材料与试剂
细胞系
人胚肾HEK293T细胞
一次性用品
对于所有 RNA 工作，仅使用过滤吸头、无 RNA 和 RNase 的试管，并准备所有无 RNase 的溶液。
1.1.5 mL 微量离心管（高压灭菌）（任何供应商）
2.0.2 mL PCR 管（任何供应商）
3.无菌 15 mL 聚丙烯离心管（任何供应商）
4.无菌 50 mL 聚丙烯离心管（任何供应商）
5.无菌无核酸酶过滤吸头（10 µL、200 µL、1,000 µL）（任何供应商）
6.Sephadex G50 柱（Cytiva，目录号：27534001）
7.细胞培养 12 孔板（Greiner Bio-one，目录号：665180）
8.细胞培养皿，150 cm 2 （Greiner，目录号：639160）
9.血清移液器，25 mL（任何供应商）
10.血清移液器，10 mL（任何供应商）
11.血清移液器，5 mL（任何供应商）
12.培养皿（Sarstedt，目录号：82.1473.001）
13.用于从凝胶中切除 DNA 条带的无菌手术刀片（Swann-Morton，目录号：0208）
14.QIAquick凝胶提取试剂盒方案（Qiagen，目录号：28706）
15.质粒 Midi 试剂盒（Qiagen，目录号：12145）
16.Hybond -N 膜（GE Healthcare，目录号：RPN303B）
17.Protran BA 85 硝酸纤维素膜，0.45 µm 孔径（VWR，目录号：10063-173）
18.滤纸（任何供应商）
19.Whatman 纸 0.34 mm（Cytiva，目录号：3030-917）
20.0.22 µm 过滤器（VWR，目录号：514-0061）

试剂（使用顺序）
1.无菌双蒸水 (DDW)，称为超纯水或无 RNase 水
2.胰蛋白胨（MP Biomedicals，目录号：091010817）
3.氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
4.酵母提取物（MP Biomedicals，目录号：0210330391）
5.琼脂（Thermo Scientific，目录号：30391023）
6.氢氧化钠 (NaOH) EMSURE® （ VWR，目录号：1.06498.1000）
7.琼脂糖（ Eurogentec ，目录号：EP-0010-05）
8.DNA 加载染料，6×（Thermo Scientific，目录号：R0611）
9.Dulbecco 改良的 Eagle 培养基（DMEM）（Thermo Scientific，目录号：41966）
10.青霉素 - 链霉素溶液（Thermo Scientific，目录号：151401）
11.胎牛血清（FCS）（Sigma-Aldrich，目录号：F2442）
12.聚乙烯亚胺 (PEI)，支链（Sigma-Aldrich，目录号：108727）
13.最佳基本培养基（Opti-MEM）（Gibco，目录号：51985026）
14.氯化钾 (KCl) （Thermo Fisher Scientific，目录号：15496249）
15.磷酸二氢钠一水合物（NaH 2 PO 4 · H 2 O）（VWR，目录号： MERC1.06346)
16.碳酸氢钠 (NaHCO 3 ) EMSURE® （ VWR，目录号：1.06329）
17.葡萄糖（Invitrogen，目录号：15023021）
18.胰蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：T4799）
19.乙二胺四乙酸（EDTA）（VWR，目录号：1.08418）
20.Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) (DPBS)（Life Technologies，目录号：14190）
21.Tris（Sigma-Aldrich，目录号：T1378）
22.盐酸 (HCl)，37%（VWR，目录号：1.00317）
23.甘油（Bio-Connect，目录号：4800688）
24.NP-40（IGEPAL® ）（Sigma-Aldrich，目录号：56741）
25.完整的蛋白酶抑制剂混合物（Roche，目录号：1697498001）
26.RNasin （ Promega ，目录号：N2111）
27.链霉亲和素缀合的Sepharose TM珠（GE Healthcare，目录号：17511301）
28.十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L4390）
29.β-巯基乙醇（β-ME）（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
30.溴酚蓝（BFB）（Sigma-Aldrich，目录号：B5525）
31.Trizol试剂（Invitrogen，目录号：15596018）
32.氯仿，EMSURE® （ Sigma-Aldrich，目录号：1.02445）
33.异丙醇，EMSURE® （ Sigma-Aldrich，目录号：1.09634）
34.GlycoBlue（Thermo Scientific，目录号：AM9515）
35.25:24:1 苯酚：氯仿：异戊醇（Invitrogen，目录号：15593049）
36.绝对乙醇，EMSURE® （ Sigma-Aldrich，目录号：1.00986）
37.二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D9779）
38.5 ×t转录优化缓冲液（Promega，目录号：P1181）
39.100 mM NTP（Affymetrix，目录号：77245）
40.T7 RNA 聚合酶（Thermo Fisher Scientific，目录号：EP0111）
41.32 P-α-UTP（珀金埃尔默，3000 Ci/mmol，NEG502Z）
42.硼酸（Boom，目录号：61000501.1000）
43.40% (w/v)丙烯酰胺：双丙烯酰胺(19:1) RNA 溶液（ Serva ，目录号：10.679.02）
44.尿素（Invitrogen，目录号：15505027）
45.N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)（ Sigma-Aldrich，目录号： T7024）
46.过硫酸铵（APS）（VWR，目录号：97064-594）
47.二甲苯氰FF (XCFF) （Sigma-Aldrich，目录号：X4126）
48.磷酸一钠 (NaH 2 PO 4 ) （Sigma-Aldrich，目录号：L2887）
49.磷酸氢二钠 (Na 2 HPO 4 ) （VWR，目录号：1.06580.1000）
50.柠檬酸钠（VWR，目录号：1.06448）
51.牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A4503）
52.Ficoll® 400（ VWR ，目录号：17-0300）
53.聚乙烯吡咯烷酮（Sigma-Aldrich，目录号：PVP40）
54.鲱鱼精子 DNA（Sigma-Aldrich，目录号：D6898）
55.30% (w/v)丙烯酰胺：双丙烯酰胺(37.5:1) 溶液（ Serva ，目录号：10.688.02）
56.甘氨酸（默克公司，目录号：50046）
57.甲醇（Thermo Scientific，目录号：11976961）
58.Ponceau-S 溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P7170）
59.Tween-20（默克公司，目录号：822184）
60.脱脂奶粉（任何供应商）
61.IRDye-偶联二抗（ LiCOR Biosciences）
62.Luria-Bertani (LB) 培养基和琼脂（见食谱）
63.完整的 DMEM 培养基（见食谱）
64.10 ×台氏溶液（参见食谱）
65.胰蛋白酶-EDTA 溶液（参见配方）
66.聚乙烯亚胺 (PEI)（参见食谱）
67.S1m 裂解缓冲液（参见配方）
68.S1m 孵育缓冲液(see Recipes)
69.S1m 洗涤缓冲液（参见配方）
70.4 ×蛋白质样品缓冲液（见配方）
71.体外转录 (IVT) NTP 混合（见食谱）
72.1 × TBE（见配方）
73.RNA 变性凝胶（见食谱）
74.2 × RNA 样品缓冲液（参见配方）
75.印迹缓冲液（见配方）
76.20 × SSC（见食谱）
77.100 × Denhardt's（见食谱）
78.10 mg/mL 剪切的鲱鱼精子 DNA（参见食谱）
79.预杂交缓冲液（参见配方）
80.SDS-PAGE 电泳胶（参见配方）
81.SDS-PAGE 浓缩胶（参见配方）
82.SDS-PAGE 电泳缓冲液（参见配方）
83.蛋白质印迹缓冲液（参见配方）
84.印迹封闭溶液（参见配方）
85.PBST（见食谱）
86.选修的： BioLux® _ Gaussia荧光素酶测定试剂盒（New England BioLabs ，目录号：E3300）
87.可选：兼容发光计的 96 孔板，不透明的白色或黑色（任何供应商）

