材料和试剂
1. 50 mL 锥形离心管（PROMETHE，目录号：PCT010500，无菌） 2. 15 mL 锥形离心管（PROMETHE，目录号：PCT010150，无菌） 3. 2 mL 离心管（上海晶鑫，目录号：JX-LG0100，非无菌） 4. 2.0 mL 琥珀色螺旋瓶（Thermo Fisher，目录号：C5000-2W） 5. 150 μL衬管（Thermo Fisher，目录号：C4012-530） 6. 两周大的拟南芥幼苗（突变种子可通过向相应作者发送电子邮件请求获得，野生型种子可从 TAIR 网站https://www.arabidopsis.org获得） 7. 生长在土壤中的4 周大的拟南芥植物 8. Murashige & Skoog基础培养基（ PhytoTech ，目录号：M519） 9. KCl （国药集团化学试剂有限公司，CAS：7447-40-7） 10. CaCl 2 ( Solarbio , CAS: 10043-52-4) 11. NaCl （国药集团化学试剂有限公司，CAS： 7647-14-5) 12. HCl （国药集团化学试剂有限公司，CAS： 7647-01-0 ） 13. MES（BBI，CAS： 145224-94-8) 14. NH 4 OAC（国药集团化学试剂有限公司，CAS： 631-61-8) 15. 百草枯（阿拉丁，CAS：1910-42-5） 16. 水（LC-MS 级）（Merck， Milli -Q IQ7000） 17. 甲醇（ LC-MS 级）（默克公司，CAS：67-56-1 ） 18. 乙腈（ LC-MS 级）（ Sigma-Aldrich，CAS： 75-05-8) 19. 甲酸（ LC-MS 级）（ Sigma-Aldrich，CAS： 64-18-6) 20. 液氮 21. W5 缓冲区（参见食谱） 22. 百草枯处理缓冲液（见配方） 23. 洗涤缓冲液（见配方） 24. 百草枯提取液（见配方） 25. 再溶解溶液（见配方） 26. LC 流动相（见配方）

设备
1. 自动样品快速研磨机（上海精鑫，型号：JXFSTPRP-CL) 2. 超声波清洗机（ Sumpile , 模型： KQ-200VDE) 3. 氮吹浓缩器（北京嘉源工业技术有限公司，模型： MD200-2) 4. 高速冷冻离心机（久保田、型号：6500） 5. 台式高速离心机（海蒂诗，型号：MIKRO 220R） 6. 光学显微镜（徕卡，型号：立体显微镜 S8 APO） 7. -80 ℃冷藏 8. 水浴锅（和德实验室，型号：DK-420BS） 9. 血细胞计数器 10. UHPLC 系统（Shimadzu Nexera UHPLC LC30A 系统，包括样品管理器、溶剂管理器和柱温箱） 11. 质谱仪系统（配备电喷雾电离的 SCIEX QTRAP 6500 plus 质谱仪） 12. UHPLC 色谱柱（ACQUITY UPLC BEH HILIC 色谱柱，130Å，1.7 µm 粒径，2.1 毫米× 100 毫米，沃特世）

