材料和试剂
生物材料
1. 十二日龄拟南芥生态型哥伦比亚 (Col_0) 幼苗
解决方案
1. DEPC处理水 Milli-Q 水在室温下用 0.2% (v/v) DEPC 处理 24 小时，然后在玻璃瓶中高压灭菌 20 分钟。使用前将瓶装水在室温下冷却 24 小时。（未开瓶可无限期保存） 2. 所有试剂库存（蔗糖溶液、环己酰亚胺、RNase 抑制剂和 DTT 除外）均应在玻璃烧杯中制备，并在室温下避光储存在 100 mL 玻璃瓶中。 (三个月后换新货) 3. 放线菌酮（CHX，50 mg/mL）原液是通过将 50 mg 放线菌酮重新悬浮在 1.5 mL 试管中的 1 mL 乙醇中制成的。将库存溶液储存在 -20 °C。 (三个月后换新货) 4. 氯霉素（CHL，50 mg/mL）原液是通过将 50 mg 氯霉素重新悬浮在 1.5 mL 试管中的 1 mL 乙醇中制成的。将库存溶液储存在 -20 °C。 (三个月后换新货) 5. 二硫苏糖醇（DTT，1 M）原液是通过将 0.154 g DTT 重新悬浮在 1.5 mL 管中的 1 mL 水中制成的。将库存溶液储存在 -20 °C。（两个月后换新货） 6. 在玻璃烧杯中制成的蔗糖溶液需要通过 0.2 µm PVDF 过滤瓶过滤，并在 4°C 的黑暗中储存。（一个月后换新货。每次使用前，务必摇动瓶子以检查是否有混浊现象。丢弃并根据需要制作新的解决方案） 7. 穿孔溶液应在玻璃瓶中制备，并在液体循环中高压灭菌 20 分钟。（可在室温避光处无限期保存） 8. 100 mL 1 M Tris-HCl (pH 8.4) 是通过将 12.14 g Tris 溶解在 80 mL 去离子水中并使用 0.1 N HCl 将 pH 值调节至 8.4 制成的。达到所需的 pH 值后，使用去离子水将 1 M Tris-HCl 溶液的体积调整至最终 100 mL。（原液常温保存，建议三个月后更换新原液） 9. 裂解缓冲液（1,000 µL 在 2 mL 管中）（参见配方） 10. 15%（或 50%）蔗糖溶液（100 mL）（参见配方） 11. 打孔溶液 (100 mL)（参见配方）
食谱
1. 裂解缓冲液（1,000 µL 在 2 mL 管中）从每个实验的库存解决方案中制作新鲜的。试剂终浓度数量 Tris-HCl（1 M，pH 8.4）氯化钾(0.5 M) 氯化镁2 (0.5 M) 脱氧胆酸 (10%) 聚氧乙烯10 十三烷基醚 [20% (w/v)] 放线菌酮 (50 毫克/毫升) RNase 抑制剂 (40 U/µL) 200毫米 50毫米 25毫米 1%（体积/体积） 2%（体积/体积）
50 微克/毫升 40 单位/毫升 200 微升 50 µL 25 µL 100 µL 100 µL
1 微升 1 微升氢气_ _ 不适用 523 微升全部的不适用 1,000 微升
2. 15%（或 50%）蔗糖溶液（100 mL）试剂终浓度数量 Tris-HCl（1 M，pH 8.4）氯化钾(0.5 M) 氯化镁2 (0.5 M) 蔗糖 200毫米 50毫米 25毫米 15% 或 50%（重量/体积） 20毫升 10毫升 5毫升 15 或 50 克氢气_ _ 不适用 40 毫升全部的不适用补足最终体积至 100 mL
3. 穿孔溶液 (100 毫升) *注意：应以 10 mL 的增量添加水。在加入更多水之前让溶液完全混合。完全溶解时，蔗糖会占据相当大的体积。试剂终浓度数量蔗糖溴酚蓝 (0.1% (w/v)) Tris-HCl（1 M，pH 8.4） 60%（重量/体积） 0.02% (体积比) 1毫米 60 克 20毫升 100 µL 氢气_ _ 不适用看注释* 全部的不适用 100 毫升

实验室用品
