材料和试剂

1. Illumina的AmpliSeq Library PLUS 试剂盒（96 次反应； Illumina ，目录号：20019102）
包含：
a. 1 × Lib 放大器混音
b. 10 × Library Amp 引物
c. DNA连接酶
d. 5 × 扩增序列高保真组合
e. 富帕试剂
f. 低 TE（Tris-EDTA 缓冲液）
g. 开关解决方案
2. Illumina的AmpliSeq Custom DNA 面板（ Illumina ，目录号： 20020495，定制设计IAD179763_241；有关寡核苷酸序列，请参阅补充清单文件和附录 1 ）
包含：
a. 引物池 1（红色盖帽）
b. 引物池 2（蓝盖）
3. Illumina的AmpliSeq CD 索引集 A （96 个索引，96 个样本； Illumina ，目录号： 20019105)
注意：您也可以选择使用索引集 B、C 或 D。
4. 无水乙醇 ( EtOH )（Sigma-Aldrich，Merck，目录号：1.00983.1000）
5. 阿让考特 AMPure XP 珠子（Beckman Coulter，目录号：A63881）
6. 96 孔 PCR 板，0.2 mL（Greiner Bio-One，目录号：652201）
7. 8孔PCR条（Greiner Bio-One，目录号：673210）
8. 用于 PCR 板的条形帽（Greiner Bio-One，目录号：373250）
9. 用于 PCR 板的密封胶（ Westburg Life Science，目录号：WB2-3800）
10. 1.5 mL DNA LoBind®管（Eppendorf，目录号：022431021 ）
11. 无核酸酶水（ Lonza ，目录号：BE51200）
12. KAPA 文库定量试剂盒（KAPA Biosystems ，Roche，目录号：07960298001）
a. DNA 标准品 1–6（每份 80 µL）
b. 底漆混合物 (1 毫升)
c. KAPA SYBR ® FAST qPCR预混液 (5 mL)
13. 量子位® dsDNA HS 检测试剂盒（Invitrogen，Thermo Fischer Scientific，目录号： Q32851）
a. 量子比特 dsDNA HS 试剂 (250 µL)
b. 量子比特 dsDNA HS 缓冲液 (50 mL)
c. 量子比特 dsDNA HS 标准 #1 (1 mL)
d. 量子比特 dsDNA HS 标准 #2 (1 mL)
14. 薄壁、透明、0.5 mL PCR 管（例如， Qubit ®分析管，目录号： Q32856）
15. 移液器过滤器吸头，10 µL（例如，Greiner Bio-One，目录号： 771353； Biofil ，目录号： PPT150010）
16. Combitips 0.2 和 0.5 mL（Eppendorf，目录号： 0030089774 和 0030089421）
17. Miseq试剂盒 v3（600 个循环）（ Illumina ，目录号： MS-102-3003）
a. 试剂盒
b. HT1（杂交缓冲液，5 mL）
c. PR2（掺入缓冲液，500 mL）
d. 流通池
18. 1 N 氢氧化钠 ( NaOH ) （Sigma-Aldrich，目录号：22146-5）
19. Tris-盐酸盐（ HCl ），pH 8.0 （Sigma-Aldrich，目录号：T3038-1L），调节至 pH 7.0
20. 吐温® 20（Sigma-Aldrich，目录号：022431021）
21. PhiX Control v3（ Illumina ，目录号： FC-110-3001）
22. 可选择作为对照包括在文库准备中：
a. 恶性疟原虫实验室菌株（例如 3D7 或 Dd2）中提取的 DNA 作为阳性对照
https://www.beiresources.org/ )获得： P. falciparum ，菌株 3D7，MRA-102，由 Daniel J. Carucci提供；恶性疟原虫，菌株 Dd2，MRA-150，由 David Walliker提供；恶性疟原虫菌株 Dd2_R539T、MRA-1255 和恶性疟原虫菌株 CamWT_C580Y、MRA-1251，由 David A. Fidock提供；和 P 。恶性疟原虫，菌株 IPC 4912，MRA-1241，由 Didier Ménard提供。这些菌株的基因组 DNA 也可从 BEI Resources 获得。
b. 从未感染的人体血液中提取的 DNA 作为阴性对照

设备

1. 多通道移液器 10 µL、0.1 mL 和 0.3 mL
2. 电子多分配器移液器（Eppendorf， Multipette © E3x，目录号： 4987000029）
3. 离心机（Sigma Laborzentrifugen GmbH，Sigma 4-16KS，目录号： 150507）
4. Vortex（Scientific Industries，Vortex Genie 2，目录号： SI-0236）
5. 96 孔磁铁架（Invitrogen、 ThermoFisher Scientific、Dynamag TM -96 Side Skirted ，#12027；RNA Life Technologies， Ambion® Magnetic Stand-96，目录号： 1307065）
6. Qubit 2.0（或更高版本）荧光计（Invitrogen，Thermo Fischer Scientific，目录号： Q32866）
7. 常规循环仪（ Biometra ， Westburg ，Professional Thermocycler Basic 96 × 0.2 mL，目录号： 846-070-701）
8. LightCycler® 480 实时 PCR 系统（Roche，目录号： 04640268001）
9. MiSeq TM系统（ Illumina ，目录号： SY-410-1003）

软件

1. Illumina实验管理器 ( Illumina )
2. 微软Excel（微软）
3. 内部基于 Linux 的管道
a. Ubuntu（规范，ubuntu.com）
b. Trimmomatic （Bolger 等人，2014 年， https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btu170 ）
c. Burrows Wheeler Aligner（Li 等人，2009 年， https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btp324 ）
d. Picard 工具（Broad Institute， https://broadinstitute.github.io/picard/ ）
e. 基因组分析工具包 (GATK)（Broad Institute， https://gatk.broadinstitute.org/ ）
f. SnpEff （ Cingolani等人，2012 年， https://doi.org/10.4161/fly.19695 ）
4. 开关仪器校准
a. 本地运行管理器 ( Illumina )
b. DNA扩增子模块 ( Illumina )

