材料和试剂
化学化合物

1. 硫酸卡那霉素（FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.，目录号：117-00341）
2. 氨苄西林钠盐（FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.，目录号：012-23303）
3. 利福平（ Nacalai Tesque Inc.，目录号：30259-94）
4. [ ( NH4 ) 2SO4 ] ( Nacalai Tesque Inc.，目录号：02633-15）
5. 硫酸镁七水合物（MgSO 4 · 7H 2O ）（FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.，目录号：131-00405 ）
6. 二水氯化钙(CaCl2 · 2H2O ) ( Nacalai Tesque Inc.，目录号：031-00435）
7. 磷酸二氢钾 (KH 2 PO 4 ) ( Nacalai Tesque Inc.，目录号：28721-55）
8. 磷酸氢二钠七水合物 (Na 2 HPO 4 · 7H 2 O) ( Nacalai Tesque Inc.，目录号：31725-15）
9. 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 (HEPES) ( Nacalai Tesque Inc.，目录号：17514-86）
10. 硫酸亚铁 (FeSO 4 )（FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.，目录号：094-02942）
11. 丙酮酸钠（FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.，目录号：191-03061）
12. 氢氧化钠 (NaOH) ( Nacalai Tesque Inc.，目录号：31511-05）
13. 氯化钠 (NaCl) ( Nacalai Tesque Inc.，目录号：31319-45）
14. 十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) ( Nacalai Tesque Inc.，目录号：07906-82）
15. 十二烷基硫酸钠 (SDS) ( Nacalai Tesque Inc.，目录号：30400-85）
16. 苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）（FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.，目录号：311-90151）
17. 氯仿（ Nacalai Tesque Inc.，目录号：08401-65）
18. 异丙醇（ Nacalai Tesque Inc.，目录号：29113-95）
19. 乙醇（ Nacalai Tesque Inc.，目录号：14713-95）
20. 三水醋酸钠 (CH 3 COONa · 3H 2 O) ( Nacalai Tesque Inc.，目录号：31115-05）
21. 三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）（ Nacalai Tesque Inc.，目录号：35434-21）
22. 乙二胺四乙酸四钠盐（EDTA-4Na）（FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.，目录号：349-01885）
23. 35% 盐酸 (HCl) ( Nacalai Tesque Inc.，目录号：18321-05）
24. 醋酸（ Nacalai Tesque Inc.，目录号：00212-85）
25. 聚乙二醇 8000 (PEG8000)（MP Biomedicals LLC.，目录号：195445）
26. 甘油（ Nacalai Tesque Inc.，目录号：17017-35）
27. 二甲基亚砜 (DMSO) ( Nacalai Tesque Inc.，目录号：13407-45）
28. 氯化钾 ( KCl ) ( Nacalai Tesque Inc.，目录号：28514-75）
29. 氯化镁 (MgCl 2 ) ( Nacalai Tesque Inc.，目录号：20935-05）
30. D-葡萄糖 ( Nacalai Tesque Inc.，目录号：16805-35）
31. 琼脂糖 S（FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.，目录号：312-01193）
32. 1 kb Plus DNA 阶梯（ Thermo Fisher Scientific，目录号：10787018）
33. 溴化乙锭溶液 (10 mg/mL) ( Nacalai Tesque Inc.，目录号：14631-94）
34. 绿色核酸染色剂（Midori Green Advance，Nippon Genetics Co.Ltd.，目录号：NE-MG04）
35. 液氮（Air Water Inc.，YJ code number: 799070CX1020）

文化传媒

1. BD Difco LB 肉汤，Lennox（ Thermo Fisher Scientific，目录号：240230）
2. BD Bacto琼脂（ Thermo Fisher Scientific，目录号：214010）
3. BD Bacto酵母提取物（ Thermo Fisher Scientific，目录号：212750）
4. BD Bacto胰蛋白胨（ Thermo Fisher Scientific，目录号：211705）
5. BD Difco营养肉汤（ Thermo Fisher Scientific，目录号：234000）

维生素

1. D-生物素（ Nacalai Tesque Inc.，目录号：04822-04）
2. 叶酸（ Nacalai Tesque Inc.，目录号：16221-91）
3. 盐酸硫胺素 (HCl) ( Nacalai Tesque Inc.，目录号：36319-24）
4. D -泛酸钙（ Nacalai Tesque Inc.，目录号：26004-44）
5. 维生素 B12（ Nacalai Tesque Inc.，目录号：36323-96）
6. 核黄素（ Nacalai Tesque Inc.，目录号：36322-51）
7. 烟酸（ Nacalai Tesque Inc.，目录号：24326-52）
8. 盐酸吡哆醇（ Nacalai Tesque Inc.，目录号：29611-81）
9. 对氨基苯甲酸（ Nacalai Tesque Inc.，目录号：01930-32）