1. 1.5 和 2 mL 管（Thermo Fisher，目录号：AM12450 和 AM12475） 2. 移液器（200–1,000、20–200、2–20 和 0.2–2 µL） 3. 不含 DNase/RNase 的吸头（1,000、200、10 µL） 4. 1.5 mL 管架 5. 7/16 × 13/8 英寸（11 × 34 毫米）2.2 mL 聚丙烯管（Beckman Coulter，目录号：347357） 6. 用于梯度管穿孔的 19 号针（ Fisher Scientific，目录号：14-826-52 ） 7. 封口膜（ Fisher Scientific，目录号：S37440） 8. 一次性瓶顶过滤器（Thermo Fisher，目录号：597-4520） 9. 一次性瓶过滤器单元（Thermo Fisher，目录号：568-0020） 10. 永久墨水标记 11. 用于梯度混合器出口（直径 1/16）的透明管（6 英寸长） 12. 湿巾（Fisher Scientific，目录号：06-666C） 13. 平头钳（Fisher Scientific，目录号：16-100-116） 14. 瓷杵和研钵（Fisher Scientific，目录号：S27075） 15. 冰桶（也可以用保丽龙盒代替） 16. 基本活页夹回形针（中号） 17. 手套 18. 带锥形端的不锈钢抹刀 19. Tris（分子级）（Promega，Fisher Scientific 目录号：PR-H5133） 20. KCl （Fisher Scientific，目录号：AC418205000） 21. MgCl 2 （Fisher Scientific，目录号：M33-500） 22. 脱氧胆酸（Fisher Scientific，目录号：BP349-100） 23. 聚氧乙烯10 十三烷基醚（Millipore Sigma，目录号：P2393-100G） 24. 放线菌酮（Millipore Sigma，目录号：01810-G） 25. 氯霉素（Millipore Sigma，目录号：220551-25GM） 26. 40 U/mL RNase 抑制剂（Promega，目录号：N2515） 27. 蔗糖，分子生物学级（Millipore Sigma，目录号：573113） 28. 溴酚蓝（Fisher Scientific，目录号：AAA1846909） 29. 二硫苏糖醇（DTT）（ Thermo Fisher Scientific，目录号：R0861） 30. Murashige和 Skoog (MS) 植物基础盐（MP Biomedicals，Fisher Scientific 目录号：ICN2623022） 31. RNaseZap TM RNase 去污溶液（ ThermoFisher ，目录号：AM9780） 32. 液氮 33. 铝箔

设备
1. 梯度混合器（ Buchler Instruments）。此特定产品的目录号不可用，因为没有供应商再支持此产品。对于梯度混合器的定制制造，请参见图 2。 2. 台式超速离心机（Beckman Coulter，目录号：A95761 或等效物） 3. TLS-55 吊桶式转子，带四个吊桶，最多四个梯度（ Beckman Coulter，目录号：346936） 4. 梯度站或任何等效的梯度分馏器（ Biocomp ，目录号：153-002） 5. ISCO UA 5 100 吸光度/荧光监测器。该特定产品的目录号不可用，因为供应商已退出市场。备选产品信息：BR-188 密度梯度分级分离系统，带峰图数据采集系统 ( Brandel ) 6. 带转子的台式离心机可容纳 1.5 mL 试管。如果没有冷冻离心机，则可以将非冷冻离心机放置在 4 °C 的冷藏室中作为替代 7. 磁力板搅拌器 8. 磁力搅拌棒（Fisher Scientific，目录号：14-513-93）。用钳子将磁力搅拌棒切成两半，并将两半存放在 1.5 mL 管（微搅拌棒）中。笔记：应使用温水清洁此微型搅拌棒并小心存放。 9. 精度为 0.001 g 的称重天平 10. 涡流 11. 滴定管架
