材料和试剂
1.C57BL/6NCrSlc 小鼠（6-8 周龄雄性；日本 SLC）
2.50 mL 聚丙烯锥形管（Corning，Falcon® ，目录号：352070）
3.15 mL 聚丙烯锥形管（Corning，Falcon® ，目录号：352096）
4.用于结核菌素滑动尖端的 1 mL 注射器（TERUMO，目录号：SS-01T）
5.注射针25G×1（TERUMO，目录号：NN-2525R）
6.胰岛素注射器（带 27G × 1/2 针头）（TERUMO，目录号：SS-10M2713）
7.静脉 D 型普通带翼针（25G × 5/8 针）（TERUMO，目录号：SV-25DLK）
8.三通旋塞阀（TERUMO，目录号：TS-TL1K）
9.30 mL 注射器锁 30 型（TERUMO，目录号：SS-30LZ）
10.5 mL Costar Stripette （康宁，目录号：4487）
11.10 mL Costar Stripette （康宁，目录号：4488）
12.25 mL Costar Stripette （康宁，目录号：4489）
13.MOG 35-55 （MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK，Sigma-Aldrich）
14.弗氏不完全佐剂（IFA）（Sigma-Aldrich，目录号：F5506）
15.结核分枝杆菌H37RA（DIFCO，目录号：231141）
16.来自百日咳博德特氏菌的PTx （Sigma-Aldrich，目录号：P7208-50UG）
17.盐水（大冢制药，目录号：K6E85）
18.异氟烷（辉瑞）
19.氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9625）
20.氯化钾（ KCl ）（Kanto Chemical，目录号：32326-00）
21.磷酸氢二钠 (Na 2 HPO 4 ) ( Nacalai Tesque ，目录号：31801-05）
22.磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（Kishida Chemical，目录号：000-63955）
23.2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)（Sigma-Aldrich，目录号：H4034）
24.氢氧化钠（NaOH）（FUJIFILM Wako Chemicals，目录号：198-13765）
25.4% 多聚甲醛磷酸盐缓冲溶液 (PFA) ( Nacalai Tesque ，目录号：09154-85）
26.Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
27.氮化钠（FUJIFILM Wako Chemicals，目录号：197-11091）
28.来自牛奶的酪蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：C3400）
29.1,2-己二醇（东京化成，目录号：H0688）
30.1-甲基咪唑（东京化成工业，目录号：M0508）
31.2,3-二甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮（东京化成工业，目录号：D1876）
32.烟酰胺（东京化成工业，目录号：N0078）
33.硅油（Shin-Etsu Silicone，目录号：HIVAC-F4）
34.矿物油（Sigma-Aldrich，目录号：M8410-1L）
35.抗肌动蛋白，α-平滑肌 (α-SMA)–FITC 抗体，小鼠单克隆抗体（克隆：1A4）（Sigma-Aldrich，目录号：F3777）
36.纯化的大鼠抗小鼠 CD31（克隆：MEC 13.3）（BD Biosciences，目录号：550274）
37.山羊抗大鼠 IgG (H+L) 交叉吸收二抗，Alexa Fluor TM 555（Thermo Fisher Scientific，目录号：A-21434）
38.用于光谱化学分析的二甲基亚砜（DMSO）（FUJIFILM Wako Chemicals，目录号：045-28335）
39.硼氢化钠（NaBH 4 ）（Tokyo Chemical Industry，目录号：S0480）
40.乙醇（关东化学，目录号：14033-00）
41.[1,2-双（二苯基膦基）乙烷]二氯二金(I) (Au 2 ( dppe )Cl 2 )（Sigma-Aldrich，目录号：717363）
42.二氯甲烷（关东化学，目录号：10158-81）
43.盐酸（FUJIFILM Wako Chemicals，目录号：080-01061）
44.丙酮（关东化学，目录号：01026-81）
45.甲醇（关东化学，目录号：25183-81）
46.[Au 13 ( dppe ) 5 Cl 2 ]Cl 3 (Au 13 ) [根据文献合成（ Shichibu和Konishi ，2010），参见配方]
47.1 M HEPES 缓冲液，pH 7.2（参见配方）
48.磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（参见食谱）
49.脱脂/脱色缓冲液（见配方）
50.染色缓冲液（见配方）
51.CUBIC-R（见食谱）
52.观察油（见食谱）