酵素

1. 蛋白酶 K（FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.，目录号：166-28913）
2. 核糖核酸酶 A（FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.，目录号：182-01493）
3. 来自蛋清的溶菌酶（FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.，目录号：122-02673）
4. 谢谢 Gflex DNA 聚合酶（Takara Bio Inc.，目录号：R060A）
5. PrimeStar Max DNA 聚合酶（Takara Bio Inc.，目录号：R045A）
6. FastDigest限制酶Bam HI 、 Hin dIII和Sma I （ Thermo Fisher Scientific，目录号：FD0054、FD0504、FD0663）

套件

1. 凝胶上样缓冲液（10 × ）（ Thermo Fisher Scientific，目录号：10816015）
2. 凝胶提取试剂盒（Promega Co.，Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System，目录号：A9282）
3. 质粒提取试剂盒（Merck KGaA ， GenElute TM Plasmid Miniprep Kit，目录号：PLN350-1KT）
4. DNA 连接试剂盒（Takara Bio Inc.，目录号：6023）

材料

1. 5 0 mL 聚丙烯管（IWAKI AGC Techno Glass Co., Ltd.，目录号：2345-050）
2. 15 mL 聚丙烯管（IWAKI AGC Techno Glass Co., Ltd.，目录号：2425-015）
3. 1.5 mL 离心管（Midland Scientific，目录号：311-08-052）
4. PCR微管（Bio Regenerations Co.，Ltd.，目录号：BRG-DC-01）
5. φ 90 × 15 mm 灭菌盘（RIKAKEN Holdings Co., Ltd，目录号：RSU-SP915-2）
6. 10 和 30 mL 注射器（TERUMO Co., Ltd.，目录号：SS-10ELZ、SS-30ESZ）
7. 25 G × 1 英寸注射针（TERUMO Co., Ltd.，目录号：NN-2525R）
8. Stericup快速释放-HV 无菌真空过滤系统（Merck Millipore，目录号：S2HVU05RE）
9. MF-Millipore 膜过滤器，0.22 µm 孔径（Merck Millipore，目录号：GSWP04700）
10. 牙签（例如， Yanagi Products Co., Ltd., DN Tsumayouji L）
11. 0.22 μ m注射器过滤器（Sartorius AG，目录号：S7597-FXOSK）
12. 真空过滤装置（Merck Millipore，目录号： SCGPS02RE）
13. 2.0 m L 库存管（ Sarstedt AG，目录号：72.694.107.03）
14. IWAKI 20 mL 玻璃试管（φ 16.5 × 165 mm）（AGC Techno Glass Co., Ltd.，目录号：TEST16.5NP）
15. 试管盖（φ 17 – 18 mm）（LÜDI SWISS AG，目录号：08418）
16. 锥形瓶（200 mL）（AGC Techno Glass Co.，Ltd.，目录号：4980FK200）
17. 硅塞（Shin-Etsu Polymer Co.，Ltd.，目录号：T-38）
18. 100–1,000 mL 培养基瓶（AGC Techno Glass Co., Ltd.，目录号：1516/04D、1516/08D、1516/10D）
19. 用于电穿孔的比色杯（2 mm 间隙）（NEPA GENE Co. Ltd.，目录号：EC-002S）

细菌菌株

1. 纤毛虫霍洛氏菌SP-6（ATCC 菌株 51168）
2. 枯草芽孢杆菌168（实验室库存）
3. 大肠杆菌S17-1（实验室储备）
4. 大肠杆菌DH5 α （实验室储备）
5. 大肠杆菌SN1187 [国家生物资源项目 –大肠杆菌菌株（国家遗传学研究所，日本三岛）]

质粒

1. pSUP5011::Tn5-mob（实验室库存，DSMZ 系列 5167）
2. pUC18（Takara Bio Inc.，目录号：3218）

准备好的食谱（见下面的食谱）

1. MSVP（ATCC 1917）中等
2. LB培养基
3. SOC介质
4. 注意培养基
5. 1 M MgSO 4和 1 M MgCl 2溶液
6. 1 M 葡萄糖溶液
7. NaCl 溶液 (0.9%, 5 M)
8. 缓冲液
9. 十缓冲器
10. 10% SDS 溶液
11. CTAB/氯化钠溶液
12. 3 M 醋酸钠 ( CH 3 COONa)溶液
13. 50 × TAE 缓冲液
14. 2 × TSS解决方案
15. TSS解决方案
16. 50%甘油溶液
17. 利福平溶液
18. 卡那霉素溶液
19. 氨苄青霉素溶液

