材料和试剂

1.μ 盘细胞培养成像盘，35 毫米，高（Ibidi，目录号：81156）
2.1,000、200 和 20 µL 移液器吸头（预灭菌，带过滤器，铰链架）（ExpellPlus，目录号：5030150C、5030090C、5130062C）
3.15 mL 离心管（Corning，目录号：430791）
4.Corning® Costar® Stripette®血清移液器，单独纸/塑料包装，5 和 10 mL（Corning，目录号： CLS4487、4488 ）
5.Falcon® 100 mm TC 处理的细胞培养皿（Corning，目录号：353003 ）
6.RPMI 1640 媒体（Lonza，目录号：BE 12-115F）
7.胎牛血清（FBS）（Gibco TM ，目录号：10270106）
8.青霉素 - 链霉素混合物（Lonza，目录号：DE17-603E）
9.Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) (10 × )，95 mM (PO 4 )，不含钙或镁（Lonza，目录号：BE17-515Q）
10.牛血清白蛋白（BSA）-油酸单不饱和脂肪酸复合物（5 mM）（Cayman Chemical，目录号：29557）
11.BSA-脂肪酸复合物的 BSA 对照（5 mM）（Cayman Chemical，目录号：29556）
12.胰蛋白酶/EDTA 溶液（Lonza，目录号：CC-5012）
13.完整的 RPMI 生长培养基（参见食谱）
14.饥饿培养基（见食谱）

生物材料

1.细胞系：MH-S（ATCC 编号：CRL-2019 TM ）

设备

1.Rainin Pipet-Lite XLS（梅特勒托利多，型号：SL1000 和 SL200）
2.Forma 直接加热 CO 2培养箱 184 L 数字模型（Thermo Scientific，模型：311；TC 230）
3.生物安全柜（Telstar，型号：Bio II Advance Plus IV）
4.离心机 Sorvall ST 16R（Thermo Scientific，型号：75004380）
5.3D Cell Explorer 显微镜（Nanolive，Ecublens，瑞士）
6.CellDrop TM FL 自动细胞计数器 (DeNovix)
7.实验室水浴（Memmert，型号：WNB 14）

软件

1.Steve 软件 v1.6.3496（Nanolive，Ecublens，瑞士）
2.ImageJ (斐济) 软件 ( https://imagej.net/software/fiji/downloads )

程序

A.细胞培养

1.在 37 °C 的加湿培养箱中，在 5% CO 2的完全 RPMI 生长培养基（参见食谱）中，将MH-S 细胞在 100 mm 培养皿中培养至 90% 汇合度。
2.去除培养基并用 10 mL PBS 1 ×清洗细胞。
3.2加湿培养箱中37 °C孵育5 min，加入8 mL完全RPMI生长培养基终止反应。
注：将生长培养基和胰蛋白酶溶液调温至 37 °C在水浴中。
4.收集细胞并以 423 × g离心5 分钟。去除上清液并将颗粒重新悬浮在 5 mL 的完整 RPMI 生长培养基中。
5.使用自动细胞计数器计算细胞浓度。
6.在 35 mm μ 培养皿（每培养皿 3 × 10 5 个细胞）中的 1.5 mL 完全 RPMI 生长培养基中播种 MH-S 细胞。
注意：请记住为控制条件播种额外的菜肴（参见步骤 B3）。
7.在 37 °C 的加湿培养箱中用 5% CO 2孵育细胞过夜。
8.°C的水浴中调温饥饿介质（参见食谱）。
9.将细胞改为调温饥饿培养基，并在相同培养条件下孵育约 3 小时。

B.BSA-油酸酯处理

1.在水浴中解冻 BSA-油酸单不饱和脂肪酸复合物(5 mM)的等分试样2 分钟。
2.在饥饿介质中制备 100 μM 的 BSA 油酸工作溶液。
注意：对于 1.5 mL 培养基，您需要 60 µL BSA-油酸单不饱和脂肪酸复合物。
3.将饥饿介质更改为饥饿介质 + BSA 油酸盐（100 μM）或饥饿介质 + BSA 以进行控制。
4.在开始采集之前至少 30 分钟将 3D Cell Explorer 显微镜的阶段预热至 37°C。
5.在实验的其余部分，孵育条件（37 °C 和 5% CO 2 ）将保持不变。
注意：也可以使用其他全息显微镜。
C.图像采集

该协议是为配备 60倍放大干物镜（λ = 520 nm，样品曝光 0.2 mW/mm 2 ）和 30 μm 景深的 3D Cell Explorer 显微镜定制的。
1.使用控制显微镜的 Steve 软件，每分钟捕获一次图像，持续 18 小时。
2.在 z 轴上提供 30 μm的重建，对应于 100 个图像。 100 张图像堆栈中的大多数图像实际上都没有聚焦，因为样本仅在 z 轴的小范围内可视化（大约 5 – 10个堆栈）。从整个 z 堆栈中，在每个时间点选择最能观察到细胞焦点和分辨率的z 图像。 LD 被观察为具有高 RI 的细胞内球体。
3.使用 Steve 软件导出图像，将 RI 卷转换为 .tiff 格式。图片默认导出为 32 位图像。
4.出于性能目的，使用 FIJI 软件处理导出的图像（.tiff 格式）。将图像转换为 8 位，并使用 Fiji 软件对比较图像集进行相同的伽玛、亮度和对比度调整。
5.图 1 显示了肺泡巨噬细胞（MH-S 细胞）中 LD 的延时折射图像示例。

图 1. 肺泡巨噬细胞（MH-S 细胞）中脂滴 (LD) 的延时折射图像。图像显示与对照条件（蓝色）相比，用油酸（绿色）处理的 MH-S 细胞中的 LD 积累。右栏显示的特写图像对应于小方块中指示的位置。

食谱

1.完全 RPMI 培养基
RPMI 1640 培养基添加了 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素。

2.饥饿介质
RPMI 1640 培养基添加了 2% FBS 和 1% 青霉素-链霉素。

致谢

我们感谢 Instituto de Salud Carlos III 对 SH(PI20CIII/00018) 的财政支持。 A. Pérez-Montero得到了马德里自治区 (PEJ-2020-AI/BMD-17651) 的支持。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

Agudelo, CW、Samaha, G. 和 Garcia-Arcos, I.（2020 年）。肺部疾病中的肺泡脂质。回顾。健康与疾病中的脂质19(1)：122-122。
van Dierendonck, X., Vrieling, F., Smeehuijzen, L., Deng, L., Boogaard, JP, Croes, CA, Temmerman, L., Wetzels, S., Biessen, E., Kersten, S., et阿尔。 (2022)。脂滴中甘油三酯的分解调节巨噬细胞的炎症反应。 Proc Natl Acad Sci 美国119(12)：e2114739119。
Xu, S.、Zhang, X. 和 Liu, P. (2018)。脂滴蛋白与代谢性疾病。 Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis 1864（5，B 部分）：1968-1983。
Sandoz, PA、Tremblay, C.、van der Goot, FG 和 Frechin, M.（2019 年）。使用无标记 3D 折射率图对活的哺乳动物细胞进行基于图像的分析揭示了新的细胞器动力学和干质量通量。 PLoS 生物学17(12)：e3000553。