材料和试剂
1. 1.5 mL 管（WATSON，目录号：8064131815C）
2. 0.22 μm过滤器（AS ONE，目录号： 033022SO-SFCA）
3. 6 cm 细胞培养皿（Thermo Scientific，目录号：150462）
4. 细胞刮刀（VIOLAMO，目录号：1-2249-01）
5. 白色 384 孔免疫板（Thermo Scientific，目录号：460372）
6. 293T 细胞（ ATCC：CRL-3216）
7. 质粒 pCAG-NS4B-FLAG-HiBiT，编码 HiBiT 标记的 JEV NS4B 蛋白（Arakawa 等人，2022）
8. 质粒 pCAG-OSF-VCP，编码一个链球菌标记的 VCP 蛋白或为空（Arakawa 等人，2022）
9. siRNA-荧光素酶，其靶向萤火虫荧光素酶（有义序列：3 ' - CGUACGCGGAAUACUUCGAtt-5 ' ）
10. siRNA-NPL4，其靶向 NPL4（有义序列：3 ' - CUGAAGUGGUCGAUGAAAUtt-5'）
11. Nano Glo HiBiT 裂解检测系统（Promega，目录号：N3040）
12. Dulbecco 改良的 Eagle 培养基（Nacalai Tesque Inc.，目录号：08458-16）
13. 胎牛血清（FBS）（Thermo Scientific，目录号：10270-106 ）
14. 不含钙和镁的磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Nacalai Tesque Inc.，目录号：14249-24）
15. 苄青霉素钾（富士胶片 Wako Pure Chemical Corporation，目录号：021-07732）
16. 硫酸链霉素（东京化成工业，目录号：S0585）
17. Strep-Tactin Sepharose 50% 悬浮液（IBA Lifesciences GmbH，目录号：2-121-010）
18. 链球菌标签洗脱（10×缓冲液 E）（IBA Lifesciences GmbH，目录号：2-1000-025）
19. 完整的、不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物（Roche，目录号：11873580001）
20. Lipofectamine TM 3000 转染试剂（Thermo Scientific，目录号：L3000015）
21. Lipofectamine TM RNAiMAX 转染试剂（Thermo Scientific，目录号：13778150）
22. Opti-MEM（Thermo Scientific，目录号：31985062）
23. Tris（三[羟甲基]氨基甲烷）（Nacalai Tesque Inc.，目录号：35406-91）
24. NaCl（Nacalai Tesque Inc.，目录号：31320-05）
25. Triton X-100（Nacalai Tesque Inc.，目录号：35501-15）
26. 100× 青霉素 G + 链霉素原液（见配方）
27. 培养基（见食谱）
28. 下拉洗涤缓冲液（见食谱）
29. 100× 浓缩完整原液（见配方）
30. 裂解缓冲液（见配方）
31. H iBiT 试剂（见配方）
32. 1× Strep-tag 洗脱缓冲液（参见配方）

设备

1. 加湿培养箱（37 °C，5% CO 2 ）
2. 微孔板光度计（Thermo Scientific，Varioskan LUX Multimode Microplate Reader）
3. 涡旋混合器（Scientific Industries，型号： Vortex-Genie 2）
4. 微管离心机（ Thermo Scientific，型号：Sorvall TM Legend TM Micro 21R ）
5. 旋转器（BIO CRAFT，型号：BC-710I）

程序

1. 添加 60 pmol siRNA-NPL4（或 siRNA-荧光素酶用于阴性对照）至 250 µL Opti-MEM。使用涡旋混合器混合均匀（图 1）。
注意：第 1-8 步专门针对 siRNA 转染方案，而第 9 步标志着下拉方案的开始。要进行 siRNA 转染，请遵循 Lipofectamine TM RNAiMAX 转染试剂的“反向转染方案” 。