质粒
1.pGEM-3Zf(+)-RMRP（ Pluk等人，1999 年；可应作者要求提供）
2.pcDNA5/FRT/TO（Thermo Fisher，目录号：V652020）

细菌菌株
1.大肠杆菌TOP10感受态细胞（自制）

设备
1.台式离心机（Eppendorf，目录号：5415D）
2.冷冻台式离心机（Eppendorf，目录号：5417R）
3.适用于50 mL体积的冷冻离心机（ Heraeus Megafuge 1.0 R)
4.磁力搅拌器（IKA REO Basic C IKAMAG）
5.热循环仪 (Bio-Rad T100)
6.摇床培养箱（ Infors HT Multitron 2）
7.分光光度计 ( DeNovix DS-11)
8.凝胶扫描仪 (FLA-5100)
9.加湿 37 °C，5% CO 2培养箱 ( Heracell 150)
10.成岩节点生物破坏者
11.数字旋转混合器（ Labinco ，LD-76）
12.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）标准设备
13.Odyssey 成像系统（ LiCOR Biosciences）
14.交联剂，带紫外线灯泡的Stratalinker 1800 ( Stratagene )，λ = 254 nm（Ushio，目录号：3000016）
15.盖革计数器（Thermo Scientific，Mini monitor 900）
16.荧光成像屏幕 (Bio-Rad)
17.台风成像仪（GE Healthcare）
18.可选：发光计（Thermo Scientific，VL0000D0）

