材料与试剂

1. Falcon 25 cm 2矩形斜颈细胞培养瓶，带塞密封螺帽（Corning，目录号：353082）
2. Nunc EasYDish盘子 100 毫米（ Thermo Fisher Scientific，目录号：150466）
3. Primaria 25 cm 2矩形斜颈细胞培养瓶，带通气盖（Corning，目录号：353808）
4. 安全锁管 2.0 mL（Eppendorf，目录号：3-7353-04）
5. 试管，15 mL，PP，17/120 mm，锥形底， cellstar ，蓝色螺帽，自然色，刻度，书写区，无菌，5 psc ./bag，三重包装（Greiner Bio-One，目录号：188271）
6. 移液器，10 mL，刻度 1/10 mL，无菌，纸塑包装，单包装（Greiner Bio-One，目录号：607180）
7. 移液器，25 mL，刻度 2/10 mL，无菌，纸塑包装，单包装（Greiner Bio-One，目录号：760180）
8. 10 μL ，长滤嘴，带刻度，系统架 (PP)，灭菌（WATSON，目录号：1252P-207CS）
9. 20 μL ，超滤器吸头，填充板，灭菌（WATSON，目录号：127-20S）
10. 200 μL ，超滤器吸头，补充板，灭菌（WATSON，目录号：0127-20S）
11. 1,000 μL ，长滤嘴，带刻度，填充板，灭菌（WATSON，目录号：126-1000S）
12. Falcon 5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带卡口盖，无菌（Corning，目录号：352058）
13. Falcon 5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带细胞过滤器卡口盖（Corning，目录号：352235）
14. Stericup快速释放-GP 无菌真空过滤系统（Millipore，目录号：S2GPU01RE）
15. A375 [美国典型培养物保藏中心（ATCC），目录号：CRL-1619]
16. C2C12（ATCC，目录号：CRL-1772）
17. H1944（ATCC，目录号：CRL-5907）
18. H2009（ATCC，目录号：CRL-5911）
19. H2122（ATCC，目录号：CRL-5985）
20. H441（ATCC，目录号：HTB-174）
21. HEK293（ATCC，目录号：CRL-1573）
22. HEK293T（ATCC，目录号：CRL-3216）
23. HeLa S3（RIKEN生物资源研究中心，RCB1525 ）
24. Alexa-Fluor 647 抗 Tom20 抗体（Abcam，目录号：ab209606，储存于 4°C）
25. 茴香霉素（来自灰色链霉菌）（Chem-Impex International，目录号：00466，储存于-20°C）
26. 10 × Click - iT细胞反应缓冲液（ Thermo Fisher Scientific，目录号：C10269，4°C 保存）
27. Click - iT反应缓冲液添加剂（ Thermo Fisher Scientific，目录号：C10269，储存于 -20°C）
28. 硫酸铜 (II) ( CuSO 4 ) （ Thermo Fisher Scientific，目录号：C10269，在 4°C 下储存）
29. Cy3-叠氮化物（Jena Bioscience，目录号：CLK-046，储存于 -20°C）
30. 洋地黄皂苷（ Nacalai Tesque ，目录号：19390-91，室温保存）
31. DMEM、高葡萄糖、 GlutaMAX补充剂（ Thermo Fisher Scientific，目录号：10566-016，储存于 4°C）
32. DMEM，高葡萄糖，无谷氨酰胺，无甲硫氨酸，无胱氨酸（ Thermo Fisher Scientific，目录号：21013-024，储存于 4°C）
33. 二甲基亚砜 (DMSO)、核酸酶和蛋白酶测试 ( Nacalai Tesque ，目录号：09659-14，室温保存）
34. L-高丙炔基甘氨酸（HPG）（Jena Bioscience，目录号：CLK-1067，储存于-20°C）
35. 胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F7524，储存于-20°C）
36. 1 mol/L HEPES-KOH 缓冲溶液 (pH 7.5) ( Nacalai Tesque ，目录号：15639-84，室温保存）
37. 拦截 (TBS) 封闭缓冲液（LI-COR，目录号：927-60001，储存于 4°C）
38. 200 mmol/L L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液 (100 × ) ( Nacalai Tesque ，目录号：04260-64，储存于 4°C）
39. L-胱氨酸二盐酸盐，无动物成分（ Nacalai Tesque ，目录号：13003-12，室温保存）
40. 1 mol/L 氯化镁溶液 ( MgCl 2 ) ，无菌过滤 ( Nacalai Tesque ，目录号：20942-34，室温保存）
41. 4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（ Nacalai Tesque ，目录号：09154-85，储存于 4°C）
42. 5 mol/L氯化钠溶液 ( NaCl) ( Nacalai Tesque ，目录号：06900-14，室温保存）
43. 超纯蔗糖（Wako，目录号：198-13525，室温保存）
44. Triton X-100（纳卡莱 Tesque ，目录号：12967-32，室温保存）
45. 胰蛋白酶-EDTA (0.05%)，酚红（ Thermo Fisher Scientific，目录号：25300-054，储存于 4°C）
46. UltraPure DNase/RNase-Free 蒸馏水（ Thermo Fisher Scientific，目录号：10977-015，室温保存）
47. 牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A4919）
48. 不含 Met 的 DMEM (500 mL)（参见配方）
49. 100 mg/mL茴香霉素(250 µL)（参见配方）
50. 100 mM HPG (6.11 mL)（参见配方）
51. 茴香霉素和 HPG (10 mL)的无 Met-free DMEM （参见溶液配方）
52. 茴香霉素(10 mL)的无 Met-free DMEM （参见溶液配方）
53. 0.5% 毛地黄皂苷 (10 mL)（参见配方）
54. 线粒体保护缓冲液 (5 mL)（参见配方）
55. 含 0.0005% 毛地黄皂苷 (5 mL) 的线粒体保护缓冲液（参见配方）
56. 10% Triton X-100（40 毫升）（参见配方）
57. 含 0.1% Triton X-100 (0.5 mL) 的 PBS（参见配方）
58. 5 mM Cy3-叠氮化物 (370 µL)（参见溶液配方）
59. 50 µM Cy3-叠氮化物 (100 µL)（参见配方）
60. 点击反应混合物 (1 mL)（参见配方）
61. 含有 Alexa-Fluor 647 抗 Tom20 抗体 (101 µL) 的拦截 (TBS) 封闭缓冲液（参见溶液配方）
62. FACS 缓冲液（参见配方）