软件和数据集
这 BR-188 密度梯度分级分离系统配备了峰图数据采集系统软件。请参阅 E 部分中的注释，了解在没有峰图数据采集系统软件的情况下开发多核糖体图谱。

程序
A. 种植拟南芥幼苗和组织储存
在 1/2 × MS 植物培养基上使拟南芥种子发芽的方法。生长 12 天后，将幼苗收获到 1.5 mL 试管中，在液氮中快速冷冻，然后储存在 -80 °C 。注意：建议在 1-2 个月内使用此样品以获得最佳的实验重现性。
B. 梯度制造商和一般设置的准备情况（有关详细信息，请参见图 1A 和图 2A）
注意：在开始以下程序之前，建议在手套上使用RNaseZap TM RNase 去污溶液。 1. 在多糖体分析实验前一天，用温自来水中稀释的洗碗皂冲洗梯度仪 1-2分钟，然后用温自来水清洗几分钟。微搅拌棒只需用温水清洗并用湿巾擦干。 2. 用 DEPC 处理过的水冲洗梯度发生器两次，然后在几层湿巾上风干。 3. 在稳定的工作台上安排以下物品：移液器、吸头、滴管架、磁力搅拌板、磁力搅拌棒、2.2 m L 聚丙烯离心管、1.5 mL 管架、液体和固体废物垃圾桶以及 15% 的库存溶液和 50% 蔗糖、CHX、CHL 和 DTT。 4. 在磁力搅拌器板上方约 0.5 – 1 英寸。 5. 将微型磁力搅拌器棒添加到连接到出口管（Well-II）的腔室中，然后打开磁力搅拌器板以确认微型搅拌器棒的旋转。 6. 将推拉阀转向自身，关闭混合室（Well-II 和 Well-I）之间的梯度导管。 7. 将活页夹夹在出口管上（距离梯度发生器出口阀 1 英寸）。 8. 在出口管的末端连接一个 10 µL 移液器尖端，使用出口管的宽边和洗脱的尖端侧。 9. CHL-CHX-DTT 混合：将 15 µL 的 CHX 和 CHL 库存和 1.5 µL 的 DTT 库存添加到同一个 1.5 mL 管中，并在室温下涡旋混合 10 – 20 秒。储存在冰上。
图 2. 梯度混合器的示意图。 A.梯度混合器的原始视图。仪器底部的推拉阀朝向自身，表明两个梯度室之间的连接是封闭的。 B – D.不同视角的梯度混合器轮廓显示特定测量值。缩写：in = 英寸， id = 内径
C. 2 mL 蔗糖梯度的制备，用于多核糖体分析前的预运行
1. 沿每个 Well-I 和 II 的侧壁添加 2.1 μL 的 CHL-CHX-DTT 混合物。 2. 在 Well-II 中加入 1 mL 的 15% 蔗糖溶液，在 Well-II 中加入 1 mL 的 50% 蔗糖溶液（磁力搅拌器应在 Well-II 中旋转，同时将 50% 蔗糖溶液添加到 Well-II）（参见图1一）。 3. 轻轻取下活页夹，让 50% 的蔗糖溶液暂时流入出口管约 1 厘米处。快速夹回管路。笔记：为了精确控制 50% 蔗糖溶液的流量，可以将出口管的尖端小心地插入连接到 20-200 µL 移液器的 200 µL 尖端的尖端。取下夹子后，调整移液器，使 50% 蔗糖溶液恰好 1 厘米进入出口管。完成此步骤后，再次夹紧管道并取下 200 μL 尖端，然后继续下一步。 4. 将推拉阀转向水平位置，打开混合室（Well-I 和 Well-II）之间的梯度导管。 5. 需要用戴手套的手指密封 Well-I 的顶部，然后轻轻向下压以增加压力，从而去除两口井之间通道中的气泡。注意：这会将截留在阀门通道中的气泡释放到 Well-II 中。 