程序

MiSeq系统上被放大和清洗、量化、汇集和排序（图 1）。

图1 。文库制备流程示意图

A. P. falciparum –受感染的人体血液样本制备

干血斑 ( DBS)中提取的 DNA，用于文库制备。
1. 根据标准化方案（例如，使用Qiagen 96 DNA 血液试剂盒或 EZNA DNA 迷你试剂盒提取 DNA）从 DBS 中分离 DNA 。
去除白细胞的血液中提取的 DNA也可用作输入材料。但是，请注意步骤 A3 中所述的 DNA 浓度。
2. Qubit ®对（一部分）样品的3 – 10 µL DNA 进行定量 dsDNA HS 检测试剂盒，根据制造商的协议。
a. 为标准和样品设置所需数量的 0.5 mL 管。量子位® dsDNA HS Assay 需要两个标准品。
b. 通过稀释Qubit ®制备Qubit ®工作溶液 Qubit ®中的dsDNA HS 试剂 1:200 dsDNA HS 缓冲液。每次准备Qubit ®工作溶液时都使用干净的塑料管。对于 96 个样品，通过混合制备 20 mL 工作溶液：
i ) 19.9 mL量子位® dsDNA HS 缓冲液。
ii) 100 µL Qubit® dsDNA HS 试剂。
c. 准备标准管：
i ) 将 190 μL的Qubit工作溶液添加到用于标准的两个管中的每一个中。
ii) 将 10 μL的每个Qubit ®标准品加入适当的试管中，然后涡旋混合2–3 秒。小心不要产生气泡。
d. 准备样品管：
i ) 添加 200 μL减去样品体积（见下一步）的Qubit工作溶液到用于库的每个管中。
ii) 将 3 – 10 μL的每个 DNA 样本添加到适当的试管中，然后涡旋混合2–3 秒。小心不要产生气泡。
注意：如果您怀疑样品浓度太低，您可以在Qubit反应中使用更大体积 (10 μL ) 的样品。
e. 让所有管子在室温 (RT) 下孵育 2 分钟。
f. Qubit ® 2.0荧光计的主屏幕上，按 DNA，然后选择dsDNA High Sensitivity 作为分析类型。显示标准屏幕。
g. 在标准屏幕上，按是阅读标准。
h. 将含有标准 #1 的试管插入样品室，盖上盖子，然后按读取。阅读完成后（~3 秒），删除标准 #1。
i. 将含有标准 #2 的试管插入样品室，盖上盖子，然后按读取。读数完成后，取出标准 #2。校准完成后，仪器会显示样品屏幕。
j. 将样品管插入样品室，盖上盖子，然后按读取。读数完成后（约 3 秒），取出样品管。
k. 仪器在样品屏幕上显示结果。显示的值对应于将样品稀释到检测管中后的浓度。要找到原始样品的浓度，您可以记录该值并稍后在 Excel 模板中执行计算。要计算样品的浓度，请使用以下等式：
浓度 = 测量值（稀释样品的浓度） × （200/V），其中 V 是您在步骤 A2 d.ii中开始反应的样品体积。
l. 重复步骤 jk 直到所有样本都被读取。
3. 文库制备试剂盒的推荐输入浓度为每次反应使用两个引物池之一的 10 ng 高质量 DNA。（该试剂盒支持 1 – 100 ng DNA 输入。但是请注意，由于我们样本的性质，我们混合了人类和寄生虫 DNA。）
AmpliSeq Library PLUS 套件提供）中将 DNA 浓度过高（>100 ng）的样品稀释至 ~1 – 10 ng/ μL的输入浓度。
注意：在我们的程序中，从 DBS 中提取 DNA 后的平均 DNA 浓度为6.1 ± 0.3 ng/ μL 并且我们在文库制备反应中使用了 7.5 μL未稀释样品（每个反应的总输入量约为 23 ng）。重要的是不要超过 100 ng DNA 输入，因为这会对测序结果的质量产生负面影响。对于 DBS 样本，根据我们的经验，DNA 浓度始终低于上限。在研究开始时测试了一些具有不同寄生虫密度的样品的 DNA 浓度后，我们不会在每次做板时例行检查浓度，以节省时间和成本。
重要的是要考虑到对于恶性疟原虫DBS 样本，我们有人类和寄生虫 DNA 的混合物。为确保您拥有足够的高质量寄生虫 DNA，重要的是提前使用qPCR量化您的寄生虫 DNA 。根据我们的验证程序（请参阅文件末尾的注释），我们建议包括恶性疟原虫密度≥60 寄生虫/µl 的样本，由Mangold PCR确定（ Mangold等人，2005 年）。此限制还取决于滤纸上斑点的血量和滤纸的量（例如，在我们的例子中，两片约 0.5 cm 2的滤纸），这会影响样品中模板 DNA 的量。
4. 准备一个带有样品 ID 的 96 孔布局（参见 Excel 模板“ Template_AmpliSeq.xlsx ”）。
注意：我们通常一次做96个样本的文库制备，所以我们每次使用一个96个样本的AmpliSeq Library PLUS kit。您可以增加或减少用于MiSeq一次运行的样本和试剂盒的数量，但这会影响每个样本的深度。
5. 在布局的相应孔中为每个样本添加 7.5 µL（稀释的）DNA。
6. 安全停止点：将装有准备好的样品的 96 孔板储存在 4 °C过夜或在 -20 °C下持续更长的时间，如果不是立即开始图书馆准备程序的话。

B. 扩增 DNA 目标

本部分使用 PCR 在两个不同引物的两个反应中扩增 DNA 样本的（重叠）目标区域来自AmpliSeq Custom DNA panel的池。第一步，将 DNA 与 AmpliSeq混合 HiFi Mix（包括缓冲溶液和用于扩增的酶），随后分装到两个新的 PCR 板中。向每个板的孔中添加两个预混合引物池之一，用于在热循环仪上扩增。有两个引物池（不仅仅是一个扩增所有目标），以允许跨越大基因的扩增子之间的重叠（参见图 2）。

图2 。重叠的扩增子设计和引物池。为了允许扩增大基因，定制 DNA 面板包括短的重叠扩增子。通过使用两个引物池交替重叠的扩增子，我们可以防止在重叠区域扩增错误的引物组合。在使用两个引物池进行最初的两次 PCR 反应后，您将两种产物加在一起，并在下一步中继续进行单个文库制备。

1. 解冻以下试剂：
a. 96 孔板，含有上一节中制备的 7.5 µL DNA ：如果冷冻则在冰上解冻。
b. 5 × 扩增序列 HiFi Mix（红帽； AmpliSeq Library PLUS 套件）：在冰上解冻并倒置以混合。
c. 一份 2 × AmpliSeq Custom DNA panel pool 1（红帽， AmpliSeq Custom DNA panel）：室温解冻，涡旋混合。
d. 一份 2 × AmpliSeq Custom DNA panel pool 2（蓝帽， AmpliSeq Custom DNA panel）：室温解冻，涡旋混合。
2. 短暂离心 96 孔板和准备好的管子，以收集井底的所有液体。
3. 从带有 DNA 的 96 孔板中取出盖子/密封件。
4. 向装有样品的每个孔 [体积 (V) = 7.5 µL]，添加 5 µL 的 5 × 扩增序列使用多点移液器和 0.5 mL Combitip的HiFi Mix 。
5. 将板短暂离心以收集井底的所有液体。
6. 将 DNA– HiFi混合物与多通道移液器混合，将 5 µL 转移到新 PCR 板（标记为池 1）的相应列，将 5 µL 转移到第二个新 PCR 板（标记为池 2）。
7. 向第一个新板（池 1）添加 5 µL 的 2 × 使用多点移液器和 0.5 mL Combitip将AmpliSeq Custom DNA 池 1（红色盖帽）添加到每个孔中。
8. 向第二个新板（池 2）添加 5 µL 的 2 × 使用多点移液器和 0.5 mL Combitip将AmpliSeq Custom DNA 池 2（蓝色盖帽）添加到每个孔中。
9. 用粘合剂密封或盖子密封两个板，并短暂离心以收集井底部的所有液体。检查是否有气泡，用手指轻敲/轻弹孔壁以去除气泡，然后再次离心。
10. 将 96 孔板放入热循环仪中，将体积设置为 10 µL（如果适用），然后运行表 2 中的 AMP_DNA 程序（在 105 °C 时打开加热盖）：

