材料和试剂
1.1 mL注射器（BD Plastipak TM ，目录号：303084）
2.27G 和 26G 针（BD Plastipak TM ，目录号：305109 和303176 ）
3.无菌手术垫
4.10 cm 组织培养皿（Corning Incorporated，Falcon，目录号：353003）
5.11 mL（ Nunc TM目录号：347856）、15 和 50 mL 试管（ Miniplast ，目录号：835-015-40-111 和 835-050-21-111）
6.1.5 mL Eppendorf微管（Bar Naor Ltd.，目录号：BN022RL）
7.手术刀（Bar Naor Ltd.，目录号：BN400-21-JH）
8.Whatman注射器过滤器 0.2 µm（Bar Naor Ltd.，目录号：BNFCA206030H）
9.盖玻片（Bar Naor Ltd.，目录号： BN1 001-18-1CN）
10.Superfrost Plus 载玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：J1800AMNT）
11.移液器吸头 [ Axygen ，目录号：TF-200-RS (20–200 μ L ) ， TF-1000-RS (100–1,000 μ L )]
12.玻璃瓶（Bar Naor Ltd.，目录号：BN1228WH）
13.动物：5 – 7 周大的雌性C57BL/6小鼠（ Envigo ，以色列）
14.AT3 细胞系 (Sigma SCC178)
15.Dulbecco 改良鹰培养基 (DMEM)，500 mL （Biological Industries，目录号：01-050-1A）
16.正常人Accutase溶液，100 mL （Biological Industries，目录号：C-41310）
17.Dulbecco 的 PBS，500 mL （Biological Industries，目录号：02-020-1A）
18.热灭活胎牛血清（FBS），500 mL （Biological Industries，目录号：04-127-1A）
19.盐水溶液中的 L-谷氨酰胺，100 mL （Biological Industries，目录号：03-020-1B）
20.青霉素 - 链霉素溶液，100 mL （Biological Industries，目录号：03-031-1B）
21.MEM 非必需氨基酸溶液，100 mL （Biological Industries，目录号：01-340-1B）
22.梭杆菌属感兴趣的有核菌株（例如 ATCC 23726）
23.Wilkins- Chalgren肉汤（ Oxoid ，目录号：CM0643）
24.异硫氰酸荧光素(FITC)，1 g（Sigma-Aldrich，目录号：F7250-1G）
25.乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
26.台盼蓝溶液（Biological Industries，目录号：03-102-1B）
27.碳酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：497-19-8 ）
28.氢氧化钠（Sigma-Aldrich，目录号：1310-73-2）
29.异氟醚，USP Terrell TM （ Piramal ，目录号：VED1350）
30.双去离子水 (DDW)
31.冰
32.威尔金斯培养基（见食谱）
33.碳酸钠缓冲液（0.1 M，pH 9.0）（参见配方）
34.FITC 解决方案（参见食谱）

设备

1.移液器
2.离心机（Eppendorf 5810 R）
3.高压灭菌器 ( Tuttnauer 2540MK)
4.麻醉诱导室
5.血细胞计数器
6.分光光度计（600 nm 波长）
7.轨道摇床
8.尼康多光子A1MP
9.体视显微镜（Nikon SMZ2- ）
10.手术刀柄
11.剪刀
12.钳子
13.尾静脉注射平台
14.加热灯
15.厌氧室（ Bactron I–II Shellab ，美国）
16.卡尺
17.涡流

软件

1.NIS-Elements（尼康仪器公司） https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/software/nis-elements ）

程序

A.准备细胞

1.种子 5 × 10 5 AT3 细胞在 10 cm 组织培养皿中，在 10 mL DMEM 培养基中含有 10% 热灭活 FBS、1% L-谷氨酰胺、1% 青霉素-链霉素和 1% MEM 非必需氨基酸溶液.在 37 °C 的加湿培养箱中用 5% CO 2孵育细胞3-4 天。确保细胞在实验当天达到 80% – 100% 汇合。
2.植入前一天更换培养基（DMEM 辅以 10%热灭活胎牛血清、1% L-谷氨酰胺、 1%青霉素-链霉素和1% MEM 非必需氨基酸溶液）。
3.中分离肿瘤细胞，吸出培养基，用 5 mL的 PBS 清洗细胞，吸出 PBS，并加入 2 mL的Accutase溶液。在 37 ℃下用Accutase孵育细胞 5 – 8 分钟摄氏度。胰蛋白酶/EDTA 是accutase可接受的替代品。
4.添加 3 mL的 DMEM 以中和accutase并上下移液器，直到所有细胞都分离。将细胞悬浮液转移到 15 mL锥形离心管中，并加入 10 mL培养基（与步骤 A1 相同）。
5.在室温 (RT) 下以 1,000 rpm (200 × g )的转速将细胞离心5 分钟。吸出上清液，在细胞颗粒上方留下 500 μ L的培养基。并用重悬残留体积中的细胞并添加 10 mL的 PBS。倒置管子 2-3次以获得均匀的细胞悬液，并取 10 μ L在血细胞计数器中计数细胞。使用台盼蓝区分活细胞和死细胞。
6.x g离心细胞悬浮液5 分钟。吸出 PBS 并以 2 × 10 6 个细胞/ mL的终浓度将细胞重悬于PBS 中。确保单细胞悬浮液没有聚集细胞。将细胞转移到 Eppendorf 管中，并在使用前保持在冰上。