6. 在确保出口与 Well-II 底部处于同一高度的同时，将出口管的尖端放入 2.2 mL 超离心管的底部，然后轻轻打开夹具。缓慢降低离心管，让溶液在重力作用下沿离心管壁流动。确保解决方案从 Well-I 和 Well-II 中均匀排出。当 Well-II 中的溶液几乎结束时（剩余约 200 μL），顺时针倾斜梯度制造器，直到梯度制造器的底部接触磁力搅拌器板，同时确保出口管末端的尖端接触顶部完成的渐变。注意：此步骤将确保所有液体流出。 7. 将完成的梯度放入 1.5 mL 管架中，并用铝箔覆盖。重复步骤 B6 – 9 和 C1 –6以制作更多渐变。 8. 完成所有梯度后，通过在完成的梯度顶部轻轻添加 15% 蔗糖溶液，将每个梯度管的重量调整为 2.800 g。 9. 对于预运行，使用镊子将梯度管放入TLS-55 转子桶（预冷于 4 °C ) 并确保使用 15% 蔗糖溶液将重量与其他试管相匹配。笔记：重要的是用相同的重量旋转转子的所有四个桶。 10. 4 °C下以 50,000 rpm (213,626.2 × g )的转速旋转70 分钟（减速度 = 0，表示没有刹车）。 11. 运行后，使用钳子将梯度管取出并放入 1.5 mL 管架中。用铝箔覆盖所有梯度，并在 4 °C下储存在稳定的底座上，不要摇晃。注意：预运行梯度最多可保存 24 小时。
D. 细胞裂解和蔗糖密度梯度离心
注意：在多核糖体分析前两天，用洗洁精清洗研钵和研杵，并用自来水冲洗。为每个样品使用一套新的以防止交叉污染。空气干燥，用铝箔和高压灭菌器将一个研钵与杵包裹起来，使用干燥设置 30 分钟。实验前一天（步骤 A 和 B 的一天），将研钵杵设置在 -20 °C （或最好在 -80 °C ）。（这样做是为了减少冷却研钵研杵所花费的时间并节省液氮。） *以下部分中的术语预冷是指使用液氮来达到最冷的温度。 1. 将液氮加入冷研钵中，直到观察不到液氮沸腾。从 -80 °C冰箱中收集您的组织样本，并让它们漂浮在装有液氮的杜瓦瓶中，直到轮到它们为止。 2. 将冷冻组织从储存管中加入研钵中，用研杵在液氮中研磨成细粉。（这一步很关键，通常需要 4-5分钟。每 1 分钟后，将一些液氮轻轻加入砂浆中，以保持地面材料冷。）将砂浆放在保丽龙泡沫塑料盒中也有帮助用液氮冷却。 3. 使用预冷铲，在预冷 1.5 mL 管中称量 150 mg 粉碎组织粉末。注意：在等待期间，应将带开盖的 1.5 mL 管放在架子中，架子放在装有一些液氮的聚苯乙烯泡沫塑料容器内。盖子保持打开状态，让液氮蒸发。盖住容器以避免在 1.5 mL 管的顶部形成冷凝水。 4. 将 100 µL 新鲜制备的裂解缓冲液（参见食谱）加入装有组织粉的 1.5 mL 试管中，并将试管置于室温下的新架子中。 5. 40 – 50 秒后，关闭管盖，在室温下以最高设置涡旋 1 分钟。重复此步骤两次以实现完全同质性。 6. °C下以 21, 000 × g旋转管子5 分钟。 7. 将 125 µL 上清液转移到新的 1.5 mL 试管中，并在 4 °C下以 21,000 × g重复离心5 分钟。 8. 小心地将步骤 7 中的 100 µL 上清液分层到预制的 15 – 50% 蔗糖梯度上（参见 C 部分）。笔记： a. 在此阶段可以用标记对管进行编号。 b. 对于空白梯度，在预制的 15% – 50% 蔗糖梯度上层 100 µL 裂解缓冲液。 9. 使用镊子将梯度管放入TLS-55 转子桶中（在 4 °C下冷藏），并确保重量与其他管相匹配。 15% 的蔗糖溶液可用于此目的。注意：重要的是使用所有四个重量相等的转子吊桶。 10. 4 °C下以 50,000 rpm (213,626.2 × g )的转速旋转70 分钟（减速度 = 0，表示没有刹车）。 11. 使用钳子取出梯度管，并将管子放在 1.5 mL 管架中（图 3A）。用铝箔覆盖所有梯度并放在冰上。