设备

1. 往复式摇床（TAITEC株式会社，型号：personal-11 SM、BR-41FM）
2. 离心机（Eppendorf AG.，型号：5430R、5425R）
3. 温控器（Yamato Scientific Co., Ltd.，型号：DG400）
4. 分光光度计（ERMA INC.，型号：MP-1200）
5. 净水系统（ELGA LabWater ，型号：PURELAB Chorus 1 Complete、PURELAB Chorus 2+）
6. pH计（HORIBA，Ltd.，型号：F-74）
7. 电子秤（A&D有限公司，型号：HR-202i）
8. 带热板的磁力搅拌器（ Kenis ，型号：MI10 33220962）
9. 高压灭菌器（TOMY SEIKO Co., Ltd.，型号：LBS-245）
10. 安全柜（DALTON Co., Ltd.，型号：Class 2 A1）
11. 热循环仪（BIO-RAD，型号：T-100）
12. 微波（例如夏普株式会社，型号：RE-21G）
13. 海底电泳系统（Mupid.com，型号：Mupid-2plus）
14. 凝胶文件系统（ATTO Co.，型号：WSE-5400 Printgraph Classic）
15. 热块培养箱（ Anatech Co., Ltd.，型号：5520a）
16. NanoDrop UV-Vis 分光光度计（ Thermo Fisher Scientific，型号：2000c）
17. 搅拌机（Vortex株式会社，型号：VORTEX-GENIE 2）
18. 可调排气量移液器（Gilson Inc. 型号：PIPETMAN P 系列）
19. 电穿孔系统（Bio-Rad Laboratories Inc.，型号： Genepluser 细胞）
20. -30℃冷冻机（例如日本冷冻机株式会社，型号：GS-5210HC）
21. -80℃冰箱（例如Thermo Fisher Scientific，型号：TSX600G）
22. LED照明器（光码股份有限公司，型号：LED-EXTA/GFP＋RFP）
23. 陶瓷镊子（ASONE，目录号：7-166-03）
24. 显微镜（例如 Carl Zeiss，型号： Axio observer Z1 ）

软件

1. AP E ( https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fbinf.2022.818619/full ) 用作 DNA 质粒序列编辑器
2. R 软件版本 4.2.2 [R 核心团队 (2022)。 R：一种用于统计计算的语言和环境。 R 统计计算基金会，奥地利维也纳。 ( https://www.R-project.org/ )] 用于统计

程序

A. 从 SP-6 细胞制备基因组 DNA

该协议基本上在Kunoh等人中进行了描述。 (2015b)。
1. 挑选SP-6 细胞，涂在MSVP 琼脂板上，并在室温 (RT)下孵育3-5天。
2. 用消毒牙签在 MSVP 板上挑选几个 SP-6 细胞菌落，接种到 50 mL 聚丙烯管中的 25 mL MSVP 液体培养基中，并在 RT 下以 70 rpm 摇动孵育2-3天。
3. 以 7,000 离心收集呈指数增长的 SP-6 细胞（总共 50 – 100 mL） g 5 分钟。
4. μ g /mL 蛋白酶 K 和 0.6% SDS的 5 mL TE 缓冲液中重悬，并转移到 15 mL聚丙烯管中。
5. 在 65 ℃ 孵育 1 小时后，向细胞悬浮液中加入 1 mL 5 M NaCl 和 800 μ L CTAB/NaCl 溶液，并在 37 °C 下以190 rpm 摇动再孵育一小时。
6. 为去除蛋白质，向细胞悬液中加入等体积（~7 mL）的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），倒置混匀，7,000 离心 g 15 分钟。
7. 将生成的水相转移到新的 15 mL 聚丙烯管中，并按照步骤 A5 中的说明进行氯仿提取。
8. 对于核酸沉淀，将产生的上清液转移到新的 15 mL聚丙烯管中，加入等体积（~5 mL）的异丙醇，并在 -20 °C 下孵育 1 小时。
9. 然后，通过离心（7,000 g ，30 分钟）并弃去上清液，然后用约 5 mL 的 70% 乙醇冲洗沉淀。
10. 将沉淀在室温下干燥 15 分钟后，通过移液器将其重悬于含有 20 μ g /mL 核糖核酸酶 A 的 500 μ L TE 缓冲液中，转移至 1.5 mL 离心管中，并在 37 °C 下孵育悬浮液 30分钟。
11. 要从悬浮液中去除核糖核酸酶 A，加入等体积 (~500 μ L ) 的苯酚/氯仿/异戊醇 (25:24:1)，倒置混合，然后离心（15,000 g , 30 分钟)。然后，将生成的水相转移到新的 1.5 mL离心管中。重复此步骤一次。
12. 对于核酸沉淀，将等体积 (~500 μ L ) 的乙醇和 1/10 体积 (~50 μ L ) 的 3 M CH 3 COONa 溶液添加到所得水相中。
13. 孵育约 30 分钟后，将混合物离心（15,000 g ，30 分钟）并去除上清液，然后用 70% 乙醇漂洗沉淀。
14. 在 RT 干燥 5 分钟后，将生成的颗粒悬浮在 ±100 μ L的 TE 缓冲液中。然后，使用NanoDrop 2000c 确定悬浮液的 DNA 浓度。