表 2. PCR 循环条件 (AMP_DNA)
周期温度时间
1 × 99 ℃ 2分钟
21 × 99 ℃
60 ℃ 15 秒
8分钟
抓住 10 ℃ 长达 24 小时

11. 安全停止点：如果要停止，请将板在 10 °C 的热循环仪上放置最多 24 小时。如需更长时间，请在 -25 °C至 -15 °C下储存。

C. 部分消化扩增子

本部分使用FuPa试剂消化引物二聚体和部分消化扩增子。
1. 从本节开始，在可以用紫外线辐射或清洁以变性 DNA 的清洁罩中工作。
2. 解冻以下试剂：
a. 96 孔板与上一节中准备的放大池 1：在冰上解冻并涡旋。
b. 96 孔板与上一节中准备的放大池 2：在冰上解冻并涡旋。
c. FuPa试剂（棕色瓶盖； AmpliSeq Library PLUS 套件）：在冰上解冻。
3. 如果在本节之后立即继续下一节 (D)：
开关溶液（黄色盖子； AmpliSeq Library PLUS 套件）：室温解冻。
4. 将带有放大池 1 和池 2 的 96 孔板短暂离心，并准备好管子以收集井底的所有液体。
5. 从带有放大池 1 和池 2 的 96 孔板中取出密封件。
6. 对于每个样本，使用多通道移液器将来自放大池 2 的 10 µL 反应结合到放大池 1 的相应井中。这将导致每个样本的总体积为 20 µL。
7. 中分装 30 μL 的FuPa试剂。从这里，使用多通道移液器，将 2 μL 的FuPa试剂转移到组合池 1 + 2 产品的每个孔中并混合。在继续下一栏之前丢弃提示。
多点移液器和Combitip很难做到这一点。因此，使用带 10 µL 吸头的多通道移液器进行更准确的移液。
8. 用粘合剂密封板密封板，短暂涡旋，然后短暂离心以收集井底的所有液体。
9. 将 96 孔板放入热循环仪中，将体积设置为 22 µL（如果适用），然后运行表 3 中的 FUPA 程序（在 105 ° C时打开加热盖）：

表 3. PCR 循环条件 (FUPA)
周期温度时间
1个 50 ℃ 10分钟
1个 55 ℃ 10分钟
1个 62 ℃ 20分钟
抓住 10 ℃ 长达 1 小时

10. 安全停止点：如果要停止，请将板在 10 °C 的热循环仪上放置最多 1 小时。如需更长时间，请在 -25 °C至 -15 °C下储存。

D. 连接索引

本节将索引 1 (i7) 和索引 2 (i5) 适配器连接到每个示例的片段。这些标签预先混合在一次性板中以确保独特的组合。每个文库必须具有唯一的双标签测序标签组合。当同一测序运行中包含超过 96 个样本时，请确保使用不同的标签集（ Illumina提供四组不同的组合：A 组、B 组、C 组和/或 D 组，允许多路复用最多 384 个库）。有关详细信息，请参阅Illumina索引适配器合并指南
( https://support-docs.illumina.com/SHARE/IndexAdapterPooling/Content/SHARE/IndexAdapterPooling/AmpliSeq/Pooling_fAS.htm )。
为避免文库制备失败，请勿在孔外将本节的试剂与消化的扩增子结合在一起。
1. 解冻以下试剂：
a. 开关溶液（黄色盖子； AmpliSeq Library PLUS 套件）：室温解冻，涡旋混合。
b. AmpliSeq CD 索引集：室温解冻，涡旋混合。
c. DNA 连接酶（蓝帽； AmpliSeq Library PLUS 试剂盒）：在冰上解冻。
2. 如果在本节之后立即继续下一节 E：
AMPure XP 微珠平衡至室温（至少 30 分钟）。剧烈涡旋以重悬。
3. 扩增子、索引板和准备好的试剂管的 96 孔板短暂离心，以收集孔底部的所有液体。
4. 扩增子和索引板的96 孔板中取出密封件。
5. 将（按列出的顺序）添加到带有部分消化的扩增子的 96 孔板的每个孔中：
a. 多分配器移液器和 0.2 mL Combitip的 4 µL 开关溶液（黄色盖帽）（多分配器移液器设置为 4 µL 的 48 个步骤；因此，您需要吸入和分配两次）。
注意：或者，使用带有 50 μL 开关溶液等分试样和多通道的 8 孔条将 4 μL 开关溶液移液器移入 96 孔板的每个孔中。
b. 使用多通道移液器和 10 µL 吸头，将2 µL 的AmpliSeq CD 索引添加到 96 孔板的相应孔中，其中带有部分消化的扩增子+ 开关溶液。
c. 在干净的 8 孔 PCR 条带的每个孔中分装 30 μL 的 DNA 连接酶试剂（蓝色盖帽）。从这里，使用多通道移液器，将 2 μL 的 DNA 连接酶试剂转移到带有部分消化的扩增子+ 开关溶液 +索引的 96 孔板的每个孔中。
6. 用粘合剂密封板密封板，短暂涡旋，然后短暂离心以收集井底的所有液体。
7. 将 96孔板放入热循环仪中，将体积设置为 30 µL（如果适用），然后运行表 4 中的 LIGATE 程序（在 105 ° C时打开加热盖）：

表 4. PCR 循环条件 (LIGATE)
周期温度时间
1个 22 ℃ 30分钟
1个 68 ℃ 5分钟
1个 72 ℃ 5分钟
抓住 10 ℃ 长达 24 小时

8. 如果索引板包含未使用的索引，请密封板并返回存储（-25 °C至 -15 °C ）。
9. 安全停止点：如果要停止，请将板在 10 °C 的热循环仪上放置最多24 小时。如需更长时间，请在 -25 °C至 -15 °C下储存。