图 1. 蛋白质下拉 HiBiT 检测概述。 A.蛋白质下拉 HiBiT 测定的示意图。 B.蛋白质下拉 HiBiT 测定的流程图。

2. 将 6 µL Lipofectamine TM RNAiMAX 转染试剂添加到 250 µL Opti-MEM 中。使用涡旋混合器混合均匀。
3. 将步骤 1 中的混合物添加到步骤 2 中，并使用涡旋混合器充分混合。
4. 在室温下将混合物孵育 5 分钟。
5. 在 6 厘米的培养皿中以 750,000 个细胞/孔的密度在 4.5 mL 培养基中播种 293T 细胞。
6. 将大约 500 μL 的 siRNA-Lipofectamine 混合物轻轻添加到含有细胞的培养皿中。
7. 将培养皿放入 CO 2培养箱中培养 24 小时。
8. 转染后 24 小时补充培养基。
注意：将培养基缓慢添加到孔的一侧以避免细胞脱离。
9. 添加 1.5 µg pCAG-NS4B-FLAG-HiBiT、1.5 µg pCAG-OSF-VCP 和 120 pmol siRNA-NPL4（或 siRNA-荧光素酶用于阴性对照）至 250 µL Opti-MEM。对于 siRNA 转染，使用相同的 siRNA 重复初始转染。使用涡旋混合器混合均匀。
（可选）使用空向量 (pCAG-OSF) 代替 pCAG-OSF-VCP 设置控制实验。
10. 将 6 µL Lipofectamine TM 3000 转染试剂添加到 250 µL Opti-MEM 中。使用涡旋混合器混合均匀。
11. 将步骤 9 中的混合物添加到步骤 10 中，并使用涡旋混合器充分混合。
12. 将混合物在室温下孵育 10 分钟。
13. 将步骤 12 中的混合物应用于含有细胞的培养皿（~500 μL）。
14. 将培养皿放入 CO 2培养箱中培养 48 小时。
15. 吸出培养基并在每道菜中加入 1 mL 的冰冷 PBS。使用细胞刮刀收集细胞并将它们转移到 1.5 mL 管中。
16. × g离心 1.5 mL 管在 4 °C 下放置 10 分钟。
17. 吸 PBS。将 1 mL 的冰冷 PBS 添加到每个管中，并通过移液器暂停。
18. x g离心 1.5 mL 管10 分钟。
19. 吸 PBS。在每个管中加入 500 μL 的冰冷裂解缓冲液，并通过移液混合。
20. x g离心 1.5 mL 管10 分钟。
21. 将 5 μL 的上清液转移到 1.5 mL 管中进行输入，并添加 45 μL 的裂解缓冲液。使用涡旋混合器混合均匀。
22. 在 384 孔板的每个孔中转移 10 μL 稀释裂解液。
注意：为确保准确测量，建议每个样品使用三个以上的孔。如果获得的值超出读数范围，则应进行系列稀释。
23. 在每个孔中加入 10 μL 的 HiBiT 试剂。
24. 在室温下孵育 10 分钟。
25. 使用微孔板读取器测量 1，000 毫秒测量时间/孔的发光。
26. 将 480 μL 的透明裂解液转移到新鲜的 1.5 mL 管中。
27. 在裂解物中加入 15 μL 的 Strep-Tactin Sepharose 50% 悬浮液，并在 4°C 下旋转 1 小时。
28. x g离心 1.5 mL 管1 分钟。
29. 吸出上清液。在每个管中加入 1 mL 的冷下拉洗涤缓冲液，并通过倒置混合。
30. 重复步骤 28 和 29 三次。
31. x g离心 1.5 mL 管1 分钟。
32. 吸出上清液。添加 450 µL 的 1× Strep-tag 洗脱并在 4°C 下旋转 1 小时。
33. x g离心 1.5 mL 管1 分钟。
34. 将 400 μL 的洗脱缓冲液转移到新鲜的 1.5 mL 管中。
35. 在 384 孔板的每个孔中转移 10 μL 的洗脱液。
注意：为确保准确测量，建议每个样品使用三个以上的孔。如果获得的值超出读数范围，则应进行系列稀释。
36. 在每个孔中加入 10 μL 来自Nano Glo HiBiT 裂解检测系统的 HiBiT 试剂。
37. 在室温下孵育 10 分钟。
38. 使用微孔板读取器测量 1,000 毫秒测量时间/孔的发光（图 2）。