B. 枯草芽孢杆菌168 细胞基因组 DNA 的制备

1. 用消毒牙签从甘油库存中挑选B.subtilis 168 细胞，涂在 LB 琼脂板上，并在 37°C 下孵育过夜。
2. 将单个菌落接种到试管中的 4 mL LB 培养基中，并在 37°C 下摇动过夜孵育。
3. 将细胞培养物转移到 1.5 mL 离心管中并通过离心（20,000 g , 1 分钟)。
4. μg /mL 核糖核酸酶 A 和 30 μg /mL 溶菌酶的 300 μL十缓冲液中重新悬浮产生的细胞颗粒，并在 RT 下孵育 20 分钟。
5. 要裂解细胞，请向细胞悬浮液中加入 9 μL的 10% SDS 溶液，通过倒置轻轻混合，并在 50 °C下孵育10 分钟。
6. 向细胞裂解液中加入 200 μL TEN 缓冲液和 500 μL苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），轻轻倒置混匀，20,000 离心 g 10 分钟。
7. 将上层水相转移至新的离心管中，加入1 mL乙醇，倒置混匀，20,000离心 g 10 分钟。
8. 弃上清，加70%乙醇1mL漂洗，20000离心 g 5 分钟。
9. 丢弃上清液，干燥 DNA 颗粒，然后将其重新悬浮在 200 μL的 TE 缓冲液中。用 TE 缓冲液稀释约 10 倍，并将所得 DNA 溶液用作 P CR 的模板。

C. Km r和 pUC18- mob的构建

1. 要构建 pUC18- Km r ，请在 37 °C 下用Sma I和Hin dIII消化 20–50 ng pSUP5011 和 pUC18 30 分钟。要构建 pUC18- mob ，请用Bam HI消化这些质粒。
2. 从 pSUP5011 中纯化插入的 DNA（分别为 1.3 kb HindIII - Sma I和 1.8 kb Bam HI片段），并通过琼脂糖凝胶提取消化 pUC18。
3. 根据制造商的说明，使用 DNA 连接试剂盒将纯化的插入 DNA 克隆到 pUC18 中。
4. 通过电穿孔将连接混合物转化大肠杆菌DH5 α细胞，将细胞传播到含有 50 μg /mL 氨苄西林钠盐的 LB 板上，并在 37°C 下孵育过夜。
5. μg /mL 氨苄青霉素钠盐的LB 琼脂上重新划线，并在 37°C 下孵育过夜。
6. μg /mL 氨苄青霉素钠盐的 LB 培养基中，并在 37 °C 下振荡孵育过夜。
7. 离心收集细胞（20,000 g ，1 分钟）并根据制造商的说明使用GenElute TM质粒小量提取试剂盒提取质粒 DNA（pUC18- mob和 pUC18- Km r ）。
8. 通过消化限制酶来确认质粒 DNA。

D. 质粒 pUC18- mob - Lcho_0008:: Km r的构建对于Lcho_0008基因缺失（见图 1 和 2）

标准重叠延伸 PCR、琼脂糖凝胶 DNA 提取和 iVEC3 系统分别在 H、G 和 I 节中进行了描述。

图 1. 质粒构建概述（参见Kunoh等人，2022 年）。为了构建用卡那霉素抗性基因 ( Km r )替换Lcho_0008基因的质粒，我们首先将含有来自 pSUP5011 的Km r和mob的片段分别插入到 pUC18 中。然后，使用分别从L. cholodnii SP-6 和B. subtilis 168分离的基因组 DNA 扩增Lcho_0008的上游和下游（约 1.5 kb）和spoVG终止子（约 0.1 kb）。同时，使用pUC- Km r质粒作为模板扩增Km r 。这四个片段通过重叠延伸 PCR逐步连接（也参见图 2 ），并通过 iVEC3 系统克隆到pUC - mob质粒中，从而构建质粒 pUC18- mob - Lcho_0008:: Km r 。现在，所得质粒不仅可以用于Lcho_0008的基因置换，还可以用于扩增Km r - spoVG终止子盒作为模板构建其他质粒，如pUC18- mob - Lcho_3510:: Km r 。 Lcho_0008_5 ′和Lcho_0008_3 ′以及Lcho_3510_5 ′ 和Lcho_3510_3 '分别代表这些基因的上游和下游片段。 spoVG代表spoVG终止子。

图 2. 重叠延伸 PCR 概览。扩增的 PCR 产物在两端包含重叠的 40 bp 区域，其Tm 值设计为 65 – 76 °C (Ave. 70 ) 。这些重叠的 40 bp 区域对于重叠延伸 PCR 很重要。 Lcho_0008_5 '和Lcho_0008_3 '分别代表Lcho_0008的上游和下游片段。 spoVG代表spoVG终止子。

1. 使用 PCR扩增Lcho_0008基因的上游（约 1.5 kb）和下游（约 1.5 kb）区域以 SP-6 基因组 DNA 为模板，分别使用 Lc0008_F_out/Lc0008_Km_2 和 term-Lc0008-1/Lc0008-R-out 引物组（见表1 ）。