设备

1.显微解剖剪刀（ Hammacher ，目录号：HSB014-11）
2.微型剪刀 105 毫米直剑（AS ONE，目录号：YS-7105）
3.带角度的锯齿尖钳（ Hammacher ，目录号：HSC187-11）
4.KFI 镊子 GG（Kowa Forceps Industry，目录号：K-3 GG）
5.PIPETMAN P（Gilson，型号：P20，目录号：F123600）
6.PIPETMAN P（Gilson，型号：P200，目录号：F123601）
7.PIPETMAN P（Gilson，型号：P1000，目录号：F123602）
8.移液器（FALCON/目录号：357590）
9.光片显微镜（ LaVision BioTec / UltraMicroscope II)
10.Shake-LR（TAITEC，目录号：0054809-000）
11.Wave-SI（TAITEC，目录号：0054334-000）
12.双摇床 NR-30（TAITEC，目录号：0000205-000）
13.Neo 摇床 NS-LR（AS ONE，目录号：2-7827-01）
14.体视显微镜（OLYMPUS，型号：SZ61）
15.LED 照明器支架（OLYMPUS，型号：SZ2-ILST）
16.折射率测量设备（ATAGO，目录号：PAL-RI）

软件

1.Imaris版本 9.0.0（ Bitplane ， https://imaris.oxinst.com ）

程序

图 1 显示了该协议的概述。

图 1. 使用 Au 13纳米团簇和 CUBIC 组织清除方法进行微炎症检测的程序概述。小鼠用 MOG 35-55 /CFA（含有结核分枝杆菌H37RA的 IFA ）免疫并接受PTx注射。在第 16-20 天，当临床评分为 2-3 的实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) 发展时， EAE 小鼠注射 Au 13纳米团簇，2 小时后麻醉，并经心脏灌注 PBS，然后灌注 PFA。取出带有肋骨的脊柱并进一步进行 PFA 固定 1 天。然后，将 L1 – L6 小心切除并浸入脱脂/脱色试剂（己二醇/甲基咪唑）中四天（第 1 – 5 天）。脱脂和脱色后，L1 – L6 用抗 SMA 或抗 CD31 染色 7 天（第 5 – 12 天），并在 CUBIC-R 中进行折射率调整（第 12 – 14 天）。 Au 信号通过光片显微镜可视化并通过Imaris软件进行分析。

A.EAE的诱导

1.在 PBS 中混合 100 μL （400 μg ）4 mg/mL MOG 35-55和 100 μL CFA [10 mL IFA 加两瓶（20 mg）结核分枝杆菌H37RA] 在两个注射器中使用三通旋塞阀。通过来回按压注射器进行乳化，将内容物从一个注射器转移到另一个注射器 5-10 分钟，直到产生稳定的白色乳液（有关详细信息，请参见 Tanaka 等人，2017）。
2.在第 0 天使用带有 25G 针头的 1 mL 注射器在尾部基部用200 μL MOG 35-55 /CFA 皮下（ sc ）免疫 C57BL/6 小鼠。
3.400 纳克PTx在200 μL盐水中注入小鼠的尾静脉。
4.0-5评分系统评估 EAE 的临床评分（0，无体征；1，尾巴松弛；2，翻正反射和/或步态受损；2.5，后肢瘫痪；3，双后肢瘫痪； 4、后肢麻痹伴前肢部分麻痹；5、垂死或死亡）。