E. 清理图书馆

本节使用Agencourt 用于清理文库的AMPure XP 微珠。图书馆将绑定到珠子上，珠子将被带到下一节。
1. 准备以下试剂：
a. AMPure XP 微珠平衡至室温（至少 30 分钟）。剧烈涡旋以重悬。
b. 新鲜制备 50 mL 的 70% 乙醇 ( EtOH ) 溶液（混合 35 mL 的 100% EtOH和 15 mL 的无核酸酶水）。
2. 对于应在本节之后立即继续的下一节 (F)，请准备：
a. 四管 1 × Lib Amp 混合物（黑色盖子； AmpliSeq Library PLUS 套件）：在冰上解冻并倒置以混合。
b. 两管 10 × Library Amp 引物（粉色帽； AmpliSeq Library PLUS 套件）：在室温下解冻并涡旋混合。
3. 将 96 孔库板（带有扩增子和索引）和准备好的试剂管短暂离心，以收集孔底部的所有液体。
4. 从 96 孔库板上取下密封件。
5. 多分液器移液器和 2.5 或 5 mL Combitips将 30 µL AMPure XP 珠子（移液前彻底涡旋）添加到 96 孔板中的每个孔中。
6. 用密封胶密封板并短暂涡旋。检查每个孔以确保混合物均匀（见图 3）；然后，短暂离心（低速 ~500 – 1,000 rpm）。

图3 。均质文库和微珠混合

7. 在 RT 孵育板 5 分钟。
8. 将盘子放在磁性支架上，取下密封件，等待混合物澄清（至少 2 分钟）（见图 4）。

图4 。磁力架上的珠子混合物。左图：混合物尚未完全澄清，仍然有点淡黄色。右图：混合物清晰，可以看到上一步添加的指标的蓝色。

9. 在磁力架上，文库与珠子绑定：
a. 使用多通道移液器（200 或 300 μL 吸头）从每个孔中取出并丢弃整个上清液。
b. 洗两次：
i ) 使用多点移液器和 0.5 mL Combitips将 150 µL 新鲜配制的 70% EtOH添加到每个孔中。
ii) 在室温下孵育直至溶液澄清（> 30 秒）。
iii) 在不干扰珠子的情况下，取出并丢弃上清液。
10. 用密封胶密封板并短暂离心（低速 ~ 500 – 1,000 rpm）。
11. 将盘子放在磁力架上（确保放置方向与步骤 E8 和 E9 相同，以使珠子保持在孔的同一侧），取下密封件，等待混合物澄清（约 30 秒） ).
12. 如下所示去除任何残留的EtOH ：
a. 尽可能多地从每个孔中去除残留的EtOH 。
b. 在没有密封的情况下将 96 孔板放在磁性支架上风干至少 10 分钟。
c. 检查水井以确保残留的EtOH已蒸发。如果它留在某些井中，请尝试用 10 μL 移液器移除并继续风干，直到 EtOH不再可见（图 4）。
注意：过度干燥或破裂的珠子不会对测定的性能产生负面影响。然而，残留的EtOH通过抑制放大导致下一节中的库准备失败。

F. 扩增文库

本节使用 PCR 来放大文库，以确保在Illumina系统上进行足够数量的测序。扩增反应包含珠子，这些珠子是从上一节中继承下来的。使用通用引物扩增文库。
1. 在上一节中，您应该已经准备好以下试剂：
a. 四管 1 × Lib Amp 混合物（黑色盖子； AmpliSeq Library PLUS 套件）：在冰上解冻并倒置以混合。
b. 两管 10 × Library Amp 引物（粉色帽； AmpliSeq Library PLUS 套件）：在室温下解冻并涡旋混合。
2. 如果在本节之后立即继续下一节 (G)：
AMPure XP 微珠平衡至室温（至少 30 分钟）。剧烈涡旋以重悬。
3. 通过结合表 5 中的试剂，在 15 mL 猎鹰管（用于 96 次反应）中制备放大主混合物。

表5. 扩增预混液配方
试剂一个文库的体积 (µL) 96 个文库的体积 (µL)（相当于 100 × ） X 库的体积 (µL)
1 × Lib Amp mix（黑帽） 45 4,500
10 × Library Amp 引物（粉色瓶盖） 5个 500
总体积 (µL) 50 5,000

4. 短暂涡旋扩增预混液并离心。
5. 从磁铁上取下 96 孔库板（来自上一节）。
6. 多点移液器和 5 mL Combitip向每个孔中添加 50 µL 扩增预混液。
7. 用粘合剂密封板密封板，短暂涡旋，然后短暂离心以收集井底的所有液体。
8. 将 96 孔板放入热循环仪中，将体积设置为 50 µL（如果适用），然后运行 AMP_7 程序，如表 6 所示（在 105 ° C时打开加热盖）：