设备

1. 高速微量离心机（ himac ，型号：CF16RN ）
2. 高速冷冻微量离心机（ TOMY ，型号：MDX-310 ）
3. 摆动转子（ himac ，型号：T4SS31）
4. 秋千架（TOMY，型号：SAR015-24）
5. CO 2培养箱（ PHCbi ，型号：MAC-170AIC）
6. Pipet-Aid XP2（Drummond Scientific Company，目录号：4-040-501）
7. Pipetman P-10（Gilson，目录号：F144802）
8. Pipetman P-20（Gilson，目录号：F123600）
9. Pipetman P-200（Gilson，目录号：F123601）
10. Pipetman P-1000（Gilson，目录号：F123602）
11. BD FACSMelody [BD，3 激光（488、640 和 561 nm），8 色（2-2-4）配置）]
12. CellDrop BF ( DeNovix , CellDrop BF-UNLTD)

软件
1. BD FACSChorus （BD FACSMelody操作软件）
2. FlowJo （BD，v10.8.1）
3. R 版本 4.1.1（R 开发核心团队， https://www.r-project.org ）

程序

注意：当细胞被离心时，使用摇摆转子。

A. 细胞培养

1. 在 37 °C 、5% CO 2的加湿培养箱中用 5 mL 培养基将细胞培养至 70 % – 80% 汇合度。在我们的实验中用于每个细胞系的培养基和烧瓶如下所述。
培养基和烧瓶：

细胞类型媒体烧瓶
C2C12 DMEM、高葡萄糖、含 10% FBS 的GlutaMAX补充剂猎鹰 T25 烧瓶
海拉S3 猎鹰 T25 烧瓶
HEK293 猎鹰 T25 烧瓶
HEK293T 猎鹰 T25 烧瓶
A375 猎鹰 T25 烧瓶
H2009 猎鹰 T25 烧瓶
H2122 RPMI 1640 培养基，含 10% FBS Primaria T25 烧瓶
H1944 猎鹰 T25 烧瓶
H441 猎鹰 T25 烧瓶

