材料和试剂
1. BD TM结核菌素注射器，1 mL（Becton Dickinson，目录号：309659）
2. Kimwipes，一层（Fisher，目录号：06-666）
3. 可高压灭菌的微量离心管，1.5 mL（Sarstedt，目录号：72.690.300）
4. 离心管，15 mL（Sarstedt，目录号：50.809.220）
5. 一次性试管，13 × 100 mm（VWR，目录号：47729-572）
6. GC 小瓶，2 mL（ AgilentThermo Scientific，目录号5190-9062C4000-1：）
7. 螺旋盖（安捷伦,;目录号：5182-0717）
8. 巴斯德移液管（Fisher，目录号：13-678-20A 和 13-678-20C）
9. 微毛细管移液管（Kimble，目录号：71900-20）
10. 拟南芥（可从拟南芥生物资源中心获取，www.arabidopsis.org）
11. 表达avrRpt2 的丁香假单胞菌（来自圣路易斯华盛顿大学 Barbara Kunkel 博士的礼物）
12. N-甲基-N-（三甲基甲硅烷基）三氟乙酰胺（MSTFA）（Soltec Bio Science，目录号：GC113）
13. 液氮（American Welding & Gas，22 Psi）
14. 六水氯化镁（Fisher，目录号：BP214-500）
15. 乙腈（ACROS，目录号：26827-0040）
16. 丙酮（Thermo Scientific，目录号：A949-1）
17. 核糖醇（阿东糖醇；Alfa Aesar，目录号：L03253）
18. 3-磷酸甘油（Sigma，目录号：G7886）
19. 磷酸一钠（ Alfa Aesar，目录号：33385）
20. 原钒酸钠（ MP Biomedicals，目录号：159664）
21. 焦磷酸钠（ Fisher Scientific，目录号：BP330）
22. 10 mM 氯化镁（参见食谱）
23. 提取缓冲液（参见配方）
24. 内标（见配方）
25. 磷酸酶抑制剂（见食谱）

设备
1. Milli-Q Advantage A10 净水系统（EMD Millipore，型号：Z00Q0V0WW）
2. 冻干机，VirTis Freezemobile 25ES 冷冻干燥机
3. 高压灭菌器（联合蒸馏器和灭菌器，型号：SSR3APB）
4. 多功能电饭煲/流光锅（Presto Big Kettle；Walmart.com，目录号：06008）
5. 剪刀（Harbor Freight Tools，目录号：62458）
6. 铝箔（Thermo Scientific，目录号：01-213-102）
7. 防爆夹（M2 Sci，目录号：C1005-T5-lock）
8. 天平（梅特勒-托利多，型号：AT261）
9. 台式杜瓦瓶（Thermo Scientific，目录号：10-194-100B）
10. 组织研磨机（Axygen Scientific，目录号：PES15BSI）
11. 带有 Styroform 平台的 Vortexer（Labnet，型号：S0100）
12. 杜瓦瓶（Thermo Scientific，目录号：10-194-100A/B）
13. 台式离心机（Eppendorf，型号：5417C），用于离心微量离心管
14. Parker Source TriGas 发电机（Parker Hannifin，型号：LCMS-5000NA，压缩机型号：SF120872PH）
15. 台式摆臂离心机（Clay Adams，型号：Dynac 0101），用于离心一次性试管
16. 乳胶灯泡，2 mL（VWR，目录号：82024-554）
17. 气相色谱-质谱仪（GC-MS）（Agilent，型号：7890A-5977）
18. GC 柱，HP-5MS（安捷伦，目录号：19091J-413）
19. 超高纯度氦气（AWG 气体，列克星敦，肯塔基州，目录号：UN1046）
20. GC-MS 计算机（戴尔，型号：3430）
21. 用于手动 GC 注射的注射器，5 µL（Hamilton，目录号：87993）

软件
1. 用于定性和定量分析的 MassHunter 工作站（Agilent，软件版本：10.0）
2. 用于数据采集的增强型 MassHunter 工作站（安捷伦，软件版本：10.0）
3. MS 谱库（NIST；安捷伦科技）

程序

A. 设备设置
1. 气相色谱设置
色谱法：使用 30 m 毛细管 HP-5MS GC 柱进行色谱法，使用超高纯氦气作为载气设置在 1.2 mL/min 的恒定压力下。将进样口温度设置为 240 °C，将传输线温度设置为 280 °C。以不分流模式运行样品。使用表 1 中显示的温度程序进行色谱。

表 1. 用于分析核糖醇和 G3P 的GC 温度
速度温度保持时间
0 80 ℃ 1分钟
15 °C/分钟 200 ℃ 1分钟
10 ℃/分钟 280 ℃ 2分钟

