材料和试剂
1. 50 mL 锥形聚丙烯离心管（Fisher Scientific，目录号：12-565-271）
2. 1.5 mL 微管（Fisher Scientific，目录号：05-408-129）
3. 带 Ultra-Fine TM针头的胰岛素注射器（ BD Biosciences，目录号： 08290-3284-38）
4. 人工泪液软膏（Rugby Laboratories，目录号：0536-6550-91）
5. 棉签，清教徒 6 英寸无菌（清教徒，目录号： 25-806 1WC）
6. 聚维酮碘棉签棒，单包 10% 强度（药品，目录号： MDS093901）
7. 酒精垫（PDI/Professional Disposables，目录号： B60307）
8. Nonidet P-40 替代品（Sigma-Aldrich，目录号：98379）
9. 毛细管（Drummond Scientific，目录号： 1-000-800）
10. POLYSYN 紫色编织涂层聚乙醇酸可吸收缝合线（目录号：G391NV，TruStitch）
11. 乳胶手套（VWR，目录号：56617-180），室温下保质期为 5 年
12. 超过两个月大的 SCID 小鼠 (NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl, Charles River)
13. 不含钙和镁的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（Gibco，目录号：10010-023），室温下保质期两年
14. 含有钙和镁的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（Gibco，目录号：14040-133），室温下保质期为两年
15. Matrigel（BD Biosciences，目录号：354234），-20 °C 下保质期两年
16. 盐酸氯胺酮 (10 mg/mL)（COVETRUS，目录号：071069），室温下保质期两年
17. Xylazine (1 mg/mL)（COVETRUS，目录号：061035），室温下保质期两年
18. 尼龙蓝色单丝缝合线（TruStitch，目录号：A662NV）
19. Ethiqa XR（Fidelis Pharmaceuticals LLC，目录号：86084-100-30），室温保质期一年
20. 多聚甲醛（JT Baker，目录号：S898-0），室温下保质期七年
21. 硝酸银（ Sigma-Aldrich，目录号：10220-100G），室温下保质期 >5 年
22. 4% PFA（见食谱）
23. 2% Nonidet P-40（见食谱）
24. 0.02% NP40、2% PFA（见配方）
25. 5% 硫代硫酸钠（见食谱）
26. 麻醉（见食谱）

设备

1. 离心机（Thermo Scientific，Sorvall ST 16R 离心机）
2. 培养箱（Thermo Forma，II 系列水套式 CO2培养箱）
3. 程序/解剖板（Aims Lab Products，GPM2）
4. 带双鹅颈管的光纤照明器（尼康）
5. 剪刀（虹膜剪刀，精细科学工具）
6. 镊子（Dumont #5SF、Ring 和 Graefe 镊子，Fine Science Tools）
7. 持针器：Halsted-Mosquito Hemostats（Fine Science Tools，目录号：91308-12）
8. 反射伤口夹（VWR，目录号：203-1000101326-476）
9. 订书机：反射伤口夹（VWR，目录号：203-1000101326-476）
10. 电灼术：Cautery Loop Tip 高温 2200 °F （ Bovie Medical Corporation）
11. 加热垫，可微波加热（K&H Pet Products，目录号：69553）
12. 电动剃须刀（OSTER，目录号：078996-101-001）
13. 尼康立体镜（NIKON，目录号：SMZ1500）
14. 点成像系统（Insight CMOS Digital Camera, SPOT）

程序

A. 用于移植的原代缝合细胞的制备（10 2至 10 5 个细胞）

1. 从小鼠或人体组织中分离缝合细胞后计数细胞数。
提示：缝合细胞分离的详细信息可以在已发布的协议中找到（Maruyama 等人，2022b）。
注意：将细胞置于冰上。
2. 在冰上融化冷冻基质胶。
注意：在冰上处理 Matrigel 以防止在注入注射器之前凝胶化。
3. 使用移液器将细胞悬浮液从 50 mL 锥形管转移到 1.5 mL 微量管中。
4. 通过离心将细胞旋转下来：在4 °C下 400 × g (400 rcf) 7 分钟。
5. 小心地从细胞沉淀中取出上清液。
提示：轻敲微量管使细胞沉淀与残留溶液混合。
6. 将细胞重新悬浮在 5 μL 的 Matrigel 中。
7. 将细胞嵌入基质胶 (CEM) 填充到胰岛素注射器中 (图 1)。