E. 多糖体分析和梯度分离
注意：要开始 E 部分，梯度应在梯度分馏器中被夹紧，并用出口管密封在顶部组件上。（有关详细信息，请参阅制造商的手册。）一般的想法是梯度管在底部被刺穿，然后将重推溶液泵入梯度管的底部。这样，梯度通过顶部的出口管向上转移到吸光度记录仪中，最后流出进行分馏。每次梯度运行后，应用 50 mL 温水从一端虹吸清洗分馏器管。用抹布擦干入口和出口，并施加真空以去除分馏器管中的任何残留水。基线吸光度 (A 254nm ) 应归零。 1. 以最低速度（例如， ISCO Teledyne 梯度分馏器中的375 μL /min）通过分馏器管运行打孔溶液。继续泵送打孔溶液，直到它从穿刺针中出来。 2. 小心地将一小块石蜡膜（2 厘米宽）包裹在 2.2 mL 管的圆周上，只需用水将管子装入梯度分馏器的支架中。注意：Parafilm 的安装是为了更好地抓住带有梯度分馏器适配器的管子。 3. 旋转收集器活塞以刺穿梯度管并启动泵，如步骤 E1 中所述（图 3B）。 4. 当水开始从分馏器管中流出时，将吸光度 (A 254nm ) 调整为零，以便在 ISCO Teledyne 梯度分馏器中以 0.5 的灵敏度记录基线。 5. 水管运行完成后，取出管子（参见步骤 E6）并加载空白梯度管（参见步骤 D8b）以记录空白读数（图 3C）。 6. 每次梯度运行后，应用 50 mL 温水从一端虹吸清洗分馏器管。用抹布擦干入口和出口，并施加真空以去除分馏器管中的任何残留水。基线吸光度 (A 254nm ) 应归零。 7. 空白梯度记录完成后，取出管子并加载第一个样品梯度管（图 3A）。在单独的 1.5 mL 管中收集八个 200 μL 分数。每次收集分数后立即将管子放在冰上。
图 3 。微型梯度管设置和多核糖体概况。 A. 超速离心后带有样品（拟南芥细胞提取物）的梯度管。 B. 在 ISCO Teledyne 梯度分馏器中设置梯度管，管内有冲孔溶液。 C. 15% – 50% 微型蔗糖梯度示例。 40S、60S、单体 (80S) 和多聚体的位置显示在样品梯度曲线上。

笔记
– 200 µL 移液器从顶部仔细等分 200 µL 的成品梯度来收集单个分数。对于 polysome 配置文件，可以使用分光光度计对从这些分数中提取的 RNA 进行量化，并使用 x 轴作为分数 # 和 y 轴表示吸光度进行绘制。

致谢
Lokdarshi博士（通讯作者）在 Albrecht von Arnim 博士（诺克斯维尔田纳西大学生物化学与细胞与分子生物学系教授）实验室的博士后任期内开发的。这项工作得到了国家科学基金会 (IOS-1456988 和 MCB-1546402) 和美国国立卫生研究院 NIH R15 GM129672 对 Albrecht von Arnim 博士的资助。我们还感谢 Ricardo Urquidi Camacho（诺克斯维尔田纳西大学研究生研究助理）在优化此过程期间进行的有益讨论。本手稿中讨论的协议已成功用于多核糖体分析（ Lokdarshi et al., 2020b和 2020c) ，此外还用于梯度组分的 RNA 和蛋白质分析( Lokdarshi et al., 2020c ) 。请参阅“图 8：盐胁迫下野生型和 gcn2 突变体的核糖体 RNA 概况”。（ Lokdarshi 等人，2020b ）。请参见“图 6。EBP1 与胞质核糖体结合并支持核糖体生物发生。” （ Lokdarshi 等人，2020c ）。

利益争夺
作者声明没有竞争利益。

参考
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