B.将 AT3 肿瘤细胞原位注射到乳腺脂肪垫中

1.异氟醚缓慢流速（3% - 5% 的氧气）的感应室中麻醉小鼠。
2.将鼠标放在无菌手术垫上，确保头部正确放置在异氟醚鼻锥内。通过捏爪子确认适当的麻醉。用 70% 乙醇对注射部位进行消毒。考虑在小鼠麻醉时应用眼部凝胶以防止视力下降。
3.使用带有 26G 针头的 1 mL 注射器将 50 μL PBS中的1 × 10 6 个AT3 细胞原位皮下注射到腹股沟乳腺脂肪垫中，方法是用镊子抬起乳头并将针头插入乳头下方并垂直于乳头。
4.监测小鼠直到它们恢复意识；确保他们在加入其他老鼠之前恢复完全意识。

C.细菌生长、染色和注射到小鼠

当肿瘤大小达到 500 毫米3外部卡尺测量执行细菌注射。
1.2和 5% H 2和37 °C的厌氧室中，在5 mL 无菌 Wilkins 培养基（参见食谱）中培养感兴趣的F. nucleatum菌株过夜 12 – 18小时.
2.以 2,057 × g离心 5 分钟并弃去上清液。用 1 mL 的 PBS重新悬浮颗粒，然后在相同条件下再次添加 4 mL 的 PBS 和离心机。
3.丢弃上清液并用 1 mL 新鲜的 FITC 溶液重悬沉淀（参见食谱）。确保单细胞悬浮液没有团块。
4.在黑暗中以轨道旋转在 RT 孵育 30 分钟。
5.添加 4 mL 的 PBS 并暂停。在 4 °C 下以 2,057 × g离心 5 分钟，然后重复洗涤直至上清液中的 PBS 澄清。
6.弃去上清液，用 1 mL PBS重悬细菌，使细菌的 OD 600为 1 （约 1 × 10 9 个细菌/mL）。将细菌保存在冰上和黑暗中直至使用。
7.将鼠标限制在尾静脉注射平台中。放置尾巴，使静脉朝上。
8.注射前，用头顶热灯加热尾巴几分钟以扩张静脉。
9.使用1 mL注射器和 27G 针头，将针头轻轻插入，同时斜面向上，朝向头部方向插入外侧或背尾静脉。保持针头和注射器与尾部平行。静脉注射5 × 10 7 5-异硫氰酸荧光素 ( FITC) 标记的F. nucleatum ATCC 23726。针头的内容物应该可以轻松无阻力地注射。为了确认正确的静脉注射，活塞应该很容易移动，静脉颜色应该瞬间变白。

D.小鼠处死和组织采集

1.细菌注射后二十四小时，将小鼠转移到氧气中含有 2%异氟醚的腔室中约 30 秒。
2.验证小鼠是否已完全麻醉并进行颈椎脱位。另一种选择是表演二氧化碳_ 安乐死后通过颈椎脱位确认。
3.用 70% 乙醇清洁肿瘤区域。在肿瘤附近的小鼠腹侧中间用一把消毒剪刀剪开皮肤。用无菌钳夹住肿瘤附近的皮肤，用无菌手术刀小心地切除肿瘤。
4.用无菌镊子将小鼠身体另一侧的皮肤靠近健康（对照）乳房组织，并使用无菌手术刀小心地取出组织。
5.将肿瘤和健康的乳腺组织放入装有 PBS 的玻璃瓶中，置于冰上。

E.FITC 标记的F. nucleatum的多光子显微术

1.使用手术刀从新鲜组织中切下一片，并使用尼康 SMZ25 拍照。代表性图像如图 1 所示。

图 1. 尼康 SMZ25 乳腺癌组织和邻近乳腺组织的图像。将 5 × 10 7 FITC 标记的具核梭杆菌ATCC 23726 或使用 PBS 载体静脉注射到 AT3 荷瘤小鼠体内24 小时后收获的肿瘤和正常邻近乳腺样本的代表性显微图像。

2.将组织放在带有一滴水的幻灯片上，并盖上盖玻片。
3.使用设置为 740 nm 波长的尼康多光子A1MP 显微镜使用 25× 物镜观察和拍摄免疫荧光图像。代表性图像如图 2 所示。

图 2.乳腺癌组织和邻近乳腺组织的尼康多光子A1MP 显微镜图像。使用 5 × 10 7 FITC 标记的具核梭杆菌ATCC 23726静脉注射 AT3 癌症小鼠后 24 小时采集的肿瘤和正常邻近乳腺样本的代表性多光子显微镜图像。图像取自Parhi 等人，2020 年。未进行任何更改。

数据分析

从荧光显微镜获得的图像通过 NIS-Elements 软件转换为 8 位图像（参见图 1 和 2）。

食谱

1.威尔金斯培养基
100毫升的 DDW
3.1 克 Wilkins- Chalgren肉汤
混合直至溶解
在 121 °C 下高压灭菌30 分钟，并将 5 mL 等分至 11 mL 管
在厌氧室中还原过夜

2.碳酸钠缓冲液（0.1 M，pH 9.0）
84毫克碳酸钠
10毫升的 DDW
用氢氧化钠调节 pH 值至 9.0
经0.2过滤除菌微米_ 沃特曼过滤器
3.异硫氰酸溶液
将 1 mg FITC 溶解在 10 mL 碳酸钠中涡旋缓冲
在黑暗中保存直到使用

致谢

作者感谢Zakhariya博士感谢Manevitch在显微镜方面的宝贵帮助。这项工作得到了以色列癌症研究基金项目赠款和以色列科学基金会Moked赠款的支持。该协议源自Parhi等人。（2020）。自然通讯。 https://doi.org/10.1038/s41467-020-16967-2

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

Eyal教授签署。

参考

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