材料与试剂
1.12 孔细胞培养板（Sigma，目录号：CLS3512）
2.18 mm 盖玻片，圆形（VWR，目录号：631-1580）
3.5 µm 聚碳酸酯过滤器（Millipore，目录号：TMTP04700）
4.封口膜（Sigma，目录号：P7543）
5.显微镜载玻片（VWR，目录号：12362098）
6.DMEM、高葡萄糖、 GlutaMAX TM补充剂、丙酮酸盐（Gibco，目录号：31966-047）
7.胎牛血清（FBS）（Capricorn Scientific，目录号：FBS-12A）
8.5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（5-EdU）（Jena Bioscience，目录号：CLK-N001-100）； PBS 中的 50 mM 原液 [7.9 mL 中 100 mg；溶解放入水浴（70 ℃ ）1分钟（直至溶解）；分装并储存在 -20 °C]
9.5-氟-2'-脱氧尿苷（FuDR）（Sigma，目录号：F0503）； MilliQ水 ( MQ)中的 10 mM 原液[40.6 mL 中 100 mg；分装并储存在 -20 °C ]
10.胸苷（Sigma，目录号：T1895）； MQ中的 100 mM 库存[41.3 mL 中的 1 g；分装并储存在 -20 °C ]
11.甲醛 37%（Sigma，目录号：252549）
12.Triton-X100（Sigma，目录号：X100）
13.牛血清白蛋白组分 V（BSA）（Sigma，目录号：10735086001）
14.Tris（Sigma，目录号：10708976001）
15.阿托叠氮化物Alexa 647（ Atto Tec，目录号：647N-101）； DMSO 中的 6 mM 原液 [1 mg 在 173 µL 中；分装并储存在 -20 °C ]
16.CuSO 4 （VWR，目录号：23174.233）； MQ 中的 40 mM 库存 [室温 (RT) 储存]
17.抗坏血酸（Sigma，目录号：A0278）； MQ 中的 20 mg/mL 库存 [使用前准备新鲜]
18.甘氨酸（Sigma，目录号：G7126）
19.NaOH（Sigma，目录号：567530）
20.Tween20（Sigma，目录号：P1379）
21.CPD抗体（Cosmo Bio，CAC-NM-DND-001）
22.山羊抗小鼠 Alexa 555（Thermo Fisher Scientific，目录号：A-21424）
23.DAPI（Thermo Fisher Scientific，目录号：D1306）
24.Aqua poly/mount（ Brunschwig ，目录号：18606）
25.无菌 PBS（Thermo Fisher Scientific，目录号：10010023）
26.点击反应混合物（见食谱）
27.洗涤缓冲液 (WB) （参见配方）

设备
1.镊子（弯曲的不锈钢镊子，Sigma，Z168785 ）
2.TUV PL-S 9 W UV-C 灯（飞利浦）
3.International Light NIST可追溯辐射计光度计（型号IL1400BL SEL240/NS254/W）
4.荧光显微镜（蔡司Axio Imager M2）

软件
1.影像软件：Zen（2012蓝色版）
2.数据分析软件：ImageJ（1.48版），要求如下：
a.ImageJ 插件“bioformats_package.jar”位于https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/downloads
b.内部生成的 ImageJ 宏“GGR-UDS_DataExtraction_ImageJ.txt”可在https://git.lumc.nl/dvandenheuvel/ggr-uds-protocol_lumc_luijsterburglab获得
c.内部生成的数据量化文件 GGR-UDS_analyses_template.xls 可在https://git.lumc.nl/dvandenheuvel/ggr-uds-protocol_lumc_luijsterburglab获得

程序
A.细胞培养（第 0 天）

对于每个条件，种子 100,000 RPE1细胞每孔在 18 毫米无菌玻璃盖玻片上，在 DMEM 中的 12 孔板中，辅以 10% FBS。让细胞生长至汇合两天。

