材料和试剂

1. 40 μm 细胞过滤器（ Cor ning，目录号：431750）
2. 50 mL 管（Sangon Biotech，目录号：F602788）
3. 纤维素酶 R10（Yakult，目录号：L0012）
4. Macerozyme R10（Yakult，目录号：L0021）
5. D-甘露醇（Sigm a-Aldrich，目录号：M9647 ）
6. MES 水合物（Sigm a-Aldrich，目录号：M2933）
7. Tris 碱基（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP152-5）
8. 氯化钙（CaCl 2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：C5670）
9. 氯化镁（MgCl 2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
10. 氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
11. Percoll（GE Healthcare，目录号：17-0891-09）
12. HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
13. EGTA（Sigma-Aldrich，目录号：H3889）
14. 蔗糖（Sigma-VETEC，目录号：V900116）
15. 葡萄糖酸钾（Sigma-Aldrich，目录号：G4500）
16. D-山梨糖醇（ Sigma-Aldrich，目录号：S1876 ）
17. MnSO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：M7634）
18. HNO 3 （GHTECH，目录号： 1.14003.018）
19. H 2 O 2 （国药化学试剂，目录号： 10011208）
20. Murashige 和 Skoog（MS）含维生素的碱盐（Phytotech Labs，目录号：M519）
21. 琼脂（ Sigma-Aldrich，目录号：A1296 ）
22. KNO 3 ( Sinopharm Chemical Reagent，目录号： 10017218 )
23. Ca(NO 3 ) 2 ·4H 2 O ( Sigma-Aldrich ，目录号： SC278601 )
24. NH 4 H 2 PO 4 ( Sinopharm Chemical Reagent，目录号： 10002808 )
25. MgSO 4 ·7H 2 O（国药化学试剂，目录号： 10013018 )
26. H 3 BO 3 （国药化学试剂，目录号：10004808 ）
27. MnCl 2 ·4H 2 O （Sigma-Aldrich，目录号：SM500501）
28. (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 ·4H 2 O (国药化学试剂，货号： 10002318 )
29. ZnSO 4 ·7H 2 O（国药化学试剂，目录号： 10024018)
30. CuSO 4 ·5H 2 O（国药化学试剂，目录号： 10008218 )
31. EDTA-Fe(III)Na（Biotopped，目录号： Q0028-100g )
32. BSA（ Sigma-Aldrich，目录号：V900933 ）
33. β-巯基乙醇（14. 3 M）（Millipore，目录号：444203 ）
34. 1/2 MS 培养基（参见食谱）
35. 1/5 霍格兰溶液（见食谱）
36. 原生质体溶液（参见食谱）
37. 介质 B （见食谱）
38. 中等 I （见食谱）
39. 中二（见食谱）
40. 中 III （见食谱）
41. 中 IV （见食谱）
42. 中等 V （见食谱）
43. 中 VI （见食谱）
44. 中 VII （见食谱）
45. 中 VIII （见食谱）

设备

1. 人工光照培养箱（ PERCIVAL ，型号：LT-36VL）
2. 卧式离心机（Eppendorf，型号：Centrifuge 5810R）
3. 溶解器（LabTech，型号： DigiBlock ED54 ）
4. ICP-MS（ Thermo Fisher Scientific，型号： ICAP Qc ）

5. 全氟烷氧基烷烃 (PFA) 容器（LabTech，型号：GC-36-L）
6. Fuchs-Rosenthal 血球计数器（Marienfeld，型号：Dark-Line 0650010）

程序

A. 原生质体制备

1. 对大约 50 颗拟南芥种子进行消毒，种植在 1/2 MS 培养基上，然后在正常光照条件下（100 µmol m -2 s -1 ）在人工光照培养箱中以长日循环（16:8 小时光照/黑暗）生长) 在 22 °C。 7天后，用小海绵夹住幼苗，放在网纹浮板上；将根部浸入 1/5 Hoagland 溶液中，然后在正常光照条件下（100 µmol m -2 s -1 ）在人工光照培养箱中生长，并在 22 °C 下进行短日照（8:16 小时光照/黑暗） .每三天更换一次溶液。七周后，将幼苗转移到含有 240 μM MnSO 4的相同溶液中再放置 7 天。
2. 取 10-15 个幼苗根，用刀片将它们切成小块，将它们放入含有原生质体溶液的 100 mL 烧瓶中（参见食谱）。一般每15根幼苗根使用20mL原生质体溶液。
3. 在室温下轻轻摇动烧瓶 (75 rpm) 1 小时。较长的孵育时间可能会增加原生质体产量。
4. 用 40 μm 细胞过滤器过滤原生质体溶液，然后小心倒入 50 mL 管中。