图 1. 将细胞包埋的 Matrigel 填充到胰岛素注射器中

8. 将充满细胞的注射器在 37°C 下孵育（至少）5 分钟。
提示：CEM 在 22–35 °C 的温度范围内发生凝胶化。

B. 制作火抛光玻璃毛细管

1. 在两侧握住玻璃毛细管，并使用燃气燃烧器在中心加热（图 2A）。
2. 在开始感觉到管子的柔软度后，立即将毛细管轻轻拉向两端，形成直径约为 0.2 毫米的尖端。
3. 火抛光拉动侧以平滑尖端（图 2B）。

图 2. 火抛光毛细管的制备。 (A) 拉毛细管。 (B) 火抛光拉动侧。

C. 手术野的设置

1. 使用 70% 乙醇清洁和消毒程序表。
2. 组装手术区域：舞台、灯光、电灼装置、持针器、加热垫和手术工具，例如剪刀、钳子和订书机（图 3）。
注意：手术器械经高压灭菌器灭菌。

图 3。准备操作字段。该图显示了手术区域的示例。

D. 麻醉和消毒

1. 称量受体 SCID 小鼠以确定麻醉剂的剂量：氯胺酮和甲苯噻嗪。
提示：氯胺酮：90 – 100 mg/kg（体重）和甲苯噻嗪：9 – 10 mg/kg（体重）。
2. 通过腹腔注射管理麻醉鸡尾酒。
3. 将动物转移到无菌的术前准备工作台上。
4. 在手术过程中涂抹润滑眼膏以防止眼睛干燥（图 4A）。
5. 使用电动剃须刀剃回毛皮，并用酒精垫擦拭该区域（图 4B）。
6. 用碘溶液轻轻擦拭对剃毛区域进行消毒（图 4C）。
7. 等待几分钟进行消毒（图 4D）。
8. 用酒精垫轻轻擦拭以去除碘（图 4E）。

图 4. 为外科手术准备动物。 (A) 涂抹眼药膏。 (B) 剃掉背部毛皮。 (C) 擦拭碘。 (D) 等待两分钟。 (E) 用酒精垫擦拭碘。

E. 移植

1. 用钳子提起皮肤，用剪刀在肋骨下方做一个小切口（约 1 厘米），偏离中心 0.5 厘米，但与脊柱平行（图 5A）。
2. 继续切穿腹膜（图 5B）。
3. 轻轻挤压切口下的腹部以暴露肾脏（图 5C）。
注意：通过应用 PBS（图 5D）使肾脏保持湿润状态。

图 5. 肾移植动物的准备。皮肤 (A) 和腹膜 (B) 的切口。 (C) 肾脏暴露。 (D) 将水分涂抹在肾脏上。

4. 用针头小心地划伤肾脏表面，在注射部位开一个小口。
5. 轻轻地将毛细管的火抛光尖端插入肾脏和外膜之间的空间，以腾出一些空间。
提示：想法是看到开口，使注射器能够轻松穿透肾囊。
提示：不要损伤肾脏；尤其要避免大量出血，否则会降低移植疗效。
6. 通过表面开口轻轻插入含有CEM 的胰岛素注射器（图 6A）。
区域）正下方的方向移动，但不要进入肾脏（图 6A'）。
7. 在肾囊下方注入 CEM（图 6B）。
提示：CEM 在肾囊中可见且稳定（图 6B'）。
8. 使用电烙术关闭小开口（图 6C）。