B.细胞培养（第 2 天）

用不含 FBS 的 DMEM 替换培养基，以去除可用的胸苷并最大限度地减少分裂细胞的数量。孵育 24 小时。

C.局部 UV-C 处理、EdU 合并和固定（第 3 天）

1.准备一个新的 12 孔板，其中包含 1 mL 的 DMEM（不含 FBS），辅以 20 μM EdU 和 1 μM FuDR （ FuDR抑制胸苷合成并最大化 EdU 掺入）。
2.用 PBS 清洗细胞。
3.在 PBS 中冲洗 5 µm 聚碳酸酯过滤器。
4.用石蜡膜覆盖托盘（例如，15 厘米的板）并将盖玻片（细胞朝上）转移到石蜡膜上。确保不同的条件保持分开。
5.从 5 µm 过滤器中排出多余的 PBS，并小心地将过滤器放在盖玻片的顶部。每个过滤器可以合并一式两份或一式三份；确保放置后不要移动过滤器。
6.2通过过滤器照射细胞。
注意：为防止盖玻片干燥，每次运行最多照射三套覆盖的盖玻片，并通过减少与灯的距离来尽可能缩短照射时间。我们的 UV 灯 = 0.33 J/m 2 /s = 91 s for 30 J/m 2 。
7.小心地将 PBS 添加到过滤器顶部，将其从盖玻片上轻轻提起，然后用镊子取出过滤器。
8.从盖玻片中排出多余的 PBS，将盖玻片放入含有 20 µM EdU 和 1 µM FuDR 的准备好的 12 孔板中，并在 37 °C下孵育 1 小时。
注意：长达 4 小时的更长时间孵育可能有助于评估潜在的残留修复活动在（部分）NER 缺陷细胞中（Apelt 等人，2021）。
9.用 DMEM（不含 FBS）清洗细胞，并在 DMEM（不含 FBS）中孵育 10 µM 胸苷，在 37 °C 下孵育 15 分钟，以稀释未掺入的 EdU。
10.用 PBS 清洗并在 RT 下将细胞固定在 3.7% 甲醛（在 PBS 中稀释）中 15 分钟。
11.用 PBS 清洗盖玻片两次并保存在 4 ℃的 PBS 中 °C直到点击反应和染色。
注意：盖玻片在 4 °C 下稳定。但是，建议在大约一周内继续使用荧光 EdU 标记和 CPD 染色。

D.通过 Click - iT化学对掺入的EdU进行荧光标记（最好在步骤 C 中固定后一周内）

1.从盖玻片中取出 PBS。
2.在 RT 下用 PBS 中的 0.5% Triton-X100 渗透细胞 20 分钟。
3.用 PBS 中的 3% BSA 清洗两次，每次 5 分钟。
4.用 PBS 洗涤一次。
5.每个盖玻片准备 100 µL的点击反应混合物（参见食谱）。
6.将点击反应混合物的 100 μL 液滴放在副膜上，将盖玻片（细胞朝下）放在液滴上，并在黑暗中的 RT 孵育 30 分钟。
7.将盖玻片放回 12 孔板中（细胞朝上）。
8.用 PBS 清洗。在协议的后续步骤中，将盖玻片保持在黑暗中。
注意：立即继续对剩余的 CPD 进行抗体介导的标记，以检测局部损伤部位。

E.抗体介导的剩余 CPD 检测

1.再次将细胞固定在含 2% 甲醛的 PBS 中，室温下 10 分钟，以防止 Click- iT信号丢失。
2.用 PBS 洗涤两次。
3.在 RT 处用 PBS 中的 100 mM 甘氨酸阻断未反应的醛 10 分钟。
4.用 PBS 清洗。
5.在室温下用 PBS 中的 0.5 M NaOH 使 DNA 变性 5 分钟（CPD 抗体仅识别单链 DNA 配置中的 CPD）。
6.PBS 洗涤 3 次。
7.在 RT 处用 PBS 中的 10% BSA 阻断 15 分钟。
8.用 PBS 清洗。
9.用 WB 平衡（参见食谱）。
10.将盖玻片放在封口膜上（细胞朝上），每盖玻片添加 100 µL主要 CPD 抗体（在 WB 中稀释 1/1,000），并在室温下孵育 2 小时或在 4 °C下孵育过夜。
11.取出抗体并在封口膜上用 WB 清洗盖玻片四次，每次 5 分钟。
12.添加 100 μL，并在 RT 孵育 1 小时。
13.在 WB 中清洗一次 5 分钟。
14.在 WB 中每盖玻片添加 100 μL 稀释至 1 ug/mL（通常为 1/1,000），并在 RT 孵育 5 分钟。
15.用 PBS 清洗两次，每次 5 分钟。
16.将盖玻片（细胞朝下）安装在 aqua poly 中/安装在针对每种情况标记的玻璃显微镜载玻片上。
17.在 RT 下水平干燥过夜。
18.倍放大倍数使用荧光显微镜对幻灯片进行成像，并以卡尔蔡司图像数据格式（ .czi文件）存储图像。
数据分析