B.13纳米团簇的制备

1.合成 Au 13 纳米团簇（[ Au 13 ( dppe ) 5 Cl 2 ]Cl 3 ；参见配方 1）并根据Shichibu和Konishi (2010) 中描述的程序分离为结晶固体。
2.储存 160 μM Au 13 DMSO 中的纳米团簇。

C.13纳米团簇处理的 EAE 小鼠的脊柱

1.在注射到小鼠体内之前，将 Au 13纳米团簇用 10 mM HEPES（pH 7.2，参见配方 2）或盐水稀释 5 倍至 32 μM 。
2.使用胰岛素注射器将200 μL的 32 μM Au 13纳米团簇静脉注射到临床评分为2-3的aEAE小鼠的尾静脉中。
3.2 小时后，用 4% 异氟醚麻醉小鼠。
4.使用带翼针和注射器锁定的三通旋塞阀，用 PBS（见配方 3）和 PFA 灌注小鼠。
a.在心脏的右心耳做一个切口。
b.使用带有 25G 翼针的注射器，通过心脏的左心室注入 25 mL 的冷 PBS。
c.PBS 灌注后，使用三通活塞将溶液更改为 4% PFA。
5.注入 20 mL 的冷 4% PFA。
6.用肋骨取出脊柱（视频 1），并在 4°C 的 50 mL 管中浸入 40 mL 的 4% PFA 中 24 小时，并在 TAITEC Shake-LR 上以 60 rpm 的轨道运动摇动。

视频 1。L1-L6 准备程序。在用 PBS 和 PFA 经心脏灌注后，立即取出带有肋骨的脊柱，并用 PFA 进一步固定。然后，通过用剃刀小心地切割 T13-L1 和 L6-S1 之间的椎间盘来切除 L1-L6，在安装有 LED 照明器的立体显微镜下以 T13 肋骨作为位置标记。

D.脱脂/脱色

1.用 40 mL 的 PBS 在室温下用肋骨清洗脊柱 30 分钟三次，同时在 TAITEC Wave-SI 上以 30 rpm 的跷跷板运动摇动。
2.在安装了 LED 照明器（视频 1）的立体显微镜下仔细检查 L1 – L6。
3.将 L1 – L6浸入 50 mL 管中的 40 mL 脱脂/脱色缓冲液（参见配方 4）中，在 37 °C 下浸泡 4 天，并在 AS ONE Neo 摇床 NS-LR 上以 80 rpm 的速度往复运动摇晃。

E.抗体染色

1.清洗 L1 – L6 1 小时三次，在 TAITEC Wave-SI 上的跷跷板运动中以 30 rpm 的速度摇动。
2.稀释 FITC 偶联的 α-SMA 抗体和纯化的大鼠抗小鼠 CD31，它们分别识别动脉上的平滑肌肌动蛋白到全血管上的血小板内皮细胞粘附分子-1，分别稀释至染色缓冲液中的 1:50（参见配方 5 ).
3.将 L1 – L6 浸入 5 mL 聚丙烯管中的 1.5 mL 稀释抗体溶液中，在室温下放置 7 天，并在 TAITEC 双摇床 NR-30 上以 100 rpm 的轨道运动进行遮光和摇动。
4.清洗 L1 – L6 30 分钟三次，并在 TAITEC Wave-SI 上以 30 rpm 的跷跷板运动进行遮光和摇动。
5.对于抗 CD31 染色：
a.进一步将 L1 – L6 浸入 1.5 mL 的 Alexa Fluor 555 偶联山羊抗大鼠 IgG 中，在室温下在染色缓冲液中稀释至 1:200，并在遮光的情况下在 TAITEC 双摇床上以 100 rpm 的轨道运动摇晃两天NR-30。
b.清洗 L1 – L6 30 分钟三次，并在 TAITEC Wave-SI 上以 30 rpm 的跷跷板运动进行遮光和摇动。
6.Postfix L1 – L6，在 PBS 中加入 10 mL 的 1% PFA，室温下避光 5 小时，并在 TAITEC Wave-SI 上以跷跷板运动以 30 rpm 的速度摇动。
7.清洗 L1 – L6 30 分钟三次，并在 TAITEC Wave-SI 上以 30 rpm 的跷跷板运动进行遮光和摇动。