2. 从烧瓶中吸出介质，慢慢加入 3 mL 的 PBS。
3. 从烧瓶中吸出 PBS 并加入 1 mL 的胰蛋白酶-EDTA。
4. 2的加湿培养箱中，在 37°C 下孵育 5 分钟。
5. 添加 5 mL 上表中描述的介质，并通过移液从烧瓶中分离细胞。
6. 将细胞悬浮液转移到 15 mL 管中。
7. 在 25°C 下以 800 × g离心细胞 3 分钟。
8. 吸出上清液并用上表中所述的 5 mL 培养基重悬细胞沉淀。
9. CellDrop计算细胞数。
注意：细胞悬液应为 0.5 × 10 6 – 2 × 10 6 个细胞/ mL。
10. 细胞悬浮液稀释至 2 × 10 5 个细胞/mL。
11. 在 10 厘米的培养皿中接种 10 mL 细胞悬浮液（2 × 10 5 个细胞/mL）。
注意：应准备以下培养物：一种培养物用于测试样品，另一种培养物用于 FACS 分析的阴性对照。
12. 的加湿培养箱中用 5% CO 2孵育细胞过夜。

B. HPG标签

13. 对于样品，从其中一个 10 厘米的培养皿中吸出培养基，并添加 10 mL 的无 Met DMEM（参见溶液配方）。
14. 吸出培养基，将 10 mL 不含甲硫氨酸的 DMEM 与茴香霉素和 HPG（参见溶液配方）添加到 10 cm 培养皿中。对于阴性对照，使用含有茴香霉素的 DMEM （参见溶液配方）。
注意： Anisomycin用于关闭细胞溶质蛋白质合成。
15. 2的加湿培养箱中，在 37°C 下培养 3 小时。

C. 固定和透化

16. 从 10 厘米盘中吸出介质并加入 10 mL 的 PBS。
17. 吸出 PBS 并添加 1.5 mL 的胰蛋白酶-EDTA。
18. 孵育细胞在37°C 、5% CO 2的加湿培养箱中培养5 分钟。
19. 将细胞悬浮液转移到 2 mL 管中。
20. 在 25°C 下以 300 × g离心3 分钟。
21. 吸出上清液并用 0.5 mL 的冷 PBS 重新悬浮细胞颗粒。
22. 在 25°C 下以 300 × g离心细胞3 分钟。
23. 吸出上清液并在室温下用 0.5 mL 含 0.0005% 毛地黄皂苷（参见溶液配方）的线粒体保护缓冲液重悬细胞沉淀。
24. 在 25°C 下孵育细胞 5 分钟。
25. 在 25°C 下以 300 × g离心细胞3 分钟。
26. 用移液器丢弃上清液，并在冰上用 0.5 mL 的冰冷 4% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液重新悬浮细胞颗粒。
27. 在冰上孵育细胞 15 分钟。
28. 在 25°C 下以 300 × g离心细胞3 分钟。
29. 用移液器丢弃上清液，并在室温下用 0.5 mL 含 0.1% Triton X-100（参见溶液配方）的 PBS 重悬细胞沉淀。
30. 在 25°C 下孵育细胞 5 分钟。
31. 在 25°C 下以 1,000 × g离心细胞3 分钟。
32. 丢弃上清液并立即进行“点击反应”。

D. 点击反应

33. 在室温下用 250 µL 的点击反应混合物（参见溶液配方）重悬细胞沉淀。
34. 在 25°C 下孵育细胞 30 分钟。
35. 在 25°C 下以 1,000 × g离心 3 分钟。
36. 用移液器丢弃上清液，立即进行“Tom20 免疫染色”。

E. Tom20免疫染色

37. 在室温下用 0.5 mL 的拦截 (TBS) 阻塞缓冲液重新悬浮细胞颗粒。
38. 在 25°C 下以 1,000 × g离心 3 分钟。
39. 用移液器丢弃上清液，用 100 µL 的冰冷拦截 (TBS) 封闭缓冲液和 Alexa-Fluor 647 抗 Tom20 抗体（参见溶液配方）在冰上重悬细胞沉淀。
注意：对于 Tom20 免疫染色的阴性对照，请使用冰冷拦截 (TBS) 封闭缓冲液（省略 Alexa-Fluor 647 抗 Tom20 抗体）。
40. 在冰上孵育细胞 1 小时。
41. 在 2 °C 下以 1,000 × g离心 3 分钟。
42. 用移液器丢弃上清液，并在 0.5 mL 的冷 PBS 中重新悬浮细胞颗粒。
43. 重复步骤 E41–42 两次（总共洗涤 3 次）。
44. 将细胞沉淀重悬于 0.5 mL 的冷 FACS 缓冲液中（参见溶液配方）。
45. 立即进行“FACS 准备和分析”。