为了从获得的 . czi图像文件，我们开发了一个自定义 ImageJ 宏，可以与 Excel 中的下游数据选择相结合。相关的宏脚本和 Excel 模板可在https://git.lumc.nl/dvandenheuvel/ggr-uds-protocol_lumc_luijsterburglab上找到。简而言之，ImageJ 用于量化 CPD 染色的信号并定义具有受损区域的细胞核。随后，这些细胞核被分成未损坏和损坏的感兴趣区域 (ROI)，并在这两个区域中量化 CPD 和 EdU 信号。在 Excel 中，选择具有相似大小的受损区域和受损区域的 CPD 信号水平的单元格，以防止因损伤诱导的巨大差异而导致的信号偏差（图 1a，b）。根据平均 EdU 信号及其在细胞核未受损区域的标准偏差，正在进行复制的细胞以及因此安排的 DNA 合成被排除在下游分析之外（图 1c）。复制的早期阶段通常从整个细胞核的 EdU 信号焦点开始，在复制的后期阶段继续进入泛核EdU 信号。根据细胞核未受损区域的高 EdU 信号，处于复制后期的细胞被排除在外。尽管处于复制早期阶段的细胞在其细胞核未受损区域的平均 EdU 信号可能仍然较低，但该 EdU 信号的标准偏差很高，仍然可以将它们排除在下游分析之外。细胞选择后，对于每个细胞核，受损区域中的 EdU 信号会根据未受损区域中相应的背景信号进行校正。这些减去背景的 EdU 强度随后被归一化为它们相应的 CPD 信号，并相对于一种条件 [通常是野生型 (WT) 条件] 进行计算，以允许组合多个实验。下面提供了详细的数据提取和分析协议。

A.提取细胞核受损和未受损区域的 CPD 和 EdU 强度

https://git.lumc.nl/dvandenheuvel/ggr-uds-protocol_lumc_luijsterburglab提供的自定义 ImageJ 宏，可以轻松提取细胞核受损和未受损区域的 CPD 和 EdU 强度。
1.结合所有。单独文件夹中实验的czi文件（确保不存在其他文件或文件夹）
2.运行自定义 ImageJ 宏“GGR-UDS_DataExtraction_ImageJ.txt”以量化 CPD 信号并定义细胞核中损坏和未损坏的区域。
a.单击插件>宏>运行...并选择宏的位置。
b.当询问时，选择 . czi文件被存储。
c.打开其中一张图片，以便宏可以提取文件详细信息。
d.在弹出的对话框中，填写以下详细信息：
i.每张图片包含的频道总数。
ii.检测到 DAPI 的通道号（通常是通道 1）。
iii.您要量化的通道编号（CPD 通道）。
iv.您在其中检测到用于损坏区域检测的 CPD 信号的通道编号。
v.核直径的截止值（值取决于图像捕获设置；通过反复试验进行调整）。
vi.要包含的损坏区域的首选最小大小（设置为 0 以包含所有并稍后手动选择）。
vii.选择 ImageJ 的一种内置阈值方法来定义损坏区域（通常 ImageJ 中的“Yen”或“Li”阈值方法效果很好，但也可以使用其他一些选项；通过反复试验进行优化）。
viii.选择 ImageJ 的内置阈值方法之一来定义细胞核（通常 ImageJ 中的“Yen”或“Li”阈值方法也很有效，但也可以使用其他一些选项；通过反复试验进行优化）。
e.单击“是”分析文件夹中的所有图片。
3.重要提示：在步骤 2 中运行宏会在图片位置生成一个新的数据文件夹，其中包含结果。将这个生成的数据文件夹移动到另一个选择的位置，远离图片。
4.再次运行自定义 ImageJ 宏“GGR-UDS_DataExtraction_ImageJ.txt”，这次是为了量化 EdU 信号。使用与步骤 2 中相同的设置，但要在步骤 2.d.iii 中测量的通道除外。再次，将生成的数据文件夹移动到选择的位置。

从 ImageJ 中提取的数据文件夹包含三种类型的输出。首先，数据文件夹包含一个日志文件，其中包含您提交的宏输入。其次，它包含每张图片的 zip 文件，其中包含所有选定核和损坏区域的 ROI，可以在 ImageJ 中打开。第三，它包含一个可以在 Excel 中打开的量化结果文件。量化按损坏的细胞核分组，在连续两行中包含同一细胞核内损坏和未损坏的 ROI 的数据。