表 1. 用于构建 pUC18- mob - Lcho_0008:: Km r的引物
姓名引物序列
Lc0008-F-输出 5'-AGAAGTAGTGCAGGTGCTTGAATTG-3'
Lc0008-R-输出 5'-TGGTCGACGAGCTGAACCGCAAATG-3'
pUC-LC0008-1 5'-ACTCATTAGGCACCCCAGGCACAGCTGCAGCCCTTCGACTG-3'
pUC-LC0008-2 5'-AGTCGAAGGGCTGCAGCTGTGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAG-3'
Lc0008-Km-1 5'-GCATGAACATCCTGCCCTGAGCCGCAAGCACTCAGGGCGCAAG-3'
Lc0008-Km-2 5'-CCCTGAGTGCTTGCGGCTCAGGGCAGGATGTTCATGCGTCGGCAG-3'
Km-term-1 5'-CGTTTTCCGGGACGCCGGCTAAAATAACCAAAAAGCAAGGAC-3'
Km-term-2 5'-CCTTGCTTTTTGGTTATTTTAGCCGGCGTCCCGGAAAACG-3'
术语-LC0008-1 5'-TTTCAAACTTAGTTGCACTCCCCGAGCGTGGCGGGCGGGTAC-3'
术语-Lc0008-2 5'-ACCCGCCCGCCACGCTCGGGGAGTGCAACTAAGTTTGAAAAATCAG-3'
Lc0008-pUC-1 5'-TCGCAGCTTCAGCTCCGTGTTTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATG-3'
Lc0008-pUC-2 5'-TAGCTGTTTTCCTGTGTGAAAACACGGAGCTGAAGCTGCGATGAC-3'

2. 使用引物 Lc0008-Km-1/Km-term-2 和 Km-term- 通过 PCR扩增卡那霉素抗性基因 ( Km r )（约 1.2 kb）和枯草芽孢杆菌spoVG基因的转录终止子（约 0.1 kb） 1/term-LC0008-2 分别来自 pUC18- Km r和枯草芽孢杆菌168的基因组 DNA 。
3. 通过琼脂糖凝胶提取纯化四种产生的 PCR 产物（ Lcho_0008 、 Km r和spoVG终止子的上游和下游区域）。
4. Km-1和 term-Lc0008-2引物通过重叠延伸 PCR连接这些 Km r 和 spoVG 终止子的纯化产物，从而产生Km r - spoVG 分段（看图 2 ) 。
5. Km r - spoVG纯化产生的 PCR 产物分段和 Lcho_0008的上游和下游区域（步骤 D3、D4）通过使用 pUC-Lc0008-1 和 Lc0008-pUC-2 引物的重叠延伸 PCR，导致上游Lcho_0008 + Km r -s poVG + 下游Lcho_0008片段的产生。
6. 通过琼脂糖凝胶提取纯化产生的 PCR 产物，并在步骤 D9 的后续 iVEC3 程序中用作插入 DNA。
7. -mob质粒作为模板，使用 pUC-Lc0008-2 和 Lc0008-pUC-1 引物通过反向 PCR 扩增质粒骨架。
8. 通过琼脂糖凝胶提取纯化产生的 PCR 产物，并将其用作步骤 D9 中 iVEC3 方法的载体 DNA。
9. 通过 iVEC3 系统将插入 DNA（上游Lcho_0008 + Km r -s poVG + 下游Lcho_0008 ）克隆到 pUC18- mob向量中。
10. 含有 50 μg /mL 氨苄青霉素钠盐的LB 琼脂上重新划线，并在 37°C 下孵育过夜。
11. ，在试管中加入 50 μg /mL 氨苄西林钠盐，并在 37°C 下摇动过夜孵育。
12. 离心收集细胞（20,000 g , 1 分钟) 并提取质粒 DNA (pUC18-mob- Lcho_0008:: Km r ) 根据制造商的说明使用GenElute TM质粒小量制备试剂盒。
13. 使用表 1 中列出的提取的质粒 DNA 和引物组通过 PCR 确认构建。特别是测序推荐使用质粒的插入 DNA。
现在，我们准备使用生成的质粒 pUC18-mob- Lcho_0008:: Km r进行Lcho_0008基因的基因置换。此外，我们可以使用该质粒作为构建其他质粒的模板。例如，质粒pUC18-mob- Lcho_3510:: Km r构建如下。