F. FACS 准备和分析

46. 过滤细胞悬浮液，并将细胞收集在 5 mL 圆底聚苯乙烯试管中。
47. 将通过过滤器的细胞转移到新的 5 mL 圆底聚苯乙烯试管中，并保存在冰中直至测量。
48. 将包含负控制（HPG-Cy3 和 Tom20-AF647 标签）的 5 mL 圆底聚苯乙烯试管放在 BD FACSMelody上并开始流动。
49. FACSChorus为前向散射 (FSC) 和侧向散射 (SSC) 设置适当的光电倍增管 (PMT) 电压，使信号位于可检测范围内。然后，在 BD FACSChorus 中将细胞群门控为“Gate: Cells” 。
50. FlowJo中的 FSC-A/FSC-H 和 FSC-H/FSC-W 的值设置“门：单峰” 。
51. 设置 HPG-Cy3 标记的 PMT 电压 [561 nm 激光、PE 滤波器组（582/15 滤波器和 582 LP 镜）；或者，BD FACSChorus中的488 nm 激光、PE 滤光片组（586/42 滤光片和 560 LP）] 和 Tom20-AF647 标记 [640 nm 激光、APC 滤光片组（660/10 滤光片和 660/10 反射镜）]，以便信号显示在大约 100。
52. 将包含样品的 5 mL 圆底聚苯乙烯试管替换为包含 BD FACSMelody中负控制的试管并开始流动。
53. 在“Gate: Singlet”中记录最多 10,000 个事件的数据，然后将至少包括 FSC-A、SSC-A、PE-A 和 APC-A 的所有数据导出为 FCS 文件。

数据分析

1. FlowJo中加载 FCS 文件。
2. 重新调整门控以将死细胞、双联体和三联体区分为新种群：“新单重体种群”。
将“新单线态种群”导出为包含 APC-A（Tom20-AF647 信号）和 PE-A（HPG-Cy3 信号）的 csv 文件。
注意：图 1 中显示的代表性数据在补充材料中的代表性csv文件（“HEK293_WithoutHPG”、“HEK293_WithHPG.csv”、“H441#2.csv”和“H2122#2.csv”）中提供。
3. 将 csv 文件加载到 R 并运行“Mito-FUNCAT_FACS_script_Fig1AB.R”或“Mito-FUNCAT_FACS_script_Fig1CD.R”（在补充项目中找到）以执行以下步骤。
a. 从 csv 文件的顶部提取 10,000 行。
b. 删除荧光强度小于 0 的行。
c. 通过每行的 Tom20-AF647 值规范化 HPG-Cy3 值。
d. 在密度图中可视化 AF647 标准化 Cy3 值的分布（有关代表性数据，请参见图 1）。
注意：为了确定样本之间的统计显着性，我们通常使用 Mann‒Whitney U 检验。

图 1. Tom20-AF647（线粒体质量）– 归一化 HPG-Cy3（线粒体翻译）信号的分布。 (A–D) HEK293（A 和 B）、H411（C）和 H2122（D）的线粒体中 Cy3 结合的新生肽被标准化为 AF647 标记的 Tom20 丰度。对于 A，从培养基中省略了 HPG 作为阴性对照。垂直线代表分布的中值。原始数据（“HEK293_WithoutHPG”、“HEK293_WithHPG.csv”、“H441#2.csv”和“H2122#2.csv”）和脚本（“Mito-FUNCAT_FACS_script_Fig1AB.R”和“Mito-FUNCAT_FACS_script_Fig1CD.R”）用于生成这些图表的信息在补充材料中提供。

溶液配方

1. 无 Met DMEM (500 mL)
试剂终浓度数量
L-胱氨酸盐酸盐 48 微克/毫升 24毫克
200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液 4.08毫米 10.2 毫升
胎牛血清 10% 50 毫升
DMEM（4.5 g/L D-葡萄糖，无 L-谷氨酰胺，无丙酮酸钠，无 L-甲硫氨酸和 L-胱氨酸）不适用 439.8 毫升