程序
A.S1m标签
1.S1m 插入/融合的最佳位置
S1m 适体序列可以插入感兴趣的 RNA 的任何区域，但必须确保标签可用于纯化。链霉亲和素结合适体必须正确折叠，RNA 和/或相关蛋白的三级结构不得干扰链霉亲和素与 S1m 适体的结合。如果已知 RNA 结构和/或 RNA 结合蛋白的结合位点，则将 S1m 序列置于非保守的暴露 RNA 区域（Walker 等人，2008）。此外，S1m 适体的 5 ' - 和 3 ' -末端的连接位点应在空间上靠近，以允许适体正确折叠。
我们建议至少尝试两个不同的适体插入位点并评估哪一个导致最有效的纯化。在 RNase MRP 的情况下，融合到 RNase MRP RNA 的 5 '或 3 '末端似乎比在内部位置插入更有效。需要注意的是，将亲和标签置于 5 '或 3 '位置可能会因核酸外切酶降解而降低 RNA 稳定性。
此外，有必要根据感兴趣的基因（pol I、II 或 III）调整启动子，并考虑所需的表达水平。诱导系统如多西环素诱导 RNA 聚合酶启动子可能是可取的，以避免过度表达和不良影响。
2.使用 S1m 标签标记感兴趣的基因
使用标准的基于 PCR 的策略，将 S1m 适体序列插入感兴趣基因的选定位置。 S1m适体序列为
AUGCGGCCGCCGACCAGAAUCAUGCAAGUGCGUAAGAUAGUCGCGGGUCGGCGGCCGCAU。该序列可以作为寡核苷酸进行商业合成，并通过使用限制酶进行克隆，就像对 RMRP 所做的那样（有关详细信息，请参见Derksen等人，2022）。另一种方法是将适配体序列添加到用于扩增目的基因的引物中，并使用 PCR 扩增和基于融合的克隆（如 In-Fusion ® ）将标签直接添加到目的基因的序列中.第二种方法更快、更容易，并且允许在任何需要的位置引入适体。
通过限制消化和凝胶电泳确认适体的插入。
注意：我们决定使用 S1m 适配体，这是一种修饰的 S1 适配体，与原始 S1 基础茎相比，包含延伸的完美链互补性，导致对链霉亲和素的亲和力高 2 倍（ Leppek 和斯托克林，2014 年）。
3.细菌转化纯化
a.获得包含插入片段的质粒后，按照标准细菌转化方案（Green和 Rogers ，2013）用标记基因转化感受态细菌（例如，大肠杆菌TOP10）。在含有适当抗生素的 LB 琼脂板上过夜培养细菌。
b.第二天，挑选单个菌落并进行菌落 PCR 以验证它们是否包含正确的质粒。
c.在 100 mL 的选择性培养基中接种单个菌落的细菌，并在 200 rpm 的摇动培养箱中在 37°C 下过夜生长。
d.按照制造商的说明，使用 Qiagen Plasmid Midi 试剂盒从细菌培养物中纯化质粒。
e.确认通过测序（例如，Sanger 测序）获得的构建体的序列。
f.通过光谱法和琼脂糖凝胶电泳检查质粒的浓度和纯度。
注：预期的260/280 和 260/230 比率分别为 >1.8 和 >2.0。较低的260/280比率可能表示蛋白质或苯酚污染，较低的260/230比率可能表示有机化合物污染。
g.将纯化的质粒储存在 -20 °C 或直接用于转染（步骤 B2）。

B.细胞培养和转染
1.种子贴壁 HEK293T 细胞在 150 cm 2培养皿中以 10% 的汇合度与 40 mL 的完整 DMEM 培养基一起播种。
2.播种后约 24 小时，当细胞约 20% 汇合时，用步骤 A 中生成的含有 S1m 的构造转染它们：
a.每 150 cm² 培养皿，按以下顺序混合：4 mL Opti-MEM、40 μg DNA 和 120 μL 1 mg/mL PEI。
注意：PEI ：DNA比率13： 3 1 （w/w）最适合转染 RNase MRP 构建体，但这必须针对每个构建体进行优化以达到最佳表达水平。根据表面积调整转染数量，考虑每毫升培养基 1 克 DNA。
作为模拟对照，用相同数量的不含 DNA 的 Opti-MEM 和 PEI 转染培养皿。
b.在室温下孵育 30 分钟。
c.将混合物滴加到细胞中并轻轻旋转混合。
3.可选：如果转染质粒表达Gaussia或Renilla荧光素酶，则通过测量荧光素酶表达水平评估转染效率。转染后 24 至 48 小时，收获 200 μL 培养基并使用BioLux ®评估荧光素酶活性遵循制造商说明的Gaussia萤光素酶测定试剂盒。
4.转染后四十八小时，通过胰蛋白酶消化收获细胞。
a.取出培养基。
b.在室温下每 10 cm 2向细胞中滴加 150 µL 1 × trypsin-EDTA，并在室温下孵育 2 – 3 分钟，直至超过 90% 的细胞脱落。
c.添加至少四体积的预热完全 DMEM 培养基以停用胰蛋白酶并以 500 – 1000 × g离心5 分钟。
d.用至少三体积的 PBS 清洗一次颗粒。
注意：细胞沉淀可以储存在-20°C。