图 6. 将细胞包埋的 Matrigel 植入肾囊。 (A, A') 将注射器插入肾囊区域。 (B, B') 注射细胞包埋基质胶。 (C) 关闭小开口。

9. 轻轻地将肾脏移回腹腔。
10. 使用可吸收的聚苯乙烯缝合线关闭腹膜（图 7A）。
11. 使用丝绸或尼龙缝合线关闭皮肤（图 7B）。
提示：或者，使用订书机夹住缝合区域（图 7C）。
12. 皮下给予止痛药（如 Ethiqa）以减轻疼痛。
13. 将动物转移到干净的加热垫上以从麻醉中恢复。
14. 连续监测动物以观察任何呼吸困难的迹象。
15. 一旦动物开始表现出有反应的迹象，将动物转移到干净的笼子里，让其自由获取食物和水。
提示：无需在手术后给予镇痛药，因为 Ethiqa 的有效性长达 72 小时。
16. 手术后至少连续四天每天监测小鼠。
17. 术后 2-4 周检索和分析移植的肾脏。

图 7. 术后手术程序。关闭腹膜 (A) 和皮肤 (B) 并钉合缝合区域 (C)。

F. 整体 von Kossa 染色

1. 在 CO 2室中对动物实施安乐死。
2. 解剖移植的肾脏和对侧肾脏（作为实验对照）并将它们浸泡在冰上的 PBS 中。
3. 使用 SPOT 图像系统（图 8A）拍摄尼康立体镜下的移植和控制。
4. 在室温下用 PBS 中的 0.02% NP40/2% PFA 为移植和控制添加前缀 3 小时。
5. 室温下用蒸馏水洗涤 3 次，每次 10 分钟。
提示：洗涤过程对于减少背景染色至关重要。
6. 在室温下将样品放入 1% 的硝酸银水溶液中。
7. 在室温下将移植物和控制暴露在紫外线下 20-60分钟。
提示：每 10 分钟监测一次组织，直到出现矿物质沉积并变成棕色，以终止该过程。
8. 室温下用蒸馏水洗涤 3 次，每次 10 分钟。
9. 在室温下将染色的肾脏放入 5% 的硫代硫酸钠中 5 分钟。
10. 在室温下用蒸馏水洗涤 10 分钟。
11. 使用 SPOT 成像系统（图 8B）评估和拍摄尼康立体镜下的染色移植和控制。
12. 样品可以后固定和脱钙，用于组织学和免疫学评估。

图 8. 用 von Kossa 染色法对移植肾进行分析。移植（右）和未移植（左）肾脏在 von Kossa 染色之前 (A) 和之后 (B)。箭头表示肾囊处异位骨的形成。 A 和 B 中插图的放大显示在 a 和 b 中。比例尺，5 毫米（A、B）； 1 毫米（a，b）。

数据分析

干细胞频率

肾囊移植后骨形成的评价
• 使用带 SPOT 成像系统的尼康立体镜，通过对移植肾囊的全安装 von Kossa 染色评估骨形成（图 4、5、6、7、8，Maruyama 的补充图 S9、S10 等人， 2021）。
• 以表格格式输入数据，包括剂量（细胞数）、测试（移植数）和反应（阳性移植数）到网页上的 ELDA 软件（ http://bioinf.wehi.edu.au/software /埃尔达/ ）。
• 输入置信区间（默认为 95%）并在必要时选中其他复选框。
• 单击运行以确定干细胞频率，基于移植骨的成功生成。
• “估计”表示对照组和实验组中的干细胞频率。
• 验证单次命中模型的似然比检验，以获得用于确定统计显着性的 p 值（Maruyama 的图 4 等。 , 2021) 。

食谱

1. 4% 粉煤灰
1 L PBS 中含有 40 g 多聚甲醛

2. 2% NP 40
2 克 Nonidet P 40 溶于 100 毫升蒸馏水中

3. 0.02% NP40, 2% 粉煤灰
20 mL 的 4% PFA
400 µL 2% NP 40
19.6 毫升的 PBS

4. 5%硫代硫酸钠
5 g 硫代硫酸钠溶于 100 mL 蒸馏水中

5. 麻醉
8.5 mL DPBS（Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水，不含钙和镁）
1 毫升氯胺酮 (10 毫克/毫升)
0.5 毫升甲苯噻嗪 (1 毫克/毫升)