E. Lcho_3510基因缺失质粒的构建（见图1）

标准重叠延伸 PCR、琼脂糖凝胶 DNA 提取和 iVEC3 系统的详细方案分别在 H、G 和 J 节中描述。
1. 使用L. cholodnii通过 PCR 扩增Lcho_3510基因的上游和下游区域以 SP-6 基因组 DNA 为模板，分别使用 Lc3510-F-out/Lc3510-Km-2 和 Km-Lc3510-1/Lc3510-R-out 引物组（见表 2 ）。
2. 使用 pUC18- mob - Lcho_0008:: Km r通过 PCR扩增B. subtilis spoVG基因区域的Km r基因和转录终止子作为模板和 Lc3510-Km-1 和 Km-Lc3510-2 引物。
3. 通过琼脂糖凝胶提取纯化三个产生的 PCR 产物（ Lcho_3510和Km r终止子的上游和下游区域）。
4. 使用 pUC18-Lc3510-1 和 Lc3510-pUC18-2 引物通过重叠延伸 PCR 连接这些纯化产物。
5. 通过琼脂糖凝胶提取纯化产生的 PCR 产物，并将其用作步骤 E8 中 iVEC3 方法的插入 DNA 。
6. -mob质粒作为模板，使用 pUC18-Lc3510-2 和 Lc3510-pUC18-1 引物通过反向 PCR 扩增质粒骨架。
7. 通过琼脂糖凝胶提取纯化产生的 PCR 产物，并将其用作步骤 E8 中 iVEC3 方法的载体 DNA。
8. 通过 iVEC3 方法将插入 DNA（上游Lcho_3510 - Km r - spoVG终止子-下游Lcho_3510 ）克隆到 pUC18- mob向量中。
9. μg /mL 氨苄青霉素钠盐的LB 琼脂上重新划线，并在 37°C 下孵育过夜。
10. 将产生的菌落接种到 4 mL 的 LB 培养基中，在试管中加入 50 μg /mL 氨苄西林钠盐，并在 37°C 下摇动过夜。
11. 离心收集细胞（20,000 g ，1 分钟）并根据制造商的说明使用GenElute TM质粒小量提取试剂盒提取质粒 DNA（pUC18- mob - Lcho_3510:: Km r ）。
12. 表 2中列出的提取的质粒 DNA 和引物组通过 PCR 确认构建。特别是测序推荐使用质粒的插入DNA。

表 2。用于构建pUC18- mob - Lcho_3510:: Km r的引物
姓名引物序列
pUC18-Lc3510-1 5'-ACTCATTAGGCACCCCAGGCTCGCACGCATCCGTCCCACCGCCTTG-3'
pUC18-Lc3510-2 5'-GGTGGGACGGATGCGTGCGAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAG-3'
Lc3510-Km-1 5'-CACGGATGTTTCGAGTTTTTTGAGCCGCAAGCACTCAGGGCGCAAG-3'
Lc3510-Km-2 5'-GCGCCCTGAGTGCTTGCGGCTCAAAAAACTCGAAACATCCGTGATCCCCCTC-3'
公里-Lc3510-1 5'-TTTCAAACTTAGTTGCACTCCCGCGCGTTTTCATCCTCGGTCG-3'
公里-Lc3510-2 5'-CGAGGATGGAAAACGCGCGGGAGTGCAACTAAGTTTGAAAAATCAG-3'
Lc3510-pUC18-1 5'-GTTGAATCGGAGAACCGCCTTTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATG-3'
Lc3510-pUC18-2 5'-TAGCTGTTTTCCTGTGTGAAAAGGCGGTTCTCCGATTCAACCAGTTTC-3'
Lc3510-F-输出 5'-TTCGATCGACCGACCCTTCAGATGAG-3'
Lc3510-R-out 5'-TCCTGATTGGAGGTTGACGCAACGGTC-3'

F. 通过 PCR 扩增 DNA

1. 混合 1 μL的模板 DNA、0.15 μL的 100 μM正向引物、0.15 μL的 100 μM反向引物和 25 μL的PrimeStar Max Premix (x2)，并用超纯水填充多达 50 μL 。
2. 在 94°C 下进行初始变性 1 分钟的 PCR，然后进行 98°C 10 秒、55°C 15 秒和 72°C 30 秒/kb 的 30 个循环。

G. 从琼脂糖凝胶中提取 DNA

1. × TAE 缓冲液中的 0.8%–1.5% 琼脂糖凝胶上通过琼脂糖凝胶电泳分离 10–50 μL质粒 DNA 或 PCR 产物。
2. 使用 Midori Green Advance 将琼脂糖凝胶中的 DNA 染色约 15 分钟，以使用 470 nm LED 照明器对其进行可视化。
3. 制造商的说明，使用 Wizard ® SV 凝胶和 PCR 清理系统切除适当的 DNA 条带并从琼脂糖凝胶中提取 DNA 。

H. 重叠延伸PCR

1. 将 50–100 ng 的凝胶提取 PCR 产品与同源末端和 20 μL的PrimeStar Max Premix 混合，并用超纯水将体积调整为 40 μL 。
2. 在 94°C 下进行 PCR，初始变性1 分钟，然后进行 15 个 98°C 10 秒、55°C 15 秒和 72°C 30 秒/kb 的循环。
3. 混合 1 μL的 PCR 溶液、0.15 μL的 100 μM正向底漆、0.15 μL的 100 μM反向底漆和 25 μL的PrimeStar Max Premix，并用超纯水将体积调整到 50 μL 。
4. 在 94°C 下进行初始变性1 分钟，然后进行 30 个 98°C 10 秒、55°C 15 秒和 72°C 30 秒/kb 循环。