C.S1m 标记复合物的纯化
1.链霉亲和素纯化
a.通过将颗粒重新悬浮在 1 mL 的 S1m 裂解缓冲液中并在冰上孵育 5 分钟来裂解收获的细胞。
b.在 bioruptor 中以高功率超声处理 10 次 30 s 以剪切基因组 DNA。
c.× g离心10 分钟，并将上清液转移到新管中以与不溶性物质分离。不溶性物质可以丢弃。
d.添加 1 mL 的S1m 孵育缓冲液。
e.将 10% 的裂解物转移到标记为用于西方和北方印迹分析的输入材料的新管中。
注意：此阶段要节省的材料量取决于目标复合物的表达水平、纯化效率和分析次数。对于 RNase MRP，我们使用 0.6% 的输入材料进行蛋白质印迹分析，1% 用于北方印迹分析。
f.将裂解物和 3 μL的RNasin添加到 40 μL的包装预平衡链霉亲和素琼脂糖珠中。要预平衡珠子，请用 0.5 mL 的 S1m 洗涤缓冲液将它们洗涤三次，然后以 800 x g离心 2 分钟。
g.使用旋转混合器在搅拌下在 4°C 下孵育过夜。
h.× g离心在 4°C 下 2 分钟，并将 10% 的上清液转移到标记为非结合材料的新管中，用于西方和北方印迹分析。
Input相同的数量。
i.用 1 mL 的 S1m 洗涤缓冲液清洗珠子 3 次，每次 5 分钟，方法是在 4°C 下在搅拌下孵育，并在4°C 下以 800 x g离心 2 分钟。可以丢弃洗涤部分。
在最后一次洗涤期间，将重新悬浮的珠子分成两个管，一个用于蛋白质提取，另一个用于 RNA 提取。
2.从纯化材料中提取蛋白质
a.离心两个管中的一个以沉淀珠子并丢弃上清液。
b.将 20 µL 的 4 ×蛋白质样品缓冲液直接添加到珠子中。
注意：每个凝胶上加载的材料量取决于纯化效率。对于 RNase MRP，我们使用 10% – 25% 的结合材料进行蛋白质印迹分析。
c.将纯化后的材料储存在 -20 °C 或直接用于蛋白质印迹（步骤 D2）。
3.从纯化材料中提取 RNA
a.离心第二个管以沉淀珠子并丢弃上清液。
b.将 1 mL 的 TRIzol 试剂直接添加到珠子中，并按照制造商的说明分离 RNA。
注意：我们建议使用一体积的氯仿对水相进行额外的提取步骤，并在沉淀过程中添加 10 µg 糖原或 GlycoBlue 作为载体。
c.将 RNA 溶解在 10 – 30 µL 的无 RNase 水中。
d.将纯化的 RNA 储存在-80°C。
注意：每个凝胶上加载的材料量取决于纯化效率。对于 RNase MRP，我们使用 15% 的结合材料进行 northern 印迹分析。
D.鉴定纯化材料的成分

1.北方印迹
通过 northern 印迹杂交验证您感兴趣的标记 RNA 的存在。用于检测感兴趣的 RNA 的探针应导致检测内源性 RNA 和标记的 RNA，以便比较它们的表达水平。建议对非相关 RNA 进行分析。这可以作为输入分数的加载控制，并为 RNA 纯化的特异性提供参考。
α- 32 P 标记的 RNA探针（核糖核酸探针）进行北方印迹的程序，核糖核酸探针是最敏感和特定类型的放射性标记探针。对于高水平表达的 RNA，也可以使用32 P 5'-末端标记的 DNA 寡核苷酸或非放射性（例如荧光标记）RNA 或 DNA 探针。有关描述这些方法的详细协议，请参阅Tabor 和Struhl (2001) 以及Franke等人。（201 5），分别。
a.探针克隆
使用标准的基于 PCR 的策略，将感兴趣的 RNA 序列（部分）插入质粒中。探针应至少有 100 个核苷酸长。该载体应在目标 RNA 的有义序列上游包含一个体外转录启动子（例如 T7 或 SP6 RNA 聚合酶的启动子），以在转录后生成互补探针。对于 RMRP，使用了包含 T7 启动子下游 RMRP 完整正义序列的 pGEM-3Zf 质粒。
获得包含探针序列的质粒后，按照步骤 A3a – g 扩增和纯化质粒。
b.体外转录
i.用适当的限制酶切割探针序列的下游，通过消化使质粒线性化。
ii.：氯仿：异戊醇提取和乙醇沉淀纯化线性化质粒[有关协议的详细信息，请参阅Suchan (2020)]。
iii.通过琼脂糖凝胶电泳确认线性化。将圆形和线性质粒加载到同一凝胶上并比较条带的大小。与环状质粒相比，线性质粒应迁移到不同的位置。
iv.按以下顺序混合：无 RNase 水（总反应体积为 20 µL）、2 µL 100 mM DTT、4 µL 5 × 转录优化缓冲液、2 µL IVT NTP 混合物、40 U RNA聚合酶、2 µL RNasin （80 单位）、2 µL 32 P- -UTP（3000 Ci/mmol）和 1 µg 线性化质粒。
v.在 37°C 下孵育 1 小时。
vi.按照制造商的说明使用 Sephadex G50 柱纯化体外转录的探针。
使用盖革计数器测量纯化探针和柱中的放射性量。
注意：纯化的 RNA 探针中的放射性水平应高于柱中的放射性水平；相反表明标记探针的次优生产。
c.凝胶电泳
该协议描述了使用聚丙烯酰胺凝胶的程序，但也可以使用琼脂糖凝胶。更多信息可以在更详细的协议中找到（Petrov 等人，2013）。
i.制备聚丙烯酰胺 RNA 变性凝胶。
ii.× TBE 中以 30 mA预运行凝胶30 分钟。
iii.将一体积的 RNA 样品缓冲液添加到来自转染和未转染细胞的输入、非结合和纯化的 RNA 样品中，并在 95°C 下孵育 5 分钟以使 RNA 变性。立即将样品放回冰上。
iv.预运行后，使用注射器清洁插槽并加载样品。
v.以 30 mA 运行凝胶。
注意：运行时间取决于感兴趣的 RNA 分子的大小。使用彩色染料确定何时停止运行凝胶（Petrov 等人，2013 年）。对于 RNase MRP RNA，应运行凝胶直至深蓝色染料（溴酚蓝）到达凝胶底部。
d.RNA印迹和检测
i.在室温下以 500 mA将 RNA 转移到Northern 印迹缓冲液中的Hybond N+ 膜上 1 小时。
ii.mJ /cm 2的紫外线照射，让印迹干燥并将 RNA 交联到膜上。
注意：如果需要，将滤纸之间的印迹干燥存放在 4 °C 下。
iii.使用预杂交缓冲液在 65°C 下阻止印迹 1 小时。
iv.将 RNA 探针添加到预杂交缓冲液中，并在 65°C 下孵育过夜。
v.× SSC 和 0.2% SDS清洗印迹两次，使用足够的缓冲液覆盖整个印迹。
vi.× SSC清洗印迹一次或两次，直到在预期无信号的印迹区域不再检测到放射性。
vii.用塑料箔包裹印迹，然后将其放入装有荧光屏的盒中。
viii.使用荧光成像仪显影以可视化结果（示例参见图 2）。