表 6. PCR 循环条件 (AMP_7)
周期温度时间
1个 98 ℃ 2分钟
7 98 ℃
64 ℃ 15 秒
1分钟
抓住 10 ℃ 长达 24 小时

9. 安全停止点：如果要停止，请将板在 10 °C 的热循环仪上放置最多 24 小时。如需更长时间，请在 -25 °C至 -15 °C下储存。

G. 二次清理

本节使用AMPure XP beads 进行第二次净化，进行两轮纯化。
第一轮：高分子量 DNA 被珠子捕获并丢弃。文库和引物保留在上清液中，并转移到新的平板上进行第二轮纯化。
第二轮：保存的上清液中的文库被珠子捕获，而引物保留在上清液中。保存珠粒，然后从珠子上洗脱文库。
1. 准备以下试剂：
a. AMPure XP 珠子平衡至室温（至少 30 分钟）。剧烈涡旋以重悬。
b. 低 TE（瓶； AmpliSeq Library PLUS 套件）：在室温下解冻 45 分钟，涡旋混合。可以储存在 RT。
c. 新鲜制备 50 mL 的 70% EtOH溶液（混合 35 mL 的 100% EtOH和 15 mL 的无核酸酶水）。
2. 将 96 孔库板短暂离心以收集孔底部的所有液体。
3. 第一轮：使用多分液器移液器和 2.5 mL Combitips ，将 25 µL AMPure XP 珠子（移液前彻底涡旋）添加到 96 孔板中的每个孔中，其中约 50 µL 文库。
注意：此步骤将珠子添加到已经在反应中的珠子中。
4. 用密封胶密封板并短暂涡旋，然后短暂离心（低速 ~ 500 – 1,000 rpm）。珠子不需要完全重悬。
5. 在 RT 孵育 5 分钟。
6. 将盘子放在磁性支架上，取下密封件，等待混合物澄清（至少 5 分钟）。
7. 将整个上清液 (~ 75 µL) 转移到新板上。少量的微珠残留不会影响性能。
上清液包含所需的扩增子文库！
8. 第二轮：使用多点移液器和 5 mL Combitips ，将 60 µL AMPure XP 微珠与转移的上清液一起添加到新的 96 孔板中的每个孔中。
9. 用密封胶密封板并短暂涡旋；然后，短暂离心（低速 ~500 – 1,000 rpm）。
10. 在 RT 孵育 5 分钟。
11. 将盘子放在磁性支架上，取下密封件，等待混合物澄清（至少 5 分钟）。
12. 在磁力架上，执行以下步骤。这一次，图书馆绑定了珠子。
a. 使用多通道移液器（200 或 300 μL 吸头）从每个孔中取出并丢弃整个上清液。
b. 洗两次：
i ) 使用多点移液器和 0.5 mL Combitips将 150 µL 新鲜配制的 70% EtOH添加到每个孔中。
ii) 在室温下孵育直至溶液澄清（> 30 秒）。
iii) 在不干扰珠子的情况下，取出并丢弃上清液。
13. 尽可能多地从每个孔中去除残留的EtOH 。
14. 在没有密封的情况下将 96 孔板放在磁性支架上风干至少 5 分钟。
15. 从磁铁上取下板。
16. 在每个井中添加 30 μL 的低 TE。
17. 用密封胶密封板并短暂涡旋。然后，短暂离心（低速 ~500 – 1,000 rpm）。
18. 为确保珠子重新悬浮良好，如有必要，您可以通过移液器进行混合。
19. 将盘子放在磁性支架上，取下密封件，等待混合物澄清（至少 5 分钟）。
20. 将 27 μL 的上清液（包含库）转移到新的 96 孔板中。
21. 安全停止点：如果要停止，请在 -25 °C至 -15 °C下储存（最多 30 天）。

H. 量化库

等摩尔比例汇集样本文库，以实现每个样本的平衡测序输出。有两种方法可以对您的文库进行量化：使用 KAPA qPCR试剂盒，或者使用Qubit高灵敏度试剂和荧光计，具体取决于您实验室设备的可用性。

选项 1：KAPA 库量化
Illumina平台 (KAPA Biosystems )库量化工具包的制造商程序，这是一种基于qPCR的方法，用于量化P5 和 P7流通池两侧的Illumina库寡核苷酸序列。
1. mM Tris- HCl ，pH 8.0–8.5 (25 °C) + 0.05% Tween ® 20]中以 1:1,000,000 稀释要测试的文库。为了准确稀释并保持体积易于管理，连续稀释三倍 100 × 。因此，首先混合 3 µL DNA + 297 µL 稀释缓冲液并短暂涡旋，以进行第一个 100倍稀释。然后，混合 10 µL 的 100倍稀释 DNA + 900 µL 稀释缓冲液，第二次稀释至 10,000倍稀释，并短暂涡旋。然后，混合 10 µL 的 10,000倍稀释 DNA + 900 µL 稀释缓冲液，最终稀释至 1,000,000倍稀释，并短暂涡旋。
2. 确保 KAPA 图书馆量化套件的所有组件都完全解冻并彻底混合。
3. 如果该试剂盒是第一次使用，请将引物预混液 (10 × ) (1 mL) 添加到 KAPA SYBR ® FAST qPCR Master mix (2 × ) (5 mL)的瓶中。使用涡旋混合器彻底混合。
4. 以与样品相同的方式制备所需的内部对照稀释液（例如， PhiX文库稀释液）。
5. 每个库，包括控件，一式三份测量（因此，对于 96 个库，需要执行具有 KAPA 库量化的多个板）。准备 PCR 板布局，包括六个标准和内部控制（标准的 DNA 标准 0），它们均根据制造商的说明由 KAPA 套件提供，以及非模板控制（NTC，例如，无核酸酶水或缓冲液）。
6. 将 6 µL 主混合物 [KAPA SYBR FAST qPCR主混合物 (2 × ) + 底漆预混 (10 × )] 分配到 96 孔qPCR板的每个孔中。
7. 在所有 NTC 井中加入 4 μL的无核酸酶水。
8. 将 4 μL的每种 DNA 标准品分配到适当的孔/管中，从最稀的（标准品 6）到最浓缩的（标准品 1）。
9. 分配 4 μL的每个稀释库和要检测的内部控制。
10. 密封 PCR 板并转移到qPCR仪器（Roche LightCycler® 480）。
11. 使用表 7 的循环协议执行qPCR ，在仪器软件中选择绝对定量选项。根据需要调整运行参数（例如，记者、参考染料、增益设置等）。

表 7. qPCR循环条件（KAPA 定量）
周期温度时间
1个 95 ℃ 5分钟
35 95 ℃
60 ℃ 30 秒
45 秒
熔解曲线 65 – 95摄氏度

选项 2： Qubit DNA 浓度测量
使用量子比特® dsDNA HS 检测试剂盒，用于按照制造商的程序确定文库中双链 DNA 的浓度。
1. 为标准和样品设置所需数量的 0.5 mL 管。量子位® dsDNA HS Assay 需要两个标准品。
2. 通过稀释Qubit ®制备Qubit ®工作溶液 Qubit ®中的dsDNA HS 试剂 1:200 dsDNA HS 缓冲液。每次准备Qubit ®工作溶液时都使用干净的塑料管。对于 96 个样品，通过混合制备 20 mL 工作溶液：
a. 19.9 mL量子位® dsDNA HS 缓冲液。
b. 100 µL量子位® dsDNA HS 试剂。
3. 向用于标准的两个管中的每一个添加 190 μL的Qubit工作解决方案。
4. 将 10 μL的每种Qubit ®标准品加入适当的试管中，然后涡旋混合2–3 秒。小心不要产生气泡。
5. 将 197 μL的Qubit工作解决方案添加到用于库的每个管中。
6. 3 μL添加到适当的试管中，然后通过涡旋混合2-3 秒。小心不要产生气泡。
注意：如果您怀疑文库浓度太低，您可以在Qubit反应中使用更大体积 (5 – 20 μL ) 的文库。如果是这种情况，还要在步骤 H5 中调整Qubit工作溶液的体积，以确保添加库后的最终体积为 200 μL 。注意不要使用过多的库，因为您将需要足够的体积（最多 6 µL）来制作下一节中的池。如果在第一次测量后文库浓度过高（即超出Qubit套件的线性范围），请稀释文库（例如 1:2 或 1:4）并再次测量以获得准确的浓度。
7. 让所有试管在室温下孵育 2 分钟。
注意：您可以将文库以 16 – 24 批次的形式添加到工作溶液中，然后孵育和测量。同时，将未使用的管子放在黑暗中，例如用铝箔覆盖。
8. Qubit ® 2.0荧光计的主屏幕上，按 DNA，然后选择dsDNA High Sensitivity 作为分析类型。显示标准屏幕。
9. 在标准屏幕上，按是阅读标准。
10. 将含有标准 #1 的试管插入样品室，盖上盖子，然后按读取。阅读完成后（~3 秒），删除标准 #1。
11. 将含有标准 #2 的试管插入样品室，盖上盖子，然后按读取。读数完成后，取出标准 #2。校准完成后，仪器会显示样品屏幕。
12. 将样品管插入样品室，盖上盖子，然后按读取。读数完成后（约 3 秒），取出样品管。
13. 仪器在样品屏幕上显示结果。显示的值对应于将样品稀释到检测管中后的浓度。要找到原始样品的浓度，您可以记录该值并稍后在 Excel 模板中执行计算。要计算样品的浓度，请使用以下等式：
浓度 = 测量值（稀释样品的浓度） × (200/V)，其中 V 是您添加的库的体积，在本例中为 3 µL。
14. 重复步骤 12-13，直到读取所有样本。