致谢

作者感谢前任和现任实验室成员提供的技术和智力支持。这项工作得到了美国国立卫生研究院 (DE15654、DE269369) 和 NYSTEM (C029558) 对 WH 的支持。该协议源自《科学转化医学》上发表的原始研究论文（丸山等。 , 2021)和科学进展（丸山等人，2022a) 。

利益争夺

作者声明没有相互竞争的经济利益。

伦理

本作品中描述的实验动物的护理和使用符合福赛思研究所 IACUC 和罗切斯特大学动物资源大学委员会的指导方针和政策。

参考

Caplan, AI 和 Correa, D. (2011)。 MSC：伤害药店。细胞干细胞9(1)：11-15。
Maruyama, T.、Hasegawa, D.、Valenta, T.、Haigh, J.、Bouchard, M.、Basler, K. 和 Hsu, W. (2022a)。 GATA3 介导骨骼细胞命运决定和异位软骨形成中的非经典 β-连环蛋白信号传导。科学进阶8(48)：eadd6172。
Maruyama, T.、Jeong, J.、Sheu, TJ 和 Hsu, W.（2016 年）。颅面骨发育、修复和再生中缝合间充质的干细胞。自然社区7：10526。
Maruyama, T.、Stevens, R.、Boka, A.、DiRienzo, L.、Chang, C.、Yu, HI、Nishimori, K.、Morrison, C. 和 Hsu, W.（2021 年）。 BMPR1A 在颅面发育和颅缝早闭中维持骨骼干细胞特性。科学翻译医学13 (583)。
Maruyama, T.、Yu, HI 和 Hsu, W. (2022b)。从颅缝间充质中分离骨骼干细胞和培养干性的维持。生物协议12(5)：e4339。
Robey, PG、Kuznetsov, SA、Riminucci, M. 和 Bianco, P.（2014 年）。骨髓基质细胞测定：体外和体内。方法 Mol Biol 1130：279-293。
Sacchetti, B., Funari, A., Michienzi, S., Di Cesare, S., Piersanti, S., Saggio, I., Tagliafico, E., Ferrari, S., Robey, PG, Riminucci, M.,等。 (2007)。骨髓血窦中自我更新的骨祖细胞可以组织造血微环境。单元格131(2)：324-336。
Scott, MA、Levi, B.、Askarinam, A.、Nguyen, A.、Rackohn, T.、Ting, K.、Soo, C. 和 James, AW (2012)。异位骨形成模型的简要回顾。干细胞开发21(5)：655-667。
Takaoka, K.、Nakahara, H.、Yoshikawa, H.、Masuhara, K.、Tsuda, T. 和 Ono, K. (1988)。多孔羟基磷灰石与胶原蛋白和骨形态发生蛋白结合的异位骨诱导。临床骨科相关研究(234)：250-254。
Yang, Z.、Yuan, H.、Tong, W.、Zou, P.、Chen, W. 和 Zhang, X. (1996)。骨骼外植入的多孔磷酸钙陶瓷的成骨作用：不同动物之间的差异。生物材料17(22)：2131-2137。
Yu, PB, Deng, DY, Lai, CS, Hong, CC, Cuny, GD, Bouxsein, ML, Hong, DW, McManus, PM, Katagiri, T., Sachidanandan, C., 等。 (2008)。 BMP I 型受体抑制可减少异位 [校正] 骨化。 Nat Med 14(12)：1363-1369。
Zeitouni, S.、Krause, U.、Clough, BH、Halderman, H.、Falster, A.、Blalock, DT、Chaput, CD、Sampson, HW 和 Gregory, CA (2012)。用于增强骨再生的人间充质干细胞衍生基质。 Sci Transl Med 4(132): 132ra155。