图 2. S1m 标记 RNA 的 Northern 印迹分析。用S1m -RMRP构建体转染 HEK293 细胞以瞬时表达标记的 RNA 并培养 24 或 48 小时，然后用 TRIzol 提取总 RNA。作为对照（-质粒），使用在没有质粒构建体的情况下进行转染程序的细胞。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量的 RNA，并使用与 RMRP 互补的放射性标记探针检测野生型和 S1m 标记的 RMRP。

2.免疫印迹
a.蛋白质凝胶电泳
i.准备 SDS-PAGE 凝胶 [参见食谱和详细方案 Sambrook和 Russell (2006) ]。
ii.聚合后，小心取下梳子并使用注射器清洁插槽。
iii.将 1 体积的 Input 和 Non-bound 材料与 3 体积的 4 ×蛋白质样品缓冲液混合。
iv.2-5分钟并离心以去除不溶性物质后，加载输入、未结合和纯化的蛋白质样品。
注意：对于 0.75 mm 厚的凝胶，最多加载 15 μL，对于 1.5 mm 厚的凝胶，最多加载 30 μL。
v.在 SDS-PAGE 运行缓冲液中以 90 V 恒定运行凝胶约 15 分钟，直到染料到达堆叠凝胶的底部。然后，在 150 V 恒定电压下运行大约 50 – 60 分钟，直到染料到达运行凝胶的底部。
vi.从运行装置中取出凝胶，小心地取出其中一块玻璃板并切下浓缩胶。
b.蛋白印迹
i.组装转移盒：阳极（-）；泡沫垫；两张 Whatman 纸；凝胶;硝酸纤维素膜；两张 Whatman 纸，泡沫垫；阴极（+）。
注意：在组装印迹三明治之前，将所有 Whatman 纸和膜浸泡在蛋白质印迹缓冲液中。避免阳极和阴极之间的任何气泡，并在关闭盒之前使用滚筒轻轻去除任何气泡，以确保在印迹的整个表面上有效转移。
ii.将盒式磁带插入印迹装置。在设备中添加冰袋或在转移过程中保持设备低温。
iii.将蛋白质转移到西方印迹缓冲液中的硝酸纤维素膜上，并在恒定 100 V 下磁力搅拌至少 1 小时，或在恒定 250 mA 下过夜。
注意：对于厚凝胶 (1.5 mm)，转移至少 1.5 小时。
iv.转移后，从盒中取出印迹并在 Ponceau-S 溶液中短暂孵育，直到 Input 和 Non-bound 组分出现清晰的条带。用软化水冲洗印迹数次并制作染色印迹的图像。
c.免疫检测
i.通过在室温下将膜在 10 mL 的印迹封闭溶液中孵育至少 30 分钟并轻轻摇动来阻止非特异性抗体结合。
ii.弃去封闭液，加入 5-10 mL 封闭液中稀释至工作浓度的一抗。在室温下孵育至少 1 小时，或理想情况下在 4°C 下孵育过夜，同时摇动或旋转。
iii.10-20 mL 的 PBST清洗膜 3 次，每次 5 分钟。
iv.将IRDye ® 800CW- 或 680RD- 偶联二抗加入 5 – 10 mL 封闭液中并稀释至工作浓度。在室温下孵育至少 1 小时，避光。
注意：确保使用的二抗针对一抗来源生物体的免疫球蛋白。
v.– 20 mL 的 PBST清洗膜两次，每次 5 分钟。
vi.用 10 mL 的 PBS 简要清洗膜，并将其保存在 PBS 中，防止光线照射，直到成像。
注意：我们观察到，在用 PBS 冲洗膜后，成像时观察到的背景荧光较少。
vii.使用具有 700 nm 或 800 nm 通道的 Odyssey 成像系统或 Typhoon 成像仪检测荧光，具体取决于所使用的二次抗体。