2. 100 毫克/毫升茴香霉素(250 µL)
试剂终浓度数量
茴香霉素 100 毫克/毫升 25 毫克
二甲基亚砜不适用 250 微升

3. 100 毫米 HPG（6.11 毫升）
试剂终浓度数量
HPG 100毫米 100毫克
二甲基亚砜不适用 6.11 毫升

4. 茴香霉素和 HPG的无甲硫氨酸 DMEM (10 mL)
试剂终浓度数量
无甲硫醚 DMEM 不适用 10毫升
100 毫克/毫升茴香霉素 100 微克/毫升 10 µL
100 毫米HPG 100 µM 10 µL
注意事项：使用前准备。

5. 茴香霉素(10 mL)的无甲硫氨酸 DMEM
试剂终浓度数量
无甲硫醚 DMEM 不适用 10毫升
100 毫克/毫升茴香霉素 100 微克/毫升 10 µL
注意事项：使用前准备。

6. 0.5% 洋地黄皂苷 (10 mL)
试剂终浓度数量
洋地黄皂甙 0.5% 50 毫克
无核糖核酸酶的水不适用 10毫升

7. 线粒体保护缓冲液 (5 mL)
试剂终浓度数量
蔗糖 10%（重量/体积） 0.5 g（相当于 370 μL ）
5M 氯化钠 10毫米 10 µL
1 百万氯化镁2 5毫米 20 µL
1 M HEPES-KOH pH 7.5 10毫米 50 µL
无核糖核酸酶的水不适用 4.55 毫升

8. 含 0.0005% 洋地黄皂苷 (5 mL) 的线粒体保护缓冲液
试剂终浓度数量
线粒体保护缓冲液不适用 5毫升
0.5% 洋地黄皂甙 0.0005% 5 µL

9. 10% Triton X-100（40 毫升）
试剂终浓度数量
海卫 X-100 10% 4毫升
无核糖核酸酶的水不适用 36 毫升

10. 含 0.1% Triton X-100 (0.5 mL) 的 PBS
试剂终浓度数量
PBS 不适用 0.5 毫升
10% 海卫 X-100 0.1% 5 µL

11. 5 毫米 Cy3-叠氮化物 (370 µL)
试剂终浓度数量
Cy3-叠氮化物（MW：539.35） 5毫米 1毫克
二甲基亚砜不适用 370 微升

12. 50 µM Cy3-叠氮化物 (100 µL)
试剂终浓度数量
5 mM Cy3-叠氮化物 50 µM 1 微升
无核糖核酸酶的水不适用 99 微升
注意事项：使用前准备。

13. 点击反应混合物 (1 mL)
试剂终浓度数量
10 × Click- iT细胞反应缓冲液 1 × 100 µL
100 毫米硫酸铜4 2毫米 20 µL
Click- iT反应缓冲液添加剂不适用 100 µL
50 µM Cy3-叠氮化物 1 µM 20 µL
无核糖核酸酶的水不适用 760 微升
注意事项：使用前准备。

14. 含有 Alexa-Fluor 647 抗 Tom20 抗体的拦截 (TBS) 封闭缓冲液 (101 µL)
试剂终浓度数量
拦截 (TBS) 阻塞缓冲区不适用 100 µL
Alexa-Fluor 647 抗 Tom20 抗体不适用 1 微升
注意事项：使用前准备并置于冰上。

15. 流式细胞仪缓冲器
试剂终浓度数量
PBS 不适用 100 毫升
牛血清白蛋白 3% 3克
注意事项：使用前准备。

致谢

我们感谢 Yusuke Kimura、Taisei Wakigawa 、Yasuhiro Ikegami、Kenji Ohtawa对实验提出的建设性建议，并感谢 Iwasaki 实验室的所有成员对手稿的批判性阅读。我们还感谢东京大学工业科学研究所Komaba分析核心进行 FACS 分析。这项工作得到了教育、文化、体育、科学和技术部 (MEXT) (JP20H05784 到 SI; JP20H05786 到 YI) 和日本医学研究与开发机构 (AMED) (JP21gm1410001 到 SI 和 YI) 的支持。 HS 是 RIKEN 初级研究员 (JRA)。
该协议源自原始论文（Kimura 等人，2022）和制造商的Click-it 细胞反应缓冲液试剂盒协议。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

本研究不包括人类或动物受试者。

参考

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