图 2. Strep-Tactin 纯化部分和输入部分的 HiBiT 活性。 A. Strep-Tactin 纯化部分的 HiBiT 活性。乙。输入分数的 HiBiT 活动。 C. _ Strep-Tactin 纯化部分的补偿 HiBiT 值。 Strep-Tactin 纯化部分的 HiBiT 活性是通过将其值除以输入部分的值来计算的。使用学生t检验比较两组之间的平均值。在 **P < 0.01 时，差异被认为是显着的。

笔记

1. 在 NanoLuc/HiBiT 系统中，可以获得强烈的发光发射，并导致多孔板中相邻孔的泄漏。因此，我们建议每隔一口井加载样品。
2. 本研究中使用的材料可以在合理要求下从相应的作者 Eiji Morita 处获得。

食谱

1. 1 00×青霉素G+链霉素原液
缓冲液 100 毫升
苄基青霉素钾 0.626 g
硫酸链霉素 1克
使用 0.22 μm过滤器进行消毒并储存在冰箱中。

2. 培养基
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 500 mL
FBS，通过在 56 °C 下孵育 45 分钟 50 mL 进行热灭活
100×青霉素G+链霉素储备液 5 mL

3. 下拉洗涤缓冲液
1 M Tris pH 7.5 20 mL
5 M 氯化钠 30 毫升
Triton X-100 1.07 克
ddH 2 O 高达 1 L

4. 100 倍浓缩完全储备液
完整的、不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物 1 片
ddH 2 O 500 µL
-20℃保存

5. 裂解缓冲液
1 M Tris pH 7.5 20 毫升
5 M 氯化钠 30 毫升
Triton X-100 10.7 克
ddH 2 O 高达 1 L
加 100 × 使用前浓缩完整的储备溶液。

6. Nano Glo HiBiT 裂解检测系统的 HiBiT 试剂
Nano-Glo HiBiT 裂解缓冲液 500 µl
Nano-Glo HiBiT 裂解底物 10 µl
LgBiT 蛋白 5 微升

7. 1× 链球菌标签洗脱缓冲液
链球菌标签洗脱（10 ×缓冲液 E）2 mL
ddH 2 O 18 毫升

致谢

这项工作得到了 JSPS KAKENHI（授权号 22H00553、22H02873、22K18378、20H05305、20K21874）、日本 JST CREST（授权号 JPMJCR17H4 ）的支持。 HiBiT 检测协议改编自以前的工作 (Goto et al., 2020)。该协议源自原始研究论文（ Arakawa 等人，2022 年；DOI：10.1016/j.jbc.2022.101597 ）。

利益争夺

作者没有与本文内容直接相关的竞争利益。

参考

Arakawa, M. 和 Morita, E.（2019 年）。内质网中的黄病毒复制细胞器生物发生：与其他单链正义 RNA 病毒的比较。国际分子科学杂志20(9)。
Arakawa, M.、Tabata, K.、Ishida, K.、Kobayashi, M.、Arai, A.、Ishikawa, T.、Suzuki, R.、Takeuchi, H.、Tripathi, LP、Mizuguchi, K. 等阿尔。 (2022)。 Flavivirus 募集含有 valosin 的蛋白质-NPL4 复合物以诱导应激颗粒分解，从而实现高效的病毒基因组复制。生物化学杂志298(3)：101597。
Dixon, AS, Schwinn, MK, Hall, MP, Zimmerman, K., Otto, P., Lubben, TH, Butler, BL, Binkowski, BF, Machleidt, T., Kirkland, TA, 等人。 (2016)。 NanoLuc Complementation Reporter 经过优化，可准确测量细胞中的蛋白质相互作用。美国化学会化学生物学11(2)：400-408。
Tabata, K.、Arakawa, M.、Ishida, K.、Kobayashi, M.、Nara, A.、Sugimoto, T.、Okada, T.、Mori, K. 和 Morita, E.（2021 年）。内质网相关的降解控制病毒蛋白稳态，这是黄病毒繁殖所必需的。 J Virol 95（15）：e0223420。
Goto, S.、Ishida, K.、Suzuki, R. 和 Morita, E.（2020 年）。基于分裂纳米荧光素酶的测定法测量日本脑炎病毒的组装。生物协议10(9)：e3606。