数据分析

通过 northern blotting 确认与内源性非标记 RNA 相对应的条带在来自转染和未转染细胞的材料中可见，在输入和非结合分数中。包含适配体的 RNA 应仅在来自转染细胞的输入和纯化材料中可见。将不同条件下感兴趣的 RNA 的表达水平标准化为对照 RNA。
免疫印迹后，结合材料中预计没有或非常弱的条带，而丽春红-S 染色预计在输入和非结合部分中高度相似。
通过对转染细胞纯化样品中已知蛋白质伙伴的免疫检测来确认纯化效率（例如，参见图 3）。

图 3. 通过蛋白质印迹法鉴定分离复合物中的蛋白质。用S1m -RMRP 构建体转染 HEK293 细胞以瞬时表达标记的 RNA 并培养 48 小时。作为对照（-质粒），使用在没有质粒构建体的情况下进行转染程序的细胞。裂解细胞，用链霉亲和素琼脂糖珠纯化标记的核糖核蛋白复合物，并用蛋白质样品缓冲液洗脱蛋白质。通过 SDS-PAGE 分离等量的输入 (I) 和流通 (F) 以及三倍以上的结合 (B) 样品，并使用特异性抗体通过蛋白质印迹法进行分析。 Rpp40 和 Rpp25 是 RNase MRP 的已知成分；不与复合物相互作用的 La 蛋白用作阴性对照。

食谱

1.Luria-Bertani (LB) 肉汤和琼脂
1% (w/v) 胰蛋白胨
1% (w/v) 氯化钠
0.5% (w/v) 酵母提取物
准备 LB 琼脂，添加 1.5% (w/v) 琼脂
用 NaOH 调节 pH 值至 7.0
高压灭菌并在室温下储存
制备 LB 琼脂平板时，先加热融化琼脂，然后冷却至 <60 °C，然后再添加抗生素。在无菌环境中向每个培养皿中倒入 10 – 20 mL，让它冷却，并在 4 °C 下储存

2.完整的 DMEM 培养基
数字微机
10% 胎牛血清
1% 青霉素-链霉素混合物
储存在 4 °C 直至使用

3.10 ×台氏溶液
1.37 M 氯化钠
27 毫米氯化钾
3.6 毫摩尔 NaH 2 PO 4 · H 2 O
120 毫米碳酸氢钠3
111 毫米葡萄糖
混合除葡萄糖以外的所有成分，必要时将 pH 值调整至 7.2，然后进行高压灭菌。然后，加入葡萄糖并保持无菌。
常温保存

4.10 ×胰蛋白酶-EDTA 溶液
3.5% (w/v) 胰蛋白酶
1%（重量/体积）乙二胺四乙酸
在 37 °C 下短暂孵育，溶解在 10 × tyrode 溶液中
用 NaOH 调节 pH 值至 7.4
通过无菌 0.22 µm 过滤器过滤
储存在 -20 °C 或直接用于制备 1 ×等分试样
要制备用于细胞培养的1 ×溶液，请用无菌超纯水稀释 10 倍，并在 -20 °C 下储存等分试样

5.聚乙烯亚胺 (PEI) 库存
向 PEI 中加入超纯水，使最终浓度为 1 mg/mL
在搅拌下在室温下孵育 1 小时
在 50 °C 下孵育 30 分钟
在搅拌下在室温下孵育 30 分钟
通过无菌 0.22 µm 过滤器过滤
将等分试样储存在 -70 °C 或 -80 °C（最多三个月）

6.S1m 裂解缓冲液
50 mM Tris-HCl，pH 7.6
10 毫米氯化镁2
100 毫米氯化钾
10% 甘油
0.1% NP-40
新鲜制作并在使用前添加完整的蛋白酶抑制剂和 1 mM 的 DTT

7.S1m 孵育缓冲液
50 mM Tris-HCl，pH 7.6
10 毫米氯化镁2
100 毫米氯化钾
10% 甘油
新鲜制作并在使用前添加完整的蛋白酶抑制剂和 1 mM 的 DTT

8.S1m 洗涤缓冲液
50 mM Tris-HCl，pH 7.6
10 毫米氯化镁2
100 毫米氯化钾
10% 甘油
0.05% NP-40
新鲜制作并在使用前添加完整的蛋白酶抑制剂和 1 mM 的 DTT

9.4 ×蛋白质样品缓冲液
200 毫米 Tris-HCl，pH 6.8
8% 安全数据表
40%甘油
5% β-巯基乙醇
50 毫米乙二胺四乙酸
0.05%溴酚蓝
储存在 4 °C
10.IVT NTP 混合
1 毫米三磷酸腺苷
1 毫米 GTP
1 毫米 CTP
0.1 毫米双绞线
储存在-20°C

11.1 × TBE
100 毫米三
100 毫米硼酸
2 毫米乙二胺四乙酸
常温保存

12.RNA变性凝胶
1 × TBE
8M尿素
X% 19:1丙烯酰胺:双丙烯酰胺
0.1% 泰美德
0.1% 新鲜 APS（准备 10% APS 并立即使用或将一次性等分试样储存在 -20 °C）
根据感兴趣的 RNA 的大小选择丙烯酰胺的百分比。
注意：如果您打算制作多个 RNA 凝胶，请准备 500 mL 不含 TEMED 和 APS 的 RNA 变性凝胶混合物，并储存在 4°C。
使用前，在 37 °C 下预热以溶解尿素（如果需要）并添加 TEMED 和 APS。当心：当溶液变热时，凝胶会聚合得更快。