F.折射率调整

生物体由具有不同折射率的分子组成，例如水、蛋白质和脂质。为了通过光片显微镜在 3D 中观察哺乳动物组织，重要的是通过使折射率均匀来抑制光散射。
1.将 L1 – L6 浸入 10 mL 的 1/2 CUBIC-R [稀释的 CUBIC-R（参见配方 6）至 1:1 的 dH 2 O] 中 5 小时，遮光并在轨道中以 100 rpm 摇动TAITEC 双摇床 NR-30 上的运动。
2.丢弃 1/2 CUBIC-R 并将 L1 – L6 浸入 10 mL 的 CUBIC-R 中，在室温下过夜，在 TAITEC 双摇床 NR-30 上以 100 rpm 的轨道运动进行遮光和摇动。
3.更换为新鲜的 CUBIC-R，并在室温下将 L1 - L6 进一步浸入 4 小时，并在 TAITEC 双摇床 NR-30 的轨道运动中以 100 rpm 的速度进行遮光和摇动（图 2）。

图 2。清除腰索。组织清除前后腰索的明场图像。

G.显微镜和图像分析

1.用 10 mL 观察油清洗 L1 – L6（参见配方 7）。
2.将 L1 - L6 放入装满观察油的玻璃容器中。
3.如前所述（ Dodt等人，2007 年； Susaki等人，2014 年），使用光片显微镜（ UltraMicroscope II）获取 3D 图像。
4.以无损 16 位 TIFF 格式收集所有原始图像数据。
5.Imaris软件 9.0.0 版（图 3 和 4，视频 2 和 3）可视化、捕获和分析 3D 渲染图像。

图 3. Au 13纳米团簇检测 L5 处的微炎症，并用抗 SMA 抗体对动脉进行染色。 (A)临床评分为 2.5 的aEAE小鼠和幼稚小鼠静脉注射Au 13纳米团簇或溶剂。图中显示了用抗 SMA 抗体染色的每只小鼠清除的 L3 – L6，该抗体可识别动脉上的平滑肌肌动蛋白。 Au 13纳米团簇的信号在以 L5 为中心的背部血管和aEAE小鼠的脊髓实质中可视化为直径为 50-200 nm 的点状信号。在注射 Au 13纳米团簇的aEAE和幼稚小鼠中也观察到了血管内 Au 信号。比例尺，1,500微米。洋红色：Au 13纳米团簇；绿色：SMA（动脉）。 (B) 来自aEAE和 (A) 中的幼稚小鼠的 L5 放大图像。比例尺，1,000微米。洋红色：Au 13纳米团簇；绿色：SMA（动脉）。

图 4. Au 13纳米团簇检测 L5 处的微炎症，并用抗 CD31 抗体对全血管进行染色。给临床评分为 3 的aEAE小鼠静脉注射Au 13纳米团簇。清除了用抗 CD31 抗体染色的 L5，该抗体识别全血管上的血小板内皮细胞粘附分子-1。比例尺，400微米。绿色：Au 13纳米团簇；红色：CD31（血管）。

13纳米团簇检测 L5 处的微炎症，并用抗 SMA 抗体对动脉进行染色。临床评分为 2.5 的aEAE小鼠在静脉注射Au 13纳米团簇后的腰椎脊髓 3D 电影。清除后的腰椎脊髓用抗 SMA 抗体染色，该抗体可识别动脉上的平滑肌肌动蛋白。洋红色：Au 13纳米团簇；绿色：SMA（动脉）。