B.数据选择和规范化

可以使用https://git.lumc.nl/dvandenheuvel/ggr-uds-protocol_lumc_luijsterburglab提供的 Excel 模板执行下游数据选择和规范化。此模板包含预定义的计算和图表，因此部分受到保护，无法编辑。填写黄色的所有单元格，下面也有详细说明。
1.将提取的 EdU 通道数据复制到 C–F 列。
2.将 CPD 通道的提取数据复制到 G 列。
注意：确保 CPD 和 EdU 文件中的行顺序相同，当使用完全相同的设置分析相同的图片时，这会自动更正。 CPD 和 EdU 数据的区域列应该相同，如果需要可用于检查文件。
3.为了能够使用数据进行计算，请在 H 列中为每个条件的所有单元格分配一个数字。
注意：如果要重新组合文件中的数据行，请始终确保将每个核的损坏和未损坏 ROI 的连续行保持在一起。
4.要比较实验中的重复项，请在第 I 列中为每个重复项的所有单元格分配一个数字。
5.在 Y 和 Z 列中填写条件编号和名称。
6.使用灰色框架中的基本图形来包括或排除单个单元格（参见图 1）。
a.在单元格 AK4 和 AL4 中定义损伤区域的最小和最大尺寸。
注意：这可用于排除非常小的随机 CPD 斑点或大于过滤器孔径的大 CPD 阳性区域。
b.单元格 AM4 和 AN4 中未损坏的背景ROI允许的最大强度和标准偏差。
注意：非复制细胞在其背景 ROI 中显示低 EdU 强度和标准偏差；早期复制细胞的EdU强度较低，但其背景 ROI 的标准差较高；后期复制细胞显示出高EdU强度，但其背景 ROI 的标准偏差较低。
c.定义单元格 AO4 和 AP4 中损坏的 ROI 中的最小和最大 CPD 强度。
注意：在整个条件下选择具有相同 CPD 强度的细胞，以防止 EdU 信号偏差通过偏向损伤诱导。

图 1. 定义细胞包含的选择标准。 (a) CPD 强度根据细胞核的受损区域（小面积和高 CPD 信号）和未受损区域（大面积和低 CPD 信号）的面积大小绘制，在 ImageJ 中量化。该图可用于定义损坏区域的最小和最大尺寸设置，以包括在下游分析中，如蓝色方块所示。 (b)按条件分开的受损区域的 CPD 强度。该图可用于定义受损区域中最小和最大 CPD 强度的设置，以包括在下游分析中，如蓝色方块所示。 (c) EdU 强度针对所有未损坏区域的标准偏差绘制。该图可用于选择在未损坏区域中具有低 EdU 信号和标准偏差的非复制细胞，如蓝色方块所示。插图显示了不同复制阶段细胞中 EdU 信号的显微镜示例。

Excel 文件提供了 S-V 列中单个细胞的背景减去和标准化 CPD/EdU 强度数据。绿色/橙色框中可以找到非标准化 CPD/EdU 强度的概览图。在蓝色框中可以找到归一化为 CPD 强度和条件后的 EdU 强度概览图。要从各个标准化数据点生成小提琴点图图形，我们建议使用 PlotsOfData ，这是一种简单的免费在线工具（Postma 和 Goedhart，2019）。作为该协议的代表性结果的示例，我们提供了 RPE1-hTERT 人类细胞的本地 UDS 数据和基本 NER 基因XPG的等基因敲除（KO）细胞系。亲本 WT 细胞在局部损伤部位显示出强烈的 UDS 信号，这在XPG -KO 细胞中几乎消失（图 2a），如图 2b 中的小提琴点图所量化。

图 2 UDS 结果。 (a)在 RPE1-hTERT 野生型 (WT) 或 XPG-KO 细胞中使用计划外 DNA 合成方案生成的代表性免疫荧光图像。比例尺代表 10 µm。 (b)细胞受损区域 EdU 水平的量化。每个数据点代表来自三个独立复制的单个单元格的 UDS 信号。每个生物复制的平均值被描述为带黑线的彩色点，而条形代表所有数据点的平均值。使用数据图生成图。

食谱

1.点击反应混合物（每张盖玻片准备 100 µL，使用前 15 分钟内）
试剂终浓度数量
Tris（50 毫米 pH 值 8）~50 毫米79微升
阿托叠氮化物Alexa 647 (6 mM)60 µM1微升
硫酸铜4 (40 毫米)4毫米10 微升
抗坏血酸 (20 毫克/毫升)*2毫克/毫升10 µL
全部的不适用100 µL
* 使用前准备新鲜的抗坏血酸原液

2.洗涤缓冲液 (WB)（50 mL）
试剂终浓度数量
PBS1 ×50 毫升
牛血清白蛋白0.5%0.25克
吐温200.05%25微升_
全部的不适用50 毫升

致谢

这项研究得到了 LUMC 研究奖学金、荷兰研究委员会 (NWO) 的 ALW-VIDI (ALW.016.161.320) 赠款以及 MSL 的 ERC 整合赠款 (101001144) 的支持。

利益争夺

不存在利益冲突或利益冲突。

参考

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Blessing, C.、Apelt, K.、van den Heuvel, D.、Gonzalez-Leal, C.、Rother, MB、van der Woude, M.、Gonzalez-Prieto, R.、Yifrach, A.、Parnas, A ., Shah, RG, 等人。 (2022)。 XPC-PARP 复合物与染色质重塑因子 ALC1 结合，催化全基因组 DNA 损伤修复。 Nat Commun 13(1)：4762。
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