程序
A. 百草枯处理拟南芥幼苗
1. 拟南芥种子进行表面消毒，然后在标准长日光生长条件下（16:8 小时光/暗循环）在垂直 1/2 Murashige & Skoog方形板（1% 琼脂）上生长 10 天（ Weigel和Glazebrook ，2002 年）。 2. 水平放置盘子，然后将它们放在黑暗中两天，让下胚轴快速向上生长。之后，再次将盘子放回长日光条件下再生长两天（图 1）。
图 1 幼苗生长及处理过程简图注意：在每个板上，突变体和 Col-0野生型对照并排生长。图 1 所示的生长过程将有助于随后的百草枯处理和根部收获。根主要生长在介质表面，易于处理和收获，而叶子不接触介质表面。
3. 使用移液器加入10 mL 的10 μM 将百草枯慢慢倒入平板中，让百草枯均匀分布在培养基表面。将板在黑暗中水平放置 6 小时。注意：使用相同数量的百草枯处理每块板。百草枯的体积应足以淹没介质表面，但又不足以接触到叶子。 4. 分别收获根和叶。用蒸馏水快速冲洗材料 3 次，用纸巾吸干，然后称重。对于突变体和对照，最好使用类似重量的材料进行进一步的实验。 5. 将材料冷冻在液氮中，并储存在-80°C，用于百草枯测定。
B. 百草枯处理拟南芥原生质体
1. 根据先前描述的方法（ Yoo 等人，2007 年），从在短日光条件（8:16 小时光/暗循环）下生长四个星期的拟南芥叶子制备原生质体。将原生质体悬浮在冷 W5 缓冲液中。 2. 使用血细胞计数器对原生质体进行计数。去除 W5 缓冲液并用百草枯处理溶液将原生质体的最终浓度调整为 2 × 10 6 个原生质体/mL 。至少使用 10 mL 原生质体进行一次测定。 3. 在室温下将原生质体在黑暗中孵育 3 小时。每 20 分钟用手轻轻摇动一次原生质体。注意：此步骤是将百草枯加载到原生质体中。 4. °C下以 100 × g离心2 分钟并小心去除上清液。 5. 在管中加入 10 mL 的洗涤缓冲液，并轻轻地重新悬浮原生质体。 6. 再重复步骤 B4 –B 5两次。注：以上步骤可用于百草枯摄取测定。对百草枯流出测定执行以下步骤。 7. 最后一次洗涤后，再次将原生质体悬浮在洗涤缓冲液中，并将它们等分到几个试管中。每个管对应一个时间点。为每个时间点设置至少三个重复。对于此测定，我们使用 0、10、30 和 60 分钟时间点。在室温下将管子置于黑暗中，并使用计时器开始计时。 8. 在每个时间点，按照步骤 B4 离心管。分别收集上清液和原生质体。 9. 将样品冷冻在液氮中，然后将其储存在-80 °C以进行百草枯测定。
C. 百草枯提取_
1. 使用 1 × 10 6 – 2 × 10 6原生质体或 20–30 mg 植物组织测定2 mL 离心管中的百草枯含量。进行三个冻融循环（将原生质体在液氮中冷冻 1 分钟，然后在室温水浴中解冻 2 分钟）以破坏原生质体。对于植物组织，将材料在液氮中研磨成粉末。 2. 加入 800 μL 的百草枯提取液。 3. 在冰上总共对每个样品进行 20 分钟（开 1 分钟，关 1 分钟）的超声处理。 4. °C的水浴中30 分钟，然后冷却至室温。 5. 以 13,500 × g离心 10 分钟并收集上清液。 6. 重复步骤 C2 –C 5 并将上清液合并在一起。 7. 用氮吹浓缩器蒸发有机溶剂，并将干燥的样品储存在-80 °C直至测定。
D. 百草枯的测定
1. 从-80 °C 取样品，将室温再溶解溶液的 100 μL添加到 2 mL 离心管中以溶解样品。 2. 轻弹试管数次，直至样品完全溶解。在 4 °C下以 14,000 × g离心10 分钟。将 80 μL的上清液移入带有 150 μL衬管的 2 mL 琥珀色螺旋瓶中。 3. μm粒径，2.1 mm × 10 0 mm）将 1 μL样品注入系统。 4. 使用由溶剂 A 和溶剂 B 组成的 LC 流动相执行线性梯度洗脱程序。将流动相的流速设置为 0.4 mL/min 以进行线性梯度洗脱程序（7 分钟）：90% B 保持 1 分钟, 90% B 在 1 分钟内减少到 20% B，20% B 保持 2.3 分钟，20% B 在 0.2 分钟内增加到 90% B，90% B 保持 2.5 分钟。（程序为 0 分钟，90% B；1 分钟，90% B；2 分钟，20% B；4.3 分钟，20% B；4.5 分钟，90% B；7 分钟，90% B。） 5. 在 LC-MS/MS 系统上使用多反应监测模式以正模式 (ESI+) 检测样品。将离子源中的气体参数，包括离子源气体 1、离子源气体 2 和窗帘气体分别设置为 55、55 和 35 psi。将温度设置为 500 °C ，将离子喷雾电压设置为 5，500 V。监测每种分析物的两个多反应转换，以对百草枯进行定量和确认（186.0 – 171.0 用于定量，93.2 – 171.3 用于确认）。去簇电压和碰撞能量是化合物特定的参数。对于百草枯，它们分别为 100、60、25 和 17。将其他参数设置为制造商推荐的默认值。 6. 分析物的色谱峰进行积分。最小峰宽和峰高的积分参数设置为 9 点和 1,000 点，S/N 积分阈值和基线减法窗口分别设置为 3 分钟和 2 分钟。