I. 稀释和合并文库

每个样品和对照的文库将分别用低 TE 稀释至相同浓度 (2 nM )，然后以等摩尔比汇集，以获得所有样品的平衡测序输出。库数量将根据模板输入量（例如，不同的寄生虫密度）而变化。
1. 解冻冷冻的低 TE 缓冲液（ AmpliSeq文库准备工具包）。
2. 使用 KAPA 或Qubit套件（上一节）确定的文库浓度，确定文库的摩尔浓度。
a. 对于使用 KAPA 套件进行的测量，请使用公司提供的模板和 PCR 板中包含的标准曲线来确定大小调整的摩尔浓度。
注意：使用 KAPA 试剂盒，从具有寄生虫密度的干血斑样本中制备文库 ≥ 5 p/µL 通常具有 10 – 1000 nM范围内的大小调整摩尔浓度。
b. 对于Qubit测量，我们使用以下公式：(c * 106) / (660 * 库大小)，其中 c 是使用 Qubit 测量的浓度 (ng/µL ) 。
注意：您可以使用例如Tapestation (Agilent) 或使用 350 bp作为AmpliSeq的默认值来确定您的库的平均大小。（使用Qubit ，从寄生虫密度 ≥ 5 p/µL 的 DBS 样本制备的文库通常具有 1 – 100 nM范围内的大小调整摩尔浓度。）
c. 每个文库达到 2 nM浓度所需的稀释度。
3. 如模板所示，在 96 孔板中使用低 TE将每个库稀释至 2 nM 。如果文库（未稀释）的浓度（摩尔浓度）低于 2 nM ，则将 6 µL 未稀释文库添加到最终的2 nM板中。
注意：注意不要从用于稀释的文库体积太小（至少 3 µL）开始，因为这会增加最终浓度的不准确性。此外，注意将稀释的最终体积保持在 200 µL 以下；否则，稀释板的孔会溢出。如果需要，在单独的 Eppendorf 管中稀释以获得更大的体积，然后将 50 µL 的稀释文库转移到稀释板中的适当孔中。
4. nM库的体积相等的池：
a. 使用多通道移液器将 96 孔板行中每个孔中的 5 μL 组合到一个 8 孔条中（即，从每一行中创建一个池）。通过移液器混合 10 次。
b. 将 8 孔板中的全部行池体积合并到一个 1.5 mL LoBind ®管中。
注意：此合并示例适用于 96 个样本。在一次运行中对超过 96 个样本进行排序时，将要包含在运行中的所有样本的所有2 nM文库以相同的体积汇集到一个最终池中。当运行超过 96 个样本时，注意合并使用不同标签集制备的文库；否则，您将无法分离来自不同平板的序列。
5. 最好在稀释后立即对稀释后的库池进行测序。如果不可能，将稀释后的文库储存在 -20 °C下长达一周。

J. 准备文件以在MiSeq上进行测序

MiSeq上设置测序反应所需的样本表所需的步骤和设置。
1. 使用Illumina Experiment Manager 软件创建样品板：
a. 从主屏幕中，选择创建样品板。
b. 选择AmpliSeq CD 索引板 A（或 B、C 或 D，具体取决于您在文库制备过程中使用的索引套件），然后选择下一步。
c. 在 Unique Plate Name 字段中，输入样品板的唯一名称。（不要在样品 ID 和板名称中使用特殊字符和空格。）为 Index Reads 选择 2 (Dual)，这应该是默认设置。选择下一步。
d. 根据您喜欢的视图，选择表格或板选项卡。
e. 为每个孔输入一个唯一的示例 ID（例如，通过从 Excel 布局复制粘贴）。
f. 设置索引（在表选项卡中）。
使用 96 孔标签板的默认布局时，您可以自动填充标签：选择左下角的 Apply Default Index Layout 按钮。
g. 当您使用与标准索引板布局不同的布局时：
i ) 在 Index Well 字段中选择一口井。
ii) 在 Index1 和 Index2 字段中，选择用于每个 Index Read 的标签适配器。
h. 检查你的布局；所有样品的有效条目将变成白色而不是棕色/灰色。如果一切都有效，请选择完成，然后将样品板文件保存在所需位置。
2. 使用Illumina Experiment Manager 软件，创建样本表：
a. 从主屏幕中，选择创建样品表。
b. 选择MiSeq ，然后选择下一步。
c. 选择适当的应用程序（其他 -> FASTQ Only，只生成fastq文件用于后续分析），然后选择下一步。（或者，可以使用 DNA Amplicon应用程序和basespace云系统或本地运行管理器中的清单文件直接分析变体。）
d. 在 Reagent Kit Barcode（试剂盒条码）字段中，输入 SBS 试剂盒第 1 盒或第 2 盒标签上以 RGT 开头的试剂盒 ID，然后是位于条形码下方的八位数字。（如果在此阶段未知，您可以稍后更正。）
e. 选择合适的文库准备工作流程（ AmpliSeq Library PLUS for Illumina ）。
f. 选择适当的索引适配器（ AmpliSeq CD 索引板 A、B、C 或 D，或 384，当组合超过 96 个样本时）。
g. 默认情况下，索引读取应为 2（双）。
h. 输入实验名称、调查员姓名、描述和日期。
i. 输入预期的测序日期。
j. 选择配对端读取类型。
k. 为读取 1 和读取 2输入比循环数（对于MiSeq v3 600 循环试剂盒为 301）多 1。
l. 在特定于工作流程的设置中，选择使用适配器修剪（默认）。
m. MiSeq样本表选择样本。
n. 通过选择选择板来选择示例，然后导航到在步骤 J1 中准备的示例板。
o. 选择要包含在测序运行中的水井（全选）。
p. 选择添加所选样本。
注意：确保池中包含的所有库都在具有相应索引的样本表中。因此，如果您在一次运行中运行超过 96 个样品，请将所有板添加到一个样品表中。
q. 选择完成，然后将样品表文件 (*.csv) 保存在所需位置。在 Excel 中查看样品表（样品 ID 中不应有空格或特殊字符）。