13纳米团簇检测 L5 处的微炎症，并用抗 CD31 抗体对全血管进行染色。临床评分为 3 的aEAE小鼠在静脉注射Au 13纳米团簇后的腰椎脊髓 3D 电影。清除后的腰椎脊髓用抗 CD31 抗体染色，该抗体可识别全血管上的血小板内皮细胞粘附分子 1。绿色：Au 13纳米团簇；红色：CD31（血管）。

笔记

1.由于具有高急性毒性，尤其是对真皮，含叠氮化钠的染色缓冲液被归类为特别危险的物质。
2.CUBIC-R等试剂均为安全试剂，无需在化学通风橱中配制。此外，它们高度稳定且不难制备。
3.注入 200 μL的PTx或 Au 13 纳米团簇 iv应通过缓慢按下胰岛素注射器并注入全部溶液约五秒钟来执行。
4.在我们的aEAE诱导方案中，疾病通常在免疫接种后第16-20天出现，临床评分为 2-3 。然而，疾病发作的时间和临床评分达到 2-3 的时间可能取决于 MOG 肽、CFA 和PTx的制造批次以及小鼠的年龄和性别。
5.临床评分为 3-4 的小鼠根据道德规范被人道地安乐死。
6.注入Au 13纳米团簇 4 小时时，未检测到 Au 信号。因此，我们将时间设置为 2 小时。
7.用 4% 异氟醚麻醉小鼠，然后在小鼠存活时灌注 PBS。由于经心灌注结束时使用 25 mL 的 PBS（超过总血量的 10 倍），因此小鼠在 PFA 灌注前死亡。
8.在固定、洗涤和折射率调整步骤中，可以将整个组织样本从倾析器转移到干净的容器中，然后使用没有钩子或勺子的镊子再次转移到装有新鲜缓冲液或溶液的试管中，以尽量减少损坏。
9.应在带照明器的立体显微镜下使用微型剪刀和带角度的锯齿尖钳小心地从脊柱上切除L1 – L6，以尽量减少损坏（视频 1）。
10.用于脱脂/脱色的化合物是表面活性剂，可能会影响抗原性。
11.腰椎脊髓仅定期浸入脱脂/脱色缓冲液中一次。
12.从步骤 E3 开始，样品应避光。
13.对于步骤 E3，1.5 mL Eppendorf 管可能有点小。对于脊髓，2 mL 管适用于抗体染色。
14.对于光片显微镜，拍摄的照片包括所有组织。建议每 5 μm在 Z 堆栈中获取数据。
15.在我们的协议中，不计算斑点。但是，可以使用Imaris等软件直观地计数或计算每个点的体积。

食谱

1.[Au 13 ( dppe ) 5 Cl 2 ]Cl 3 (Au 13 )
根据Shichibu和Konishi (2010) 的方法合成和分离为结晶固体。
a.将含有 NaBH 4 (66.2 mg, 1.75 mmol) 的 10 mL 乙醇添加到含有 Au 2 ( dppe )Cl 2 (302 mg, 0.35 mmol) 的 240 mL 二氯甲烷中。
b.将混合物在室温下搅拌 3 小时。
c.除去溶剂，将残余物悬浮在二氯甲烷中，并过滤。
d.将滤液蒸发至干直至形成深棕色粉末 (283.6 mg)。
e.将粉末溶解在乙醇 (49 mL) 中，然后用 1 mL 盐酸水溶液 (12 mmol) 处理。
f.将混合物在室温下搅拌 24 小时。
g.蒸发挥发物。
h.用丙酮清洗产生的残留物。
i.将所得残留物悬浮在甲醇中并过滤。
j.将滤液蒸发至干直至形成 [Au 13 ( dppe ) 5 CI 2 ]Cl 3 (Au 13 )，为红色结晶固体 (75.9 mg)。
k.13簇（~3 毫克）的结晶固体。
l.将结晶固体溶解在二甲基亚砜中（最终浓度：160 μM ）。
m.将纳米团簇在室温下避光保存最多 1 个月。

