材料与试剂
1. 96 孔板，透明（ Corning，目录号：3365 ）
2. 24 孔板，透明（ Corning，目录号：3537 ）
3. T25 烧瓶（Corning，目录号：430639）
4. HEK-293 T( ATCC, CRL-11268 )
5. Dulbecco 改良的 Eagle 培养基（ DMEM）（Gibco，目录号： 31600-083 ）
6. 胎牛血清（FBS ）（Gibco，目录号： 10270-106）
7. 0.25% 胰蛋白酶-EDTA
8. 1%（vol/vol）青霉素和链霉素溶液（Beyotime Inc.，目录号： ST488-1/ST488-2）
9. 对硝基苯磷酸盐（生工生物，CAS：333338-18-4）
10. L-高精氨酸（生工生物，CAS：1483-01-8）
11. MgCl 2 ·6H 2 O（生工生物，CAS：7791-18-6）
12. 二乙醇胺（生工生物， CAS：111-42-2）
13. NaCl （生工生物，CAS：7647-14-5）
14. 氯化钾（生工生物，CAS：7647-40-7）
15. Na 2 H PO 4 （生工生物，CAS：7558-79-4）
16. KH 2 PO 4 （生工生物， CAS： 7778-77-0）
17. 盐酸（国药集团化学试剂股份有限公司， CAS： 7647-01-0）
18. 聚乙烯亚胺（PEI，分子量 40,000，储备溶液 1 mg/mL，在 ddH 2 O 中）（Polysciences，目录号：24765）
19. 1 × PBS （见食谱）
20. 2 × SEAP 测定缓冲液（参见配方）
21. 底物溶液（见配方）
22. 质粒（见表 1）

表 1. 本研究中设计和使用的质粒
质粒描述和克隆策略参考
pXY137 组成型哺乳动物 BldD 和 BphS 表达载体 (ITR-P hCMV -p65-VP64-BldD-pA-PhCMV-BphS-P2A-YhjH-pA-ITR) 邵等。 (2017)
pZQ5 远红光诱导表达载体（2*crRNA结合位点-P hCMVmin -SEAP-pA），这个作品
pZQ28 组成型 crRNA2 SEAP表达载体 (P U6 -crRNA SEAP - pA) 这个作品
pZQ113 组成型哺乳动物P hCMV驱动的表达载体 (P hCMV-scFv- 45bp linker-p65-HSF1-pA) 这个作品
pZQ116 远红光诱导表达载体 (P FRL2 -dAsCas12a-NLS-10×GCN4-pA; P FRL3 , (OwhiG) 2 -P hCMVmin ) 这个作品

设备

1. 水浴
2. CO 2培养箱
3. 恒温培养箱（65 摄氏度）
4. Synergy H1 混合多模式酶标仪（BioTek Instruments, Inc.）
5. 多通道移液器
6. 试剂槽
7. 器（默克公司，目录号：Z359629 ）

软件

1. Excel（微软）
2. Gen5 软件（版本：2.04）

程序

细胞培养

1. 在37°C水浴中加热添加 10%（vol/vol）FBS 和 1%（vol/vol）青霉素和链霉素溶液（以下简称完全DMEM）和1×PBS的 DMEM 至少 15 分钟。
2. 清洗约 90% 汇合的人胚胎肾细胞 (HEK-293T) ，吸出 PBS，并加入 0.5 mL 的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA。
3. 将细胞在 37°C 的 5% CO 2培养箱中孵育 3 – 5 分钟，加入 3 mL 预热的完整 DMEM，并将细胞悬液转移到 15 mL 无菌锥形管中。
4. 在室温下以 300 x g的速度将细胞旋转3 分钟，丢弃上清液，并将细胞颗粒重新悬浮在 15 mL 的完整DMEM 中。
5. 2的潮湿环境中孵育三天，然后再次传代。

细胞转染

1. 应在转染前一天（第 1 天）制备 293T 细胞悬液（如细胞培养程序中所述）（图 1 ）。

图 1 。细胞转染和SEAP分析的时间表示意图

2. 使用血细胞计数器计数细胞，在 24 孔细胞培养板中每孔接种 6 × 10 4 个HEK-293T 细胞；培养 18 h。
3. 第二天（第 2 天），按如下方式准备转染组合：
a. 将 500 ng 相应的质粒（见表 1）添加到50 μL的无 FBS 和无抗生素的 DMEM 培养基中，用于 24 孔板的每个孔。
b. 加入1.5 μL PEI（1 μg/μL，PEI与DNA按3:1的比例）加入上述质粒DNA溶液中。
c. 要扩大规模，请将数量乘以重复次数。
4. 剧烈涡旋 30 s。
5. 在室温下孵育 DNA-PEI 混合溶液 15 分钟。
6. 将 50 μL 的转染混合物滴加到每个孔中。轻轻摇动载玻片几次，并在 37 °C的含 5% CO 2的潮湿环境中孵育。
7. 转染后 6 小时，将培养基更换为新鲜的完全 DMEM，并将 24 孔板置于 5% CO 2培养箱中 37°C 孵育至第 3 天。
8. 在第 3 天，转染的幻灯片可用于执行 SEAP 记者检测。

SEAP 报告分析

1. 从每个样品中吸出 200 μL 细胞培养上清液，并转移到 96 孔板的腔室中。
2. 热灭活细胞培养上清液 30 分钟。
3. 在 37°C 下预热 2× SEAP 测定缓冲液（参见食谱）并避光。
4. 在黑暗中将 100 μL 的 2× SEAP 缓冲液与 20 μL 的底物溶液（参见食谱）混合。
5. 将120 μL 上述混合底物溶液加入 80 μL 热灭活细胞培养上清液中。每组至少应重复三次。在 SEAP 存在的情况下，介质的颜色将从粉红色变为橙色（图 2 ）。