K. 测序的最后准备

在本节中，汇集的文库在加载到MiSeq墨盒上进行测序之前被变性和稀释。以相同浓度将对照文库 ( PhiX ) 添加到池中，并将作为MiSeq上测序反应的对照。此外，通过添加PhiX ，您将增加测序运行期间的核苷酸多样性，这将提高测序质量，因为恶性疟原虫基因组以及此测定中的目标区域都富含 A 和 T 核苷酸。
1. NaOH的新鲜稀释液：
a. 将试剂混合在 Eppendorf 管中：
i ) 800 µL 无核酸酶水。
ii) 200 µL 1.0 N NaOH 。
b. 通过倒置几次来混合管子。
c. 12 小时内使用。
2. 准备 HT1：
a. 解冻 HT1 缓冲液（ Miseq试剂盒 v3， Illumina ）。
b. 如果解冻后不立即使用，请将 HT1 缓冲液储存在 2 – 8 °C直至需要。
3. 变性库：
a. 将 5 µL 的文库池与 5 µL 的 0.2 N NaOH结合。
b. 短暂涡旋，然后短暂离心。
c. 在 RT 孵育 5 分钟。
d. 添加 5 µL 200 mM Tris- HCl ，pH 7.0。
e. 将 985 μL 的预冷 HT1 缓冲液添加到变性池的管中。结果是一个 10 pM的变性文库。涡旋并短暂离心。
f. 将 10 pM文库置于冰上，直到您准备好进行最终稀释。
4. 将文库池稀释至最终加载浓度。
用预冷的 HT1 缓冲液稀释至最终装载浓度为 600 μL的最终体积：
KAPA 量化文库下午18点
7 pM用于Qubit量化库
如果要停止，请密封试管并在 ‑25°C 至 ‑15°C 下储存。
5. – 5% PhiX 的加标文库池以包括质量控制（建议 PF AmpliSeq文库使用 5%，因为 GC 含量较低，因此文库多样性较低）。
a. PhiX的原液稀释至与最终文库相似的浓度（7 或 18 pM ）。
i ) 取 570 µL 的 7 pM文库
ii) 添加 30 µL PhiX
b. 您获得了一个 7 pM文库池，其中加入了 5% PhiX ，用于根据制造商和试剂盒的说明加载到试剂盒和MiSeq上。保持在冰上直到加载。

L. 准备MiSeq和加载库池

1. ，根据 MiSeq 控制软件上的说明对MiSeq执行运行前清洗。
2. 在 RT 的水浴（或装满一层水的水槽）中解冻MiSeq V3 试剂盒中的试剂盒。不要将整个墨盒浸入水中，仅将底座浸入水中。墨盒上有一个不得超过的最大水位指示线。整个墨盒解冻需要1-2小时。
3. 翻转试剂盒 10 次以混合试剂。检查所有试剂是否已解冻、充分混合且无沉淀。
4. 轻轻敲击工作台上的墨盒以减少试剂中的气泡。
5. 如果不立即使用，请将试剂盒放在一边，在冰上或 2–8 °C 下最多存放 6 小时。为获得最佳结果，请直接上样并设置运行。
6. 找到覆盖标有加载样品的储层的密封件，并用纸巾/ Kimwipe清洁箔片，然后用干净的 1 mL 移液器尖端刺穿它。
7. 将 600 µL 准备好的变性 7 pM库池与 5% PhiX spike-in 添加到标记为 Load Samples 的水库中；避免接触密封件。
8. MiSeq系统上设置运行：
a. MiSeq控制软件选择序列。
b. 选择使用 Local Run Manager 设置运行并按照步骤操作，直到打开 Local Run Manager。
c. 选择创建运行和适当的分析模块：
i ) 选择模块GenerateFASTQ以排序并生成可以使用数据分析选项中描述的 Linux 管道进行分析的fastq文件。
ii) 选择模块 DNA Amplicon以使用清单文件在MiSeq系统上执行变体调用。
注意：您需要在MiSeq系统上安装此模块才能使用它。您还需要按照 Local Run Manager扩增子分析模块工作流程指南 ( https://support.illumina.com/content/dam/illumina-支持/文档/文档/software_documentation/local-run-manager/local-run-manager-dna-amplicon-workflow-guide-1000000048047-03.pdf）。
d. 选择 Import sample sheet 导入在 J 部分准备的样品表。
e. 检查设置、样本和索引，并为运行添加名称和描述（可选）。
f. 选择保存运行。您的运行现已准备好进行测序。
9. 在本地运行管理器仍然打开的情况下，选择您刚刚创建的运行；然后，选择右下角的下一步。
10. 用按钮松开夹子，从MiSeq机器上取下先前加载的流动单元。
11. Kimwipe或乙醇擦拭布小心清洁新流通池，直到表面干净为止。将其放入MiSeq系统中，合上夹具，然后合上流动槽室的盖子。机器将检查 ID 并正确放置流动槽。选择下一步。
12. 倒置 PR2 瓶以混合并打开它。
13. 打开试剂室门，抬起把手直至锁定，然后用 PR2 瓶更换洗瓶。清空废物容器。
14. 关闭手柄和试剂室门。 MiSeq将检查所有材料是否放置正确并读取 PR2 瓶的 ID 。检查完成后单击“下一步” 。
15. 打开试剂仓门和试剂冷却器门，取出清洗盒。将装有您加载的文库的试剂盒插入试剂冷却器，将其向后滑动。
16. 关闭试剂冷却器门和试剂仓门。 MiSeq将检查所有材料是否放置正确并读取试剂盒的 ID 。检查完成后单击“下一步” 。
17. 检查运行的参数 [例如，读取类型（配对末端）、读取长度（2 × 300 + 标签读取）]，并在正确时单击下一步或编辑以进行更改。
18. 系统将执行完整的运行前系统检查。完成后，如果一切正常，请选择“开始运行”以开始排序。使用 600 周期MiSeq试剂盒 V3 运行需要约 56 小时才能完成。
19. 运行完成后， fastq文件将准备好复制到 USB，然后复制到您的计算机进行分析（或者，如果您选择在Basespace上共享运行，您可以在您的basespace帐户中访问和下载它）。