2.1 M HEPES 缓冲液，pH 7.2（1,000 毫升）
a.将 238.3 克 HEPES 添加到 800 mL 的 dH 2 O。
b.用 10 N NaOH 将缓冲液调节至 pH 7.2。
c.添加 dH 2 O 至 1,000 mL（最终浓度：1 M）。
d.2 O稀释 100 倍。
e.将缓冲液在室温下保存最多 1 个月。

3.PBS（1,000 毫升）
a.将以下物质添加到 800 mL 的 dH 2 O 中：
8 克 NaCl（最终浓度：137 mM）
0.2 克KCl （最终浓度：2.68 mM）
1.15 g Na 2 HPO 4 （最终浓度：8.1 mM）
0.2 g KH 2 PO 4 （最终浓度：1.47 mM）
b.添加 dH 2 O 至 1,000 mL。
c.PBS 在室温下最多可保存 1 个月。

4.脱脂/脱色缓冲液 (500 g)
a.将以下物质添加到 440 克 PBS 中：
50 克 1,2-己二醇 [最终浓度：10% (w/w)]
10 克 1-甲基咪唑 [最终浓度：2% (w/w)]
b.将缓冲液在室温下保存最多 1 个月。

5.染色缓冲液 (100 mL)
a.混合以下物质并添加 dH 2 O 至 100 mL：
5 mL 10% Triton X-100 的 dH 2 O（最终浓度：0.5%）
0.1 mL 10% 叠氮化钠在 dH 2 O 中（最终浓度：0.01%）
5 mL 20× PBS（终浓度：1×）
PBS 中 50 mL 的 1% 酪蛋白（最终浓度：0.5%；应在 60 °C 下加热以在 PBS 中制成 1% 的溶液）
b.将缓冲液储存在 4°C 下长达一个月。

6.CUBIC-R (500 克)
a.将以下物质添加到 125 mL dH 2 O：
225 克 2,3-二甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮 [最终浓度：45% (w/w)]
150 克烟酰胺 [最终浓度：30% (w/w)]
b.将 CUBIC-R 在室温下避光保存最多 1 个月。

7.观察油（100 克；折射率 = 1.52，25 °C）
a.将以下物质加入 100 mL 试管中并轻轻摇动：
60.2 克硅油 (HIVAC-F4)（折射率 = 1.555，25 °C）
39.8 克矿物油（折射率 = 1.467，25 °C）
b.使用折射计测量折射率，并通过添加任一油至 1.52 进行调整。
c.油在室温下最多可存放 1 个月。

致谢

我们感谢 C. Nakayama 女士、S. Takano 女士、S. Fukumoto 女士、N. Yamamoto 女士、S. Morita 女士和 M. Ohsawa 女士提供的出色技术协助和秘书协助。我们还感谢 Peter Karagiannis博士校对了文本。这项工作得到了 KAKENHI（MM、HR、SH、SIK）、日本科学技术厅（JPMXS0120330644（Q-Leap））、日本医学研究与开发署（AMED）（MM；JP21zf0127004 和 JP223fa627005）以及武田科学基金会（MM，SH）。这项研究还得到了北海道大学遗传医学研究所联合研究计划资助、北海道大学 Photo- Excitonix项目和北海道大学 (MM) 青年研究人员促进项目的部分支持。该协议基于我们之前的 EAE 诱导实验程序（Arima 等人，2012 年；Ogura 等人，2008 年；Tanaka 等人，2017 年），Au 13 纳米团簇制备（ Shichibu和Konishi ，2010 年）和 CUBIC 组织透明化方案（ Tainaka等人，2014 年）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

本文所述的所有动物实验均经北海道大学遗传医学研究所机构动物护理和使用委员会批准，并根据机构指南和规定进行。

参考

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