I. 为 iVEC3 （体内大肠杆菌克隆）系统制备大肠杆菌SN1187感受态细胞

1. 将 LB 板上的大肠杆菌 SN1187 菌落接种到4 mL 的 LB 液体培养基中，并在 37°C 下以 190 rpm 的转速摇动过夜。
2. 将 1 mL 的细胞培养物转移到 200 mL Erlenmeyer 烧瓶中的 60 mL LB 培养基中，并进一步孵育 ~ 90 分钟。
3. 600 = 0.4–0.5时，将含有细胞培养物的锥形瓶放在冰上约 10 分钟。
4. 然后，将细胞培养物转移到 50 mL 聚丙烯管中，并在 5,000 下离心 g 5 分钟。
5. 丢弃介质并将生成的细胞颗粒悬浮在 2 mL 的冰冷 LB 介质中。
6. 向细胞悬浮液中加入 1.6 mL 冰冷的 2 × TSS 溶液，并通过移液器轻轻混合。
7. 将 0.4 mL 的 DMSO 添加到生成的悬浮液中，并通过移液在 RT 中轻轻混合。
8. 将细胞悬浮液 (~ 4 mL) 分配到离心管中的 0.1 mL 等分试样中。
9. 然后，立即将细胞悬液冷冻在液氮并保持在-80°C。

J. iVEC3 系统对 PCR 产物的循环

Nozaki 和 Niki ( 2019 )基本上报道了 iVEC3 系统。载体和插入物的掺入 PCR 产物在体内使用两端重叠的 40 bp 区域进行环化。
1. 在冰上的 1.5 mL 离心管中解冻冷冻主管大肠杆菌SN1187 细胞。
2. 将 300 fmol的插入 DNA 和 60 fmol的载体 DNA 添加到感受态细胞中，通过移液器轻轻混合，并在冰上孵育 20 分钟。
3. 将悬浮液加入 1 mL 的 LB 培养基中，倒置混合，并在 37 °C 下孵育 45 分钟。
4. 然后，将细胞悬液在 20,000 下离心 g 1 min，弃去 1 mL 上清液，用剩余的上清液重悬细胞沉淀，铺于含有 50 μ g /mL 氨苄西林钠盐的 LB 平板上。

K. 大肠杆菌S17-1和DH5α感受态细胞的制备及转化

1. 使用消毒牙签在 LB 板上从甘油库存中分离大肠杆菌S17-1 或DH5 α细胞，并在 37 °C 下孵育12 小时。
2. 选择一个菌落，接种到 5 mL 的 LB 培养基中，并在 37 °C下以 190 rpm 摇动孵育 12 小时。
3. 将 200 μ L的细胞培养物转移到 200 mL Erlenmeyer 烧瓶中的 80 mL 新鲜 LB 培养基中，并在 37 °C下以190 rpm的转速摇动再孵育 ±3 小时。
4. 600 = 0.6–0.7时，将含有细胞培养物的锥形瓶放在冰上约 10 分钟。
5. 然后，将细胞培养物转移到 50 m L 聚丙烯管中，3,000 离心 g 10 分钟。
6. 对于洗涤，通过移液器将产生的细胞沉淀悬浮在 80 mL 冰冷的无菌超纯水中，并以 3,000离心 g 10 分钟。
7. 再次重复步骤 K6。
8. 将生成的细胞颗粒悬浮在 1.4 mL 的冰冷 10% 甘油溶液中，并将悬浮液转移到 1.5 mL 离心机中。
9. 然后，将细胞悬液在 7,000 下离心 g 10 分钟，弃去上清液，将所得细胞沉淀悬浮于 220 μ L冰冷的 10% 甘油溶液中。
10. μ L的等分试样分配细胞悬浮液，并将它们保持在 -80 °C 直至使用。
11. 在冰上的离心管中解冻感受态细胞。
12. 将 1 μ L质粒 DNA 添加到感受态细胞的悬浮液中，并通过移液器轻轻混匀。
13. 将生成的混合物转移到电动比色皿中。
14. 使用GenePulser X 细胞在 2.5 kV 下进行电穿孔。
15. 添加 ~ 1.0 mL 的 SOC 培养基，将细胞悬浮液转移到离心管中，并在 37°C 下孵育 1 小时。
16. μ g /mL 氨苄青霉素钠盐的LB 板上（构建质粒上的Km r可选择地允许我们使用卡那霉素进行大肠杆菌菌落选择）。