图 2。在照明后的指定时间点检测 SEAP 的产生。在 SEAP 存在的情况下，介质从粉红色变为橙色。黄色强度与光照时间相关。

6. 使用多模式酶标仪在 37 °C下测量 405 nm 的吸光度15 分钟。有关详细过程，请参见图 3 。

图 3. SEAP 报告基因分析示意图

7. 使用数据点计算 SEAP 活动的水平，这些数据点产生的光吸收率随时间呈线性变化。（如果可用，计算机连接的动力学 ELISA 酶标仪是最方便的，因为这将精确计算微孔板所有 96 个孔中 A 405随时间的线性变化。）

数据分析

对于每个光照时间，数据表示为平均值±标准差（SD）； n = 3 个独立实验。数据也可以表示为与未刺激细胞相比的倍数变化差异并通过单向方差分析进行分析，然后进行 Tukey 的事后检验。使用 GraphPad Prism 或其他软件进行统计分析。

图 4.远红光诱导 SEAP 表达动力学的量化。转染的 HEK-293T 细胞用远红光照射不同时间段（0-120 分钟）。在光照后 24 小时对培养物上清液中的 SEAP 产量进行分析。 **P < 0.01，***P < 0.001 光照组对比 0 分钟。

笔记

1. 2×SEAP缓冲液与底物溶液的混合液应避光，迅速加入细胞培养上清液中，立即检测。
2. 如果 SEAP 产量过高，应使用 PBS 缓冲溶液稀释样品。

食谱

1. 1× PBS缓冲液
试剂终浓度数量
氯化钠 137毫米 8.00 克
氯化钾 2.7毫米 0.20克
Na 2 H PO 4 10毫米 1.42 克
KH 2 PO 4 1.8毫米 0.24克
氢气_ _ 不适用 800 毫升
用 HCl 将 pH 值调整到 7.4，然后将 ddH 2 O 添加到最终体积 (1,000 mL)
全部的不适用 1,000 毫升

2. 2×SEAP缓冲液
试剂终浓度数量
L-高精氨酸 20毫米 4.4938 克
氯化镁2 (3 M) 1毫米 0.334 毫升
二乙醇胺 21%（体积比） 210 毫升
用 HCl 将 pH 值调整至 9.8，然后将 dH 2 O 添加至最终体积 (1,000 m L )
全部的不适用 1,000 毫升
储存在 4°C 并避光。

3. 基材溶液
试剂终浓度数量
对硝基苯基磷酸盐 120毫米 2.226 克
2 × SEAP 缓冲器不适用 50 毫升
全部的不适用 50 毫升
分装，-20°C 保存，避光。

致谢

该协议改编自以前的工作（Wang 等人，2021 年。DOI：10.1126/sciadv.abh2358）。这项工作得到了国家重点研发计划（ 2019YFA0904500、2019YFA0110802 ）、国家自然科学基金（NSFC：32171414、31971346、31861143016、31870861）资助)，重庆市自然科学基金（No. CSTB2022NSCQ-MSX0461），乳品生物技术国家重点实验室开放项目计划（No. SKLDB2021-001），东部生命科学学院仪器共享平台资助中国师范大学。

利益争夺

所有作者都希望声明没有竞争利益。

参考

Berger, J.、 Hauber , J.、 Hauber , R.、Geiger, R. 和 Cullen, BR (1988)。分泌性胎盘碱性磷酸酶：真核细胞基因表达的一种强有力的新定量指标。基因66(1)：1-10。
Hu, Z.、Zhang, T.、Jiang, S. 和 Yin, H. (2022)。通过分泌性胚胎碱性磷酸酶测定评估和验证 HEK-Blue 细胞中 TLR8 拮抗剂的方案。 STAR协议3(1)：101061。
Jiang, T.、Xing, B. 和 Rao, J. (2008)。用于检测基因表达的生物报告技术的最新进展。 Biotechnol Genet Eng Rev 25：41-75。
Schlatter, S.、 Rimann , M.、 Kelm , J. 和Fussenegger , M. (2002)。 SAMY，一种源自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的新型哺乳动物报告基因。基因282(1-2)：19-31。
Shao, J., Xue , S., Yu, G., Yu, Y., Yang, X., Bai, Y., Zhu, S., Yang, L., Yin, J., Wang, Y., Liao, S.、Guo, S.、 Xie , M.、 Fussenegger , M. 和 Ye, H. (2017)。智能手机控制的光遗传工程细胞可在糖尿病小鼠中实现半自动葡萄糖稳态。 Sci Transl Med 9(387): eaal2298。
Tannous , BA 和 Teng, J. (2011)。秘密血液记者：见解和应用。生物技术Adv 29(6)：997-1003。
Wang, X.、Dong, K.、Kong, D.、Zhou, Y.、Yin, J.、Cai, F.、Wang, M. 和 Ye, H. (2021)。用于远程控制基因组编辑和基因激活的远红光诱导 CRISPR-Cas12a 平台。科学进步7(50)：eabh2358。
Yang, TT、Sinai, P.、Kitts, PA 和 Kain, SR (1997)。用分泌型碱性磷酸酶报告系统定量基因表达。生物技术23(6)：1110-1114。