2. 质谱设置
根据制造商的说明自动调谐仪器。

B. 样品制备和分析
1. 2或病原体丁香假单胞菌渗入约 4 周龄植物的最大三片叶子 avrRpt2在叶子的背面使用无针注射器。叶浸润后，用 Kimwipes去除多余的 10 mM MgCl 2液滴或病原体悬浮液。
2. 大约 16 小时后，收集 ±10-100毫克浸润叶组织。用一把剪刀对整片叶子取样。
3. 使用精确到 1 mg 数字的天平称量组织。记录每个样品的重量。 ∆关键步骤
4. 在铝箔中将叶组织冻干过夜。称重约 1–10 mg 的干叶组织，并将其放入高压灭菌的微量离心管中。
5. 将含有冻干组织的微量离心管放入含有液氮的杜瓦瓶中。将冷冻组织储存在 -80 °C 直至进一步分析。 •暂停点
6. 用塑料杵将组织研磨成细粉，并在组织解冻前立即加入 1，000 μL 的提取缓冲液。 ∆关键步骤
7. 在提取物中加入 2 µg 内标。
8. 用防爆夹盖住管子，并立即使用电动多功能锅在水中煮沸 5 分钟。 ∆关键步骤
9. × g离心管15 分钟。
10. 将上清液转移到 13 × 100 mm 玻璃试管中。
11. 用氮气流干燥上清液。干提取物可以无限期地储存在-20°C。 •暂停点
12. 在干燥的提取物中加入 250 μL 的水，然后涡旋管 30 s。
13. 在台式摆臂离心机中以约 80% 的速度（约 1,250 × g ）离心管 1 分钟。
14. 将上清液转移到新鲜的微量离心管中，然后在- 80°C 下孵育 30分钟（此步骤用于样品清理）。在室温下解冻样品，然后以 18,000 × g离心6 分钟。
15. 转移到 GC 小瓶中，并用氮气流干燥。
16. 500 μ L 的丙酮清洗小瓶以去除样品中的残留水，然后再次用氮气流干燥。
17. 使用微毛细管移液器将 50–75 µ L 的乙腈添加到干燥的样品中，将小瓶涡旋 10 s，然后添加 50–75 µ L 的含有 1%三甲基氯硅烷(TCMS) 的 MSTFA。在 65 °C下孵育样品1 小时，然后用巴斯德吸管将内容物转移到 GC 插入物中。
18. 使用选择性离子监测模式 (SIM) 将 0.5–1 µL 注入GC/MS 进行分析，使用定量离子 299 (G3P) 和 217（核糖醇）和定性离子 357 和 445 用于 G3P，以及 147 和 307 用于核糖醇。

C. 来自标准化合物分析的 GC-MS 数据
1. 图 2显示了在扫描模式下运行的核糖醇（中图）和 G3P（下图）标准品的总离子流图（上图）和相应的 MS。

图 2。核糖醇和甘油 3-磷酸 (G3P) 标准品的总离子流色谱图和相应的质谱以扫描模式运行。等重量的 GC-MS 色谱仪（100 µL 中各 2 µg）核糖醇和 G3P 混合物使用扫描模式（上图） Ribitol-TMS（9.77 分钟）和 G3P-TMS（在 10.07 分钟）是两个主要的峰。（中图）核糖醇-TMS 衍生物的质谱图。（下图）G3P-TMS 衍生物的质谱图。

2. 图 3显示了使用 SIM 模式分析标准化合物的 GC-MS 数据。根据图 2 所示的质谱图，使用三种主要离子在 SIM 模式下监测 G3P（299、357、445）和核糖醇（217、147、307）。

图 3。核糖醇和 G3P 标准品的总离子流图和相应的 MS 在选择性离子监测(SIM) 模式下运行。等重量（ 100 µL 中各 2 µg ）核糖醇和 G3P 混合物的 GC-MS 色谱仪使用 SIM 模式（上图）核糖醇-（9.77 分钟）和 G3P-TMS （在10.07 分钟）衍生物是两个主要峰（用 1/2 表示）。（中图）在 SIM 模式下为主要离子 217、147、307 选择的核糖醇-TMS 衍生物的质谱。（下图）在 SIM 模式下为主要离子 299、357、445 选择的 G3P-TMS 衍生物的质谱。每个离子的驻留时间设置为 25 毫秒。在 SIM 和扫描模式下监测的主要离子和定性离子的相对丰度相似。

D. 拟南芥叶组织中的 G3P 水平
1. 使用扫描（图 4 ）和 SIM（图 5 ）模式从拟南芥叶组织样本中进行 G3P 分析的 GC-MS 数据。

野生型Columbia-0 叶组织的总离子色谱图（上图）。核糖醇 (4 µg) 用作程序 B 中所述的内标。中间和底部面板分别显示核糖醇和 G3P-TMS 衍生物的 MS 光谱。顶部面板中的垂直线对应于显示 G3P 特定光谱的区域。

图 5。野生型Columbia-0 叶组织的色谱图。核糖醇 (4 µg) 用作程序 B 中所述的内标。（中图）在 SIM 模式下为主要离子 217、147 和 307 选择的核糖醇-TMS 衍生物的质谱。（下图）G3P 的质谱-为主要离子 299、357 和 445 选择的 SIM 模式下的 TMS 导数。