数据分析

Miseq测序仪使用自动解复用的原始测序读数生成fastq文件（IE，使用步骤 J 中生成的样本表中的索引，为每个样本分离读取，并为每个单独的样本生成单独的fastq文件）。我们在Unix操作系统台式计算机上使用内部分析管道处理这些fastq文件，这在Kattenberg等人中有所描述。 (2022) 并在下面进行了描述。或者，为了在测序后进行快速自动变体调用，可以使用MiSeq上的本地运行管理器 ( Illumina )分析您运行的fastq文件，并根据本地运行使用清单文件（附加材料）使用DNA- Amplicon方法上一节中解释的管理器指令（图 5）。

图5 。变体调用程序流程图

变体检出

在我们的内部管道( https://github.com/Ekattenberg/Plasmodium-AmpliSeq-Pipeline )中，处理生成的序列以生成变体文件 ( vcf )，其中仅包含样本具有序列的位置与参考序列不同。在一系列脚本中，执行以下步骤：
1. FastQC生成质量控制报告。 FastQ Screen 用于确定污染源（例如，人类序列）。
2. 使用Trimmomatic （设置：ILLUMINACLIP：2:30:10 LEADING :3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36）对Fastq文件进行修整，以删除适配器序列和质量差的读取。
3. 修剪后的读数随后与 3D7 参考基因组（版本 plasmoDB-44）对齐使用 Burrows-Wheeler 对准器 (v0.7.17) （ Li等人，2009 年）。
4. 对齐统计信息是使用 Picard 的CollectAlignmentSummaryMetrics生成的。
5. 随后，使用HaplotypeCaller （GATK，v4.1.2）和GenotypeGVCF （GATK，v4.1.2）联合调用包括重叠区域的扩增子中的变体。
6. 变体被硬过滤[QUAL > 30，整体深度（DP）> 100， RMSMappingQuality （MQ）> 50， QualByDepth （QD）> 1.0， ReadPosRankSumTest （ ReadPosRankSum ）> -10， StrandOddsRatio （SOR）<4，基因型场深度（ DP) > 5].
7. 通过使用SnpEff (v4.3T) 注释完成，产生 2,146 个用于统计和群体遗传分析的高质量基因型。

微卫星 (MS) 变体检出

由于串联重复长度较短，因此使用不同的方法调用 MS 等位基因。
1. 使用 Burrows-Wheeler aligner (v0.7.17)（Li 等人，2009）将原始fastq文件与仅包含四个 MS扩增子区域（ poly-alpha、TA81、ARAII 和 PfPK2 ）的参考序列进行比对。
2. Genotan v0.1.5 (Tae et al., 2014)对重复序列进行重新比对。
3. HipSTR确定短串联重复长度（Willems 等人，2017）。
注意：由于HipSTR是为二倍体基因组制作的，因此仅调用测序读数中存在的两种主要 MS 基因型。虽然这不允许我们准确估计感染的复杂性（COI，即共感染克隆的数量），但我们可以区分单克隆（COI = 1）与多克隆感染（COI ≥ 2，如果两个发现 ≥1 个 MS 位点的 MS 等位基因）。

绩效指标的计算

每个样本中的扩增子的测序深度，我们计算了每个样本或每个扩增子的变异文件中所有位点的中位测序深度。为了计算平均值，我们使用了在vcf中每个位置过滤后的覆盖深度（ vcf文件中的格式字段 DP ）。对齐覆盖率计算为通过过滤器的碱基数（来自AlignmentSummaryMetrics报告）除以PF AmpliSeq分析中靶向的碱基数 (57445 bp ) 。

分析的纳入标准

缺失比例最低，对齐覆盖率最高。

统计分析

扩增子的平均读取深度与所有扩增子的平均深度相比，确定每个样本是否存在hrp2和hrp3基因，从而得到深度比。先前分型样本的对数转换平均深度比用于定义每个扩增子的分类阈值（ Kattenberg等人，2022）。 hrp2和hrp3存在/不存在的最终分类是基于具有缺失的扩增子的比例。由于hrp2和hrp3基因的重复性质和同源性， hrp3与hrp2的读数之间发生了错位；因此，我们使用了一个保守的截止值，这有时会导致一个灰色区域，当大多数扩增子不一致时，删除/存在是不确定的，正如Kattenberg等人详细解释的那样。 (2022)。 hrp2的一个扩增子(AMPL3593062) 没有用于分类，因为它没有提供区分能力。创建了快速诊断测试 (RDT) 失败（分类为hrp2和hrp3均不存在）与 RDT 可检测（ hrp2和/或hrp3存在）的最终变量，还允许对在两者之一中不确定的样本进行分类基因，以防其他基因存在。

vcf文件中的等位基因深度计算的，以使用内部 R 脚本反映复杂感染中的真实群体等位基因频率。
1. 首先，通过计算vcf中等位基因深度的比率，计算每个样本中每个位置的 AF 。
2. 接下来，我们将上一步中所有样本的 AF 相加，得到 SUM-AF。
3. 然后，将上一步计算的 SUM-AF 除以该位点所有等位基因的样本内等位基因频率之和（第一步）。

笔记

该测定法已通过低错误率、高精度、高覆盖深度的验证，以最佳性能分析滤纸上收集的血液样本，恶性疟原虫寄生虫密度≥60 p/µL，由Mangold PCR确定（ Mangold等人）等人，2005 年）。在寄生虫密度 < 60 p/µL 的恶性疟原虫样本中，PF AmpliSeq分析之前的选择性全基因组扩增 ( sWGA )增加了读取和基因型检出的数量，但也增加了错误率。
由于细胞中线粒体基因组的丰度较高，因此线粒体靶标的测序深度高于核靶标。在更高版本的测定中，我们移除了线粒体靶标，这对于我们的研究目的来说不太有趣。文库制备前的sWGA平衡了细胞核与线粒体扩增子的覆盖范围。
Qubit套件进行库量化比使用 KAPA 套件进行基于 PCR 的量化更快、更稳健（更好的均衡库）。

致谢

AmpliSeq分析的开发和验证由比利时发展合作组织 (DGD) 根据 DGD 和 ITM 之间的框架协议计划（FA4 秘鲁，2017-2021）资助。该协议源自原始研究论文，题为秘鲁亚马逊地区的疟疾分子监测，采用新型高度多重恶性疟原虫 JH Kattenberg等人的AmpliSeq分析，目前正在微生物学谱中出版（DOI：https://doi.org/10.1128/spectrum.00960-22）。

利益争夺

作者声明他们没有竞争利益。

伦理

秘鲁大学在秘鲁收集了用于验证 PF AmpliSeq分析的样本 Cayetano Heredia (UPCH) 和美国海军第 6 医学研究组 (NAMRU-6)。仅当签署的知情同意书包含未来使用条款并且二次使用通过安特卫普热带医学研究所机构审查委员会批准（参考文献 1417/20）时，才会将个人纳入本研究。

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