数据分析
1. 通过 UHPLC-MS/MS 直接计算百草枯的色谱峰面积。百草枯的峰面积代表色谱柱上分析物的量。由于进样体积为 1 µL，样品总体积为 100 µL，因此我们将色谱峰面积乘以 100 以获得样品中分析物的总量。 2. 百草枯流出测定结果如图 2A 所示。在每个时间点采集相同数量的原生质体进行百草枯测定。原生质体中的百草枯含量由其色谱峰面积表示。时间点 0的百草枯水平设为 100% 其他时间点百草枯的相对含量按图2B的公式计算。 3. 根吸收测定结果如图 2C 所示。百草枯的色谱峰面积除以材料的数量，即拟南芥材料（如根和叶）的重量，得到组织中归一化的百草枯含量。比较了不同样品中的百草枯含量。

图 2.通过 UHPLC-MS/MS 测定原生质体和植物组织中的百草枯。 (A)使用拟南芥叶原生质体的百草枯流出测定。原生质体中的百草枯水平由其色谱峰面积表示。每个时间点至少确定三个重复。时间点 0 的百草枯水平设定为 100%，其他时间点百草枯的相对水平使用图 2(B) 中给出的公式计算。显示的样本是 Col-0（野生型对照）、DTX6m-11（DTX6m 过表达系）和dm-5 （ dtx5 dtx6双突变体）（ Lv等人，2021 年）。值是平均值±SD（n = 3）。通过学生 t 检验分析 Col-0 与其他材料之间差异的显着性。 PQ，百草枯。 ** P≤0.01 ； * P≤0.05 。 (B)拟南芥原生质体不同时间点百草枯相对含量的计算公式。 PA t ：各时间点百草枯的峰面积； PA 0 ：百草枯在时间点 0 处的峰面积。 (C)使用拟南芥根的百草枯吸收测定。拟南芥用 10 μM 百草枯在黑暗中放置 6 h，组织中的百草枯含量定义为百草枯的色谱峰面积除以组织的鲜重。值是平均值±SD（n = 3）。执行双向方差分析以显示差异的显着性。

食谱
1. W5缓冲液（用于原生质体实验） 154 毫米氯化钠 125 毫米氯化钙2 5 毫米氯化钾 2毫米MES (pH 值 5.7) 注：各试剂配制母液，过滤后4℃保存。使用母液新鲜制作 W5 缓冲液。
2. 百草枯处理液（原生质体实验用） 154 毫米氯化钠 125 毫米氯化钙2 5 毫米氯化钾 2毫米MES (pH 值 5.7) 5毫米百草枯注意：使用每个组件的存储母液新鲜制作此解决方案。百草枯母液应于-20℃避光保存。 3. 洗涤缓冲液（用于原生质体实验） 154 毫米氯化钠 125 毫米氯化钙2 5 毫米氯化钾 2毫米MES (pH 值 5.7) 注意：使用储存的母液新鲜制作洗涤缓冲液。
4. 百草枯提取液 60% 甲醇 40% 0.5 M盐酸注意：此溶液可在 -20 °C 下储存三个月。
5. 复溶溶液 50% 乙腈 50% Milli -Q 水注意：新鲜制作此溶液。
6. 液相色谱流动相溶剂 A（pH = 3.95）： 100毫米NH 4 OAC 0.5% 甲酸水溶液溶剂 B：乙腈：新鲜配制溶剂 A。

致谢
该协议是根据先前描述的方法开发的( Pizzutti et al., 2016 ; Zou et al., 2015 ) 。这项工作得到了国家自然科学基金的支持（批准号 31970343 和 31770274）