2. 病原体感染后 Col-0 植物中的相对 G3P 水平
图 6显示了接种模拟物或病原体的 Col-0 植物中的相对 G3P 水平。与模拟接种植物相比，接种病原体的野生型植物积累的 G3P 水平高约 2-4 倍。

图 6 。总离子色谱图显示模拟 (10 mM MgCl 2 ) 和病原体（丁香假单胞菌表达avrRpt2 ）中的核糖醇和 G3P 峰 -在接种后 16 小时接种野生型Columbia-0 叶组织（上图）。底部面板显示模拟和病原体接种植物中量化的 G3P 水平。用 10 mM MgCl 2中的 10 5 CFU mL -1接种植物。误差棒表示标准偏差 (n = 4)，星号表示统计显着性 (P > 0.001)。

数据分析

1. MassHunter Workstation 10.0 用于定性和定量数据分析。定量离子和定性离子之间的离子比被用作使用 SIM 模式正确识别分析物的附加措施。 G3P 水平是根据使用 500–8,000 ng 核糖醇浓度和 G3P 一式三份运行生成的标准曲线计算的（图 7 ）。

图 7. 标准曲线显示 G3P 与核糖醇的响应比。一式三份分析不同浓度的 G3P 和核糖醇（500、750、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000 和 8,000 ng）。

2. t检验进行统计分析。对于病原体测定，在单个实验中分析了约 16 种植物/基因型/处理。对于代谢物定量，在每个实验中分析了约 12 种植物/基因型/处理。用不同的植物组重复实验至少两次/三次。除非另有说明，否则误差条表示标准偏差。
3. 该方法可靠地量化了 10 – 100 毫克鲜重的拟南芥组织中的 G3P 水平，并且 GC-MS 仪器能够检测到 0.1 纳克的 G3P。含有和不含核糖醇的拟南芥组织分析表明，内标的回收率约为 100%。然而，拟南芥加入 G3P 的组织样本给出了不同的结果，这可能是因为外源性 G3P 可能与其他提取的化学物质或酶发生反应。

笔记

该协议（图 8 ）显示出出色的重现性，并已用于分析我们最近研究中报告的提取物（Shine 等人，2022 年）。

图 8. 显示基于 GC-MS 的 G3P 分析的提取和分析步骤的简化流程图

食谱

1. 10 毫米氯化镁
将 20.33 克六水氯化镁溶解在 Milli-Q 水中至最终体积为 100 mL，以获得 1 M MgCl 2 。使用液体循环将1 M MgCl 2与 1 L Milli-Q 水一起在 121 °C下高压灭菌20 分钟。溶液冷却至室温后，将 1 mL 的 1 M MgCl 2添加到 99 mL 高压灭菌的 Milli-Q 水中，并充分混合以获得 10 mM MgCl 2 。

2. 提取缓冲液
80%乙醇，含1 ×磷酸酶抑制剂。

3. 内标
Milli-Q 水中的 100 ng/µL 核糖醇（重量/体积）。
将 10 毫克核糖醇悬浮在 1 mL 高压灭菌的 Milli-Q 水中并涡旋溶解。将 10 µL 溶液稀释到另一个装有 990 µL 高压灭菌 Milli-Q 水的小瓶中，将此库存稀释 100 倍。

4. 磷酸酶抑制剂
按如下方式准备库存解决方案：

250 毫米磷酸一钠 (25 毫米)
将 299.95 毫克磷酸一钠悬浮在 10 mL 高压灭菌 Milli-Q 水中的总体积中，并使用液体循环在 121 °C下将溶液高压灭菌 20 分钟。

100 mM 原钒酸钠 (1 mM)
将 183.9 mg 原钒酸钠悬浮在 10 mL 高压灭菌 Milli-Q 水中的总体积中，并使用液体循环在 121 °C下将溶液高压灭菌 20 分钟。

悬浮100 mM 焦磷酸钠 (10 mM)
265.9 毫克焦磷酸钠在 10 mL 高压灭菌 Milli-Q 水的总体积中，并使用液体循环在 121 °C下将溶液高压灭菌 20 分钟。

2 PO 4 、100 µL 的 100 mM 原钒酸钠和 1 mL 的 100 mM 焦磷酸钠加入 15 mL 无菌管中，从储备溶液中制备 1 ×磷酸酶抑制剂溶液。为此，添加 7.9 mL 的高压灭菌 Milli-Q 水以构成 10 mL 的 1 ×磷酸酶抑制剂。

致谢

这项工作得到了国家科学基金会的资助（IOS#051909，IOS# 2131400 ）。我们感谢 John Johnson 提供的技术帮助。作者想感谢 Duncan 等人（ Duncan 等人，1971 年）在本协议中对软管工作进行了改编。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

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