13.2 × RNA 样品缓冲液
8M尿素
1 × TBE
0.05% XCFF
0.05% BFB
常温保存

14.Northern 印迹缓冲液
18.4 毫米NaH 2 PO 4
6.5 毫米钠2 HPO 4
常温保存

15.20 × SSC
3.0 M 氯化钠
0.3 M 柠檬酸钠
用 HCl 调节至 pH 7.0
常温保存

16.100 ×登哈特的
2% 牛血清白蛋白
2%聚蔗糖® 400
2%聚乙烯吡咯烷酮
储存在-20°C

17.10 mg/mL 剪切的鲱鱼精子 DNA
在超纯水中溶解10 mg/mL的鲱鱼精子 DNA
正确制备溶液需要超声处理
储存在-20°C

18.预杂交缓冲液
6 × SSC
0.1 mg/mL 剪切的鲱鱼精子 DNA
0.2% 安全数据表
10 ×登哈特的
常温保存

19.SDS-PAGE 电泳胶
0.4 M Tris-HCl，pH 8.8
X% 37:1丙烯酰胺:双丙烯酰胺
0.1% 安全数据表
0.1% 泰美德
0.1% 新鲜 APS（准备 10% APS 并立即使用或将一次性等分试样储存在 -20 °C）
根据感兴趣的蛋白质的大小选择丙烯酰胺的百分比。

20.SDS-PAGE 浓缩胶
70 毫米 Tris-HCl，pH 6.8
4% 37:1丙烯酰胺:双丙烯酰胺
0.1% 安全数据表
0.1% 泰美德
0.1% 新鲜 APS（准备 10% APS 并立即使用或将一次性等分试样储存在 -20 °C）

21.SDS-PAGE 电泳缓冲液
Tris-甘氨酸（ 25 mM Tris，192 mM 甘氨酸）
0.1% 安全数据表
常温保存

22.蛋白质印迹缓冲液
Tris-甘氨酸（ 25 mM Tris，192 mM 甘氨酸）
20% 甲醇
0.1% 安全数据表
常温保存

23.印迹封闭液
PBS
0.1% 吐温 20
5%脱脂奶粉
将一次性等分试样储存在 -20℃

24.PBST
PBS
0.1% 吐温 20
常温保存

致谢

此程序改编自原始研究文章（ Derksen等人，2022），我们在其中展示了 RNase MRP 的有效分离以及使用此方法研究野生型和突变型 RNase MRP 的蛋白质结合和底物切割活性的可能性核糖核酸。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