B. 液泡提取

1. 为了减少原生质体的破坏，先在管底加入 5 mL 培养基 I，然后轻轻混匀过滤后的原生质体。离心后（200 × g , 10 min), 用移液器吸去上清液以获得沉淀的原生质体。
2. 将 5 mL 培养基 I 缓慢加入管中，并与沉淀的原生质体轻轻混合。
3. 使用移液器，将 5 mL 的介质 II 添加到管壁上，然后添加 5 mL 的介质 III。每层液体应缓慢添加，以确保各层不会分开。添加培养基 III 后，梯度形成，可以在管中清楚地看到。离心（800 × g ，10 分钟）后，在培养基 I 和 II 或培养基 II 和 III 之间的界面上获得纯化的无色原生质体。用移液器丢弃后者的原生质体（介于介质 II 和 III 之间），以避免液泡部分被原生质体污染。
4. 将大约 2 mL剩余的纯化原生质体与 2 mL 培养基 B 轻轻混合，并在冰上孵育 5 分钟。
5. 首先将原生质体、液泡和裂解物（来自步骤 B4）的混合物与 5 mL 培养基 IV 轻轻混合。然后，通过连续叠加介质 V、介质 VI、介质VII 和介质 VIII各 5 mL形成梯度。
6. 离心（800 × g ，10 分钟）后，用移液器弃去培养基 VIII。小心地吸取介质 VII 和介质 VIII 之间约 1 mL 的液体作为纯化液泡。

C. 元素分析

1. 使用 Fuchs-Rosenthal 血细胞计数器确定液泡的数量。（Fuchs-Rosenthal 血细胞计数器每平方毫米约有 10 个空泡，通过显微镜观察其高度为 0.1 毫米，因此，每立方毫米溶液中有 100 个空泡。）溶液中的总空泡数乘以溶液体积中每立方毫米的液泡数。
2. 消化了 PFA 容器中的液泡与 1.5 mL HNO 3 (65%) 和 0.6 mL H 2 O 2 (30%) 在 170 °C 的溶解器中放置 15 分钟。
3. 冷却至室温后，将消化液转移至塑料容量瓶中，并用超纯水 (18.25 MΩ cm -1 ) 稀释至 5 mL。
4. 使用电感耦合等离子体质谱仪 (ICP-MS) 确定消化溶液中的 Mn。

数据分析

每种植物材料的液泡元素浓度需要测量三个生物学重复。计算三个生物学重复的平均值并进行统计分析（学生t检验）。详细的数据和统计方法可以参考之前发表的文章（图5B in Zhang 等人， 2021 年和图4 B在Ju 等。 , 2022 ) 。

食谱

1. 1/2 MS 培养基（使用 Tris 将 pH 值调整至 5.7）
试剂终浓度数量
含维生素的 MS 碱盐 0.222% 2.22 克
蔗糖 1% 10克
琼脂
DDH 2 O
全部的 1%
不适用
不适用 10克
高达 1 升
1 公升

2. 1/5 霍格兰溶液
试剂终浓度数量
硝酸钾3 1 微米 0.51克
Ca(NO 3 ) 2 ·4H 2 O 1 微米 1.18 克
NH 4 H 2 PO 4
MgSO 4 ·7H 2 O
H 3 BO 3
MnCl 2 ·4H 2 O
(NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 ·4H 2 O
硫酸锌4 ·7H 2 O
CuSO 4 ·5H 2 O
EDTA-Fe(III)Na
DDH 2 O
全部的 0.2 微米
0.4 微米
3纳米
0.5纳米
1纳米
0.4纳米
0.2纳米
20纳米
不适用
不适用 0.12克
0.49克
1.85微克
0.99微克
12.36 微克
1.15微克
0.05微克
8.42微克
高达 1 升
1 公升

3. MES-Tris 缓冲液
试剂终浓度数量
MES水合物 0.5 万 9.76 克
Tris碱基调节 pH 值至 5.7
DDH 2 O 不适用高达 100 毫升
全部的不适用 100 毫升

4. 原生质体溶液
试剂终浓度数量
纤维素酶R10 1.25% 1.25 克
裂解酶R10 0.3% 0.3克
D-甘露醇 (0.8 M) 0.4 万 50 毫升
MES-Tris 缓冲液（0.5 M，pH 5.7） 20毫米 4毫升
氯化钾 (1M) 20毫米 2毫升
将溶液加热至 55 °C 10 分钟，然后冷却至室温
牛血清白蛋白 0.1% 0.1克
氯化钙2 (1 M) 10毫米 1毫升
β-巯基乙醇 (14. 3 M) 5毫米 35 微升
DDH 2 O 不适用高达 100 毫升
全部的不适用 100 毫升

