, 2011)","previouslyFormattedCitation":"(Higgins JPT, 2011)"},"properties":{"noteIndex":0},"schema":"https://github.com/citation-style-language/schema/raw/master/csl-citation.json"}，如下所示：

Let N=counts,M=mean or median,and SD=standard deviation

N_combined=N_1+N_2
（等式 1）

M_combined=((M_1 × N_1 ) + (M_2 × N_2 ))/(N_1 + N_2 )
（等式 2）

SD_combined= √(((N_1 - 1) 〖SD_1〗^2 + (N_2 - 1) 〖SD_2〗^2 + □((N_1 × N_2)/( N_1 + N_2 ))(〖M_1〗^2+ 〖M_2〗^2-2M_1 M_2))/(N_1 + N_2 - 1))
（等式 3）

跨重复实验迭代组合数据。
根据需要，将组合的标准化数据导入 Prism，然后重复步骤 14。
来自单个或组合实验的数据可以在 Prism 中进行 log 2转换，然后在热图中可视化（图 6）。

图 6. sgRNA 验证结果的代表性热图。显示受体丰度（对于 LDLR、TFR 和 LDLR/TFR 比率）和荧光 LDL 吸收的 dCas9-BFP-KRAB HepG2 细胞的热图，这些细胞用针对每个指示基因的 sgRNA 转导，如上述协议中所述。在此图中，命中率首先根据对 LDLR 丰度的定向影响进行分组，然后根据对 LDL 摄取的影响进行分组。作为已知对照靶向的基因显示在右侧。读数显示与阴性对照 sgRNA 转导相比的 log 2倍变化，并代表两个独立 sgRNA 效应的加权平均值。活力表示在实验中流式细胞术分析存活的细胞的相对数量。显示的所有基因都有两个 sgRNA 独立验证 LDLR 丰度，在 Holm - Sidak校正的 t 检验中定义为 p <0.05。数据代表来自四个独立实验的汇总信息。从Smith 等人修改的图。 (2022) 。

笔记

一些在线资源可用于评估荧光团的光谱重叠和设计流式细胞术实验，包括FPbase ( https://www.fpbase.org ) (Lambert, 2019)和ThermoFisher Scientific 的 Fluorescence SpectraViewer ( https://www.thermofisher .com/order/fluorescence-spectraviewer ）。
，流式细胞仪分析软件（例如FlowJo ）可用于自动补偿重叠荧光团。

食谱

2 ×退火缓冲液
200 mM 醋酸钾
60 毫米 HEPES-KOH pH 值 7.4
4 毫米醋酸镁
为了获得合适的 pH 值，首先制备 1 M 的 HEPES 储备溶液，并用 KOH 将 pH 值调节至 7.4，然后进行无菌过滤。然后，将三种试剂与适量的 Milli-Q H 2 O 混合，制成 2 ×退火缓冲液。储存在 RT。

50 × TAE 缓冲液
50 毫米乙二胺四乙酸
2 M 三聚糖
1M 醋酸
将固体 Tris 碱与固体 EDTA 二钠混合，并完全溶解在 3/4 的 Milli-Q H 2 O 总体积中。EDTA 仅在弱碱性 pH 值下溶解，因此试剂的添加顺序很重要。溶解后，加入冰醋酸，用 Milli-Q H 2 O 定容至最终体积。最终缓冲液的 pH 值应接近 8.6，无需调整。储存在 RT。

293T培养基
将 50 mL 的 FBS 添加到 500 mL 的高葡萄糖 DMEM 中（10% v/v）。储存在4 °C。

病毒收获培养基
每 100 mL 生长培养基添加 1.1 g BSA，然后添加 1/100 体积的 100 ×青霉素-链霉素。溶解并无菌过滤。储存在4 °C。

HepG2 生长培养基
将 50 mL 的无菌 FBS 添加到 500 mL 的低葡萄糖 DMEM 中（10% v/v）。储存在4 °C。

甾醇耗尽培养基
将 25 mL 的脂蛋白缺乏血清添加到 500 mL 的低葡萄糖 DMEM（5% v/v）和无菌过滤器中。储存在4 °C。

流式细胞仪缓冲区 (FB)
向无菌 PBS 中加入 1/100 体积和 10 U/mL DNase I。混合溶解，然后无菌过滤。储存在4 °C。

DiI -LDL 标记培养基
将 0.5% w/v BSA 添加到无血清低葡萄糖 DMEM 中。混匀溶解，过滤除菌。储存在4 °C。

致谢

JSC 获得 NIH/NHLBI（K08 HL124068、R03 HL145259、R01 HL146404、R01 HL159457）、NIH/NIGMS（R21 141609）、辉瑞 ASPIRE 心血管奖、哈里斯基金和研究评估与分配委员会的资金支持加州大学旧金山分校医学院。 AP 从烟草相关疾病研究计划 (578649)、AP Giannini 基金会 (P0527061)、NIH/NHLBI (K08 HL157700)、Michael Antonov 慈善基金会和 Sarnoff 心血管研究基金会获得资金支持。该协议源自Smith 等人描述的原始研究并得到验证。 (2022) 。我们感谢Matvei Khoroshkin对协议实施的反馈，Kevan Shokat和Shokat实验室的成员进行了有益的讨论。

利益争夺

Gilde Healthcare 和Eko的咨询费，与已发表的作品无关。其他作者没有披露。

伦理

该协议中未使用任何人类或动物受试者。

参考

Bock, C., Datlinger , P., Chardon, F., Coelho, MA, Dong, MB, Lawson, KA, Lu, T., Maroc, L., Norman, TM, Song, B., 等。 (2022)。高内涵 CRISPR 筛选。 Nat Rev 方法 Prim 2(1)：8。
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