Bachler, M.、Schroeder, R. 和 von Ahsen , U. (1999)。 StreptoTag：一种分离 RNA 结合蛋白的新方法。 RNA 5(11)：1509-1516。
Chang, DD 和 Clayton, DA (1987)。一种新型内切核糖核酸酶在小鼠线粒体 DNA 复制的启动位点进行切割。 EMBO J 6(2)：409-417。
Coughlin, DJ, Pleiss, JA, Walker, SC, Whitworth, GB 和Engelke , DR (2008)。对酵母 RNase P 底物的全基因组搜索揭示了在内含子编码盒 C/D 小核仁 RNA 成熟中的作用。过程国家队科学院美国科学杂志A 105(34)：12218-12223。
Derksen , M., Mertens, V., Visser, EA, Arts, J., Vree Egberts , W. 和Pruijn , GJM (2022)。一种用于选择性分离和表征人 RNase MRP 的新实验方法。 RNA 生物学19(1)：305-312。
Franke, C.、 Grafe , D.、Bartsch, H. 和 Bachmann, MP (2015)。使用非放射性检测方法进行 North-和 South-Western 印迹。方法 Mol Biol 1314：63-71。
Hermanns , P.、Tran, A.、 Munivez , E.、Carter, S.、Zabel, B.、Lee, B. 和 Leroy, JG (2006)。软骨毛发发育不全中的 RMRP 突变。 Am J Med Genet A 140(19)：2121-2130。
Gill, T.、 Cai , T.、 Aulds , J.、 Wierzbicki , S. 和 Schmitt, ME (2004)。 RNase MRP 裂解 CLB2 mRNA 以促进细胞周期进程：mRNA 降解的新方法。分子细胞生物学24(3)：945-953。
Green, R. 和 Rogers, EJ (2013)。化学感受态大肠杆菌的转化。方法Enzymol 529：329-336。
Guerrier-Takada, C.、Gardiner, K.、Marsh, T.、Pace, N. 和 Altman, S. (1983)。核糖核酸酶 P 的 RNA 部分是该酶的催化亚基。单元格35（3 篇 2）：849-857。
Hou, S., Shi, L. 和 Lei, H. (2016)。体外组装的 RNA-蛋白质复合物的生物素-链霉亲和素亲和纯化。方法 Mol Biol 1421：23-34。
Lan , P.、Zhou, B.、Tan, M.、Li, S.、Cao, M.、Wu, J. 和 Lei, M. (2020)。核糖核酸酶 MRP 对前体核糖体 RNA 加工的结构洞察。科学369(6504)：656-663。
Leppek , K. 和 Stoecklin, G. (2014)。用于纯化核糖核蛋白复合物的优化链霉亲和素结合 RNA 适配体可识别新的 ARE 结合蛋白。核酸 Res 42(2)：e13。
Li, Y. 和 Altman, S. (2002)。 HeLa 细胞中人 RNase P 在其带有亲和标签的 RNA 亚基和完整蛋白质成分之间的部分重组。核酸研究30(17)：3706-3711。
Lygerou , Z.、 Allmang , C.、 Tollervey , D. 和 Seraphin, B. (1996)。通过核糖核酸酶 MRP 在体外准确处理真核前体核糖体 RNA。科学272(5259)：268-270。
Mattijssen , S., Welting, TJ 和Pruijn , GJ (2010)。 RNase MRP 和疾病。 Wiley Interdiscip Rev RNA 1(1)：102-116。
Mattijssen , S.、Hinson, ER、 Onnekink , C.、 Hermanns , P.、Zabel, B.、 Cresswell , P. 和Pruijn , GJ (2011)。 Viperin mRNA 是人 RNase MRP/RNase P 核糖核酸内切酶的新靶点。细胞分子生命科学68(14)：2469-2480。
Park, OH、Ha, H.、Lee, Y.、Boo, SH、Kwon, DH、Song, HK 和 Kim, YK (2019)。 RNase P/MRP 复合物对含m( 6)A 的 RNA的内切核糖核酸裂解。分子细胞74(3)：494-507 e498。
Petrov, A.、 Tsa , A. 和 Puglisi, JD (2013)。通过分析型聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 RNA。方法Enzymol 530：301-313。
Pluk , H.、van Eenennaam , H.、 Rutjes , SA、 Pruijn , GJ 和 van Venrooij , WJ (1999)。人 RNase MRP 核糖核蛋白复合物中的 RNA-蛋白质相互作用。 RNA 5(4)：512-524。
Ramanathan, M.、Porter, DF 和 Khavari, PA (2019)。研究 RNA-蛋白质相互作用的方法。国家方法16(3)：225-234。
Randau , L.、Schroder, I. 和 Soll, D. (2008)。没有 RNase P 的生活。自然453(7191)：120-123。
Reiner, R.、Ben- Asouli , Y.、 Krilovetzky , I. 和Jarrous , N. (2006)。催化核糖核蛋白 RNase P 在 RNA 聚合酶 III 转录中的作用。基因开发20(12)：1621-1635。
Reiner, R.、 Krasnov-Yoeli , N.、 Dehtiar , Y. 和Jarrous , N. (2008)。 RNA 聚合酶 I 有效转录所需的染色质相关 RNase P 的功能和组装。 PLoS一3(12)：e4072。
Robertson, HD、Altman, S. 和 Smith, JD (1972)。切割酪氨酸转移核糖核酸前体的特定大肠杆菌核糖核酸酶的纯化和特性。生物化学杂志247(16)：5243-5251。
Sambrook, J. 和 Russell, DW (2006)。蛋白质的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。 CSH协议2006(4)。
Srisawat , C. 和Engelke , DR (2001)。链霉亲和素适体：用于研究 RNA 和核糖核蛋白的亲和标签。核糖核酸7(4)：632-641。
Srisawat , C. 和Engelke , DR (2002)。用于纯化 RNA 和核糖核蛋白复合物的 RNA 亲和标签。方法26(2)：156-161。
Suchan , T. (2020)。苯酚-氯仿 DNA 纯化。 protocols.io：DOI：dx.doi.org/10.17504/protocols.io.re6d3he 。
Tabor, S. 和Struhl , K. (2001)。 DNA 的酶促标记。电流 Protoc Hum Genet附录 3：附录 3E。
Walker, SC、Scott, FH、 Srisawat , C. 和Engelke , DR (2008)。用于快速纯化和研究 RNA 和 RNA-蛋白质复合物的 RNA 亲和标签。方法 Mol Biol 488：23-40。
Welting, TJ, Kikkert , BJ, van Venrooij , WJ 和Pruijn , GJ (2006)。蛋白质亚基与人 RNase MRP 和 RNase P 复合物的差异关联。 RNA 12(7)：1373-1382。
Welting, TJ, Mattijssen , S., Peters, FM, van Doorn , NL, Dekkers , L., van Venrooij , WJ, Heus , HA, Bonafe , L. 和Pruijn , GJ (2008)。 RNase MRP P3 结构域中的软骨毛发发育不全相关突变影响 RNA 折叠和核糖核蛋白组装。生物化学生物物理学学报1783(3)：455-466。
Yoon, JH 和 Gorospe, M. (2016)。通过 MS2-TRAP（MS2 标记的 RNA 亲和纯化）鉴定 mRNA 相互作用因子。方法 Mol Biol 1421：15-22。
Yoon, JH、 Srikantan , S. 和 Gorospe, M. (2012)。 MS2-TRAP（MS2 标记的 RNA 亲和纯化）：标记 RNA 以识别相关的 miRNA。方法58(2)：81-87。