5. 中 B
试剂终浓度数量
HEPES-Tris (1 M, pH 7.2) 30毫米 3毫升
葡萄糖酸钾 30毫米 0.7克
氯化镁2 (1 M) 2毫米 0.2毫升
EGTA (0.5 百万) 2毫米 0.4 毫升
DDH 2 O 不适用高达 100 毫升
全部的不适用 100 毫升

6. 中号
试剂终浓度数量
蔗糖 400毫米 13.69 克
珀科尔 50% 50 毫升
中 B 不适用高达 100 毫升
全部的不适用 100 毫升

7. 中二
试剂终浓度数量
蔗糖 400毫米 13.69 克
珀科尔 7.5% 7.5 毫升
中 B 不适用高达 100 毫升
全部的不适用 100 毫升

8. 中三
试剂终浓度数量
D-山梨糖醇 400毫米 7.27 克
中 B 不适用高达 100 毫升
全部的不适用 100 毫升

9. 中 IV
试剂终浓度数量
D-山梨糖醇 200毫米 3.64 克
珀科尔 25% 25 毫升
中 B 不适用高达 100 毫升
全部的不适用 100 毫升
10. 中V
试剂终浓度数量
蔗糖 200毫米 6.85 克
珀科尔 7.5% 7.5 毫升
中 B 不适用高达 100 毫升
全部的不适用 100 毫升

11. 中六
试剂终浓度数量
蔗糖 200毫米 6.85 克
珀科尔 5% 5毫升
中 B 不适用高达 100 毫升
全部的不适用 100 毫升

12. 中七
试剂终浓度数量
蔗糖 200毫米 6.85 克
珀科尔 2.5% 2.5 毫升
中 B 不适用高达 100 毫升
全部的不适用 100 毫升

13. 中八
试剂终浓度数量
蔗糖 200毫米 6.85 克
中 B 不适用高达 100 毫升
全部的不适用 100 毫升

致谢

本研究得到国家自然科学基金资助中国基金会（31770289转CW），西北农林科技大学 (Z111021604 to CW), 和国家自然科学基金中国（31900236 至 ZZ）。
关于植物材料制备的最初出版物发表于Eroglu 等人。 (2016);关于植物材料原生质体制备的最初出版物发表于 Bargmann 等人。 (2010);关于液泡提取的最初出版物发表在Shimaoka 等人上。 (2004)。

利益争夺

代表所有作者的非财务竞争利益。

参考

Bargmann, BO 和 Birnbaum, KD (2010)。植物原生质体的荧光激活细胞分选。 J 对实验(36)。
Eroglu, S.、Meier, B.、von Wirén, N. 和 Peiter, E.（2016 年）。液泡锰转运蛋白MTP8 决定了拟南芥对缺铁性萎黄病的耐受性。植物生理学170(2)：1030-1045。
Ju, C., Zhang, Z., Deng, J., Miao, C., Wang, Z., Wallrad, L., Javed, L., Fu, D., Zhang, T., Kudla, J., Gong, Z. 和 Wang, C. (2022)。 CBL2/3-CIPK3/9/26 和 CPK5 对液泡转运蛋白 MTP8 的Ca 2+依赖性连续磷酸化对于拟南芥中的锰稳态至关重要。 Mol Plant 15(3)：419-437。
Martinoia, E.、Schramm, MJ、Kaiser, G.、Kaiser, WM 和 Heber, U.（1986 年）。分离的大麦液泡中阴离子的运输：I. 阴离子的渗透性和 cl-摄取系统的证据。植物生理学80(4)：895-901。
Massonneau, A.、Martinoia, E.、Dietz, KJ 和 Mimura, T. (2000)。从长春花 (L.) G. Don的悬浮培养细胞中分离的完整液泡的液泡膜吸收磷酸盐。植物群211(3)：390-395。
Shimaoka, T.、Ohnishi, M.、Sazuka, T.、Mitsuhashi, N.、Hara-Nishimura, I.、Shimazaki, K.、Maeshima, M.、Yokota, A.、Tomizawa, K. 和 Mimura, T . (2004).拟南芥悬浮培养细胞中完整液泡的分离和液泡膜的蛋白质组学分析。植物细胞生理学45(6)：672-683。
Zhang, Z., Fu, D., Sun, Z., Ju, C., Miao, C., Wang, Z., Xie, D., Ma, L., Gong, Z. and Wang, C.（ 2021 年）。液泡膜相关的钙信号调节拟南芥中的锰稳态。 Mol Plant 14(5)：805-819。