利益争夺
未声明利益冲突。

参考
Chen, R., Sun, S., Wang, C., Li, Y., Liang, Y., An , F., Li, C., Dong, H., Yang, X., Zhang, J. and Zuo , J. (2009).拟南芥PARAQUAT RESISTANT2 基因编码一种 S-亚硝基谷胱甘肽还原酶，它是细胞死亡的关键调节因子。细胞研究19(12)：1377-1387。 Farrington, JA、Ebert, M.、Land, EJ 和 Fletcher, K. (1973)。联吡啶季铵盐和相关化合物。五、百草枯自由基与氧反应的脉冲辐解研究。对联吡啶类除草剂作用方式的影响。生物化学生物物理学学报314(3)：372-381。 Fujibe , T.、 Saji , H.、Arakawa, K.、Yabe, N.、Takeuchi, Y. 和 Yamamoto, KT (2004)。拟南芥的甲基紫精抗性突变体与对臭氧敏感的 rcd1 是等位基因，可耐受补充的紫外线 B 照射。植物生理学134(1)：275-285。 Fujita, M.、Fujita, Y.、 Iuchi , S.、Yamada, K.、Kobayashi, Y.、 Urano , K.、Kobayashi, M.、Yamaguchi-Shinozaki, K. 和 Shinozaki, K. (2012)。多胺转运蛋白的自然变异决定了拟南芥对百草枯的耐受性。过程国家队科学院美国科学杂志A 109(16)：6343-6347。 Fussell , KC, Udasin , RG, Gray, JP, Mishin , V., Smith, PJ, Heck, DE 和Laskin , JD (2011)。氧化还原循环和氧利用增加导致敌草快在过表达 NADPH-细胞色素 P450 还原酶的中国仓鼠卵巢细胞中诱导的氧化应激和细胞毒性。自由基_ 生物学医学50(7)：874-882。霍克斯，TR (2014)。植物对百草枯的抗性机制。害虫管理科学70(9)：1316-1323。 Huang, YJ, Huang, YP, Xia, JQ, Fu, ZP, Chen, YF, Huang, YP, Ma, A., Hou, WT, Chen , YX, Qi, X., 等。 (2022)。 AtPQT11 是一种 P450 酶，可通过 N-去甲基化作用使百草枯解毒。 J 基因组学S1673-8527(22)00127-8。内政部：10.1016/j.jgg.2022.04.007。 Li, J., Mu, J., Bai, J., Fu, F., Zou , T., An , F., Zhang, J., Jing, H., Wang, Q., Li, Z.,等。 (2013)。百草枯抗性 1 是一种定位于高尔基体的推定转运蛋白，参与百草枯的细胞内转运。植物生理学162(1)：470-483。 Luo, C., Cai , XT, Du, J., Zhao, TL, Wang, PF, Zhao, PX, Liu, R., Xie, Q. , Cao, XF 和 Xiang, CB (2016)。 PARAQUAT TOLERANCE3 是一种 E3 连接酶，它通过靶向组蛋白修饰蛋白甲基转移酶 4b 来关闭激活的氧化反应。 PLoS Genet 12：e1006332。 Lv , Z., Zhao, M., Wang, W., Wang, Q., Huang, M., Li, C., Lian , Q., Xia, J., Qi, J., Xiang, C.,等。 (2021)。将 MATE 家族蛋白 DTX6 中的 Gly311 变为酸性氨基酸可增强拟南芥对二氢吡啶类除草剂的抗性。 Mol Plant 14(12)：2115-2125。 Nazish , T., Huang, YJ, Zhang, J., Xia, JQ, Alfatih , A., Luo, C., Cai , XT, Xi, J., Xu, P. 和 Xiang, CB (2022)。了解拟南芥中的百草枯抗性机制，以促进抗百草枯作物的开发。植物公社3(3)：100321。 Pizzutti , IR, Vela, GM, de Kok , A., Scholten , JM, Dias, JV, Cardoso, CD, Concenco , G. 和 Vivian, R. (2016)。百草枯和敌草快的测定：LC-MS 方法优化和验证。食品化学209：248-255。 Tsugane , K.、Kobayashi, K.、 Niwa , Y.、 Ohba , Y.、Wada, K. 和 Kobayashi, H. (1999)。在盐胁迫下以光合自养方式生长的隐性拟南芥突变体显示出增强的活性氧解毒能力。植物细胞11(7)：1195-1206。 Xi, J.、Xu, P. 和 Xiang, CB (2012)。定位于质膜的 ABC 转运蛋白 AtPDR11 的缺失赋予拟南芥对百草枯的耐受性。植物杂志69(5)：782-791。 Xia, JQ, Nazish , T., Javaid , A., Ali, M., Liu, QQ, Wang, L., Zhang, ZY, Zhang, ZS, Huang, YJ, Wu, J., 等。 (2021)。 MATE 家族转运蛋白 DTX6 的功能获得突变赋予拟南芥对百草枯的抗性。 Mol Plant 14(12)：2126-2133。 Yoo , SD、Cho, YH 和 Sheen, J. (2007)。拟南芥叶肉原生质体：用于瞬时基因表达分析的多功能细胞系统。 Nat Protoc 2(7)：1565-1572。 Zou , T.、He, P.、Cao, J. 和 Li, Z. (2015)。使用 HPLC-MS-MS 测定蔬菜中的百草枯。色谱杂志科学53(2)：204-209。 Weigel , D. 和Glazebrook , J. (2002)。拟南芥：实验室手册。冷泉港实验室出版社。