L. SP-6 利福平耐药突变体的分离（以下简称 WT*）

1. 用灭菌牙签从 MSVP 平板上挑取数个 SP-6 细胞克隆，接种到 50 mL 聚丙烯管中含有 5 μ g / mL 利福平的 25 mL MSVP 液体培养基中，室温摇动孵育 2-3 天。 70 转。
2. μ g /mL 利福平的 MSVP 板上传播 100 μ L细胞培养物，孵育 5-7天。
3. 灭菌牙签挑取单个菌落，接种到 25 mL 含 10 μ g /mL 利福平在 50 mL 聚丙烯管中，并在 RT 下以 70 rpm 摇动孵育 2-3 天。
4. 依次包含 10、15 和 20 μ g /mL 利福平的 MSVP 培养基重复步骤 L2 和 L3 三次。
5. 20 μ g /mL 利福平的 MSVP 板上分离单个菌落，并将其定义为 WT*。
6. 将 WT* 的 1 天培养与等量的 50% 甘油溶液混合，将产生的细胞悬浮液分配到库存管中，并将它们储存在 -80 °C。

M. 大肠杆菌S17-1结合将基因转移到 WT* 细胞（参见图 3）

L. cholodnii培养和维护的详细分步图表和大肠杆菌

WT* 细胞的制备
1. 在 MSVP 板上用经过消毒的牙签从甘油原液中划线 WT* 细胞，并在 25°C 下孵育 3-5天。
2. 用消毒牙签从 MSVP 板上挑选几个 WT* 菌落，接种到 50 mL 聚丙烯管（25 mL ×四管）中的 25 mL MSVP 培养基中，并在 RT 下以 70 rpm 摇动孵育 2-3 天。
3. 通过以 7,000 离心在 2 天的 MSVP 培养物中收集呈指数增长的 WT* g 5 分钟，在缺少 Ca (MSVP-Ca) 的 MSVP 中洗涤两次，并在 25 mL 的 MSVP-Ca 中再培养 6 小时（参见图 7 和 8A ）。
4. 通过在 7,000 下离心收集呈指数增长的 WT* 细胞 g 5 分钟。丢弃介质并将细胞颗粒重新悬浮在 1 mL 的 0.9% NaCl 中。
5. 将细胞悬浮液通过针头注射器（23G × 1 英寸），使用相对较高的压力将由鞘细胞链组成的细胞聚集体分解成单个细胞。
6. 将所得细胞悬浮液的体积调整为2 mL，并测量 600 nm (OD 600 )处的光密度以确定细胞密度。

大肠杆菌S17-1 细胞的制备
7. 将含有 pUC18- mob - Lcho_3510:: Km r等质粒的大肠杆菌S17-1 细胞在含有 50 μ g /mL 氨苄西林钠盐的 LB 板上用灭菌牙签从甘油原液中划线，并在 37 °C 下孵育12 小时。
8. 接种到4mL含50μg/mL氨苄西林钠盐的LB培养基中（ 4mL × 2管），37℃190rpm振荡孵育16h。
9. 通过在 3,000 下离心收集呈指数增长的大肠杆菌细胞 g 1 分钟。
10. 丢弃培养基并用 0.9% NaCl 清洗收集的细胞三次。
11. 将洗涤后的细胞重新悬浮在 2 mL 的 0.9% NaCl 中，并测量 OD 600以确定细胞密度。
大肠杆菌细胞表面排出的菌毛受损，这对结合很重要，请轻轻处理大肠杆菌细胞（步骤 M9 – M11）。

结合和菌落选择
12. 将 500 μL的 WT* 悬浮液（来自步骤 M6）滴到放置在 NB 板上的膜过滤器上，孵育 1 小时，直到膜表面没有液体（参见图 4 ）。

在膜上混合 WT* 和大肠杆菌细胞的图像

13. 将 500 μL的大肠杆菌细胞悬浮液（从步骤 M11 开始）滴到与 SP-6 孵育的同一膜过滤器上，孵育 16 小时。
14. 用镊子将膜过滤器转移到 15 mL聚丙烯管中。
15. 用 10 mL 0.9% NaCl 移液器从硝酸纤维素膜过滤器中去除细菌细胞，并在 7,000 下离心收集它们 g 5 分钟。
16. 将细菌细胞重新悬浮在 1 mL 的 0.9% NaCl中，将每块 100 µL 的板置于含有 20 μ g /mL 利福平和 50 μ g /mL 卡那霉素的MSVP 板上，并在室温下孵育 5-7 天。
17. 选择单个菌落并将它们划线到同一块板上，以便进行单菌落分离。

N. 基因置换的确认和甘油原液的制备

菌落 PCR （见图5 ）
1. 混合 0.15 μL的 100 μM正向引物、0.15 μL的 100 μM反向引物、10 μL的 2× Gflex PCR 缓冲液（Mg 2+ 、dNTP plus）和 0.4 μL的Tks Gflex DNA 聚合酶（1.25 单位/ μL ）并在 PCR 管中用超纯水调整体积至 20 μL 。
2. μ g /mL 利福平和 50 μ g /mL 卡那霉素（配方 17、18）的MSVP 板上挑取单个菌落（直径约 0.5 mm），并将它们悬浮在菌落 PCR 混合物中。
3. 按照以下步骤执行 PCR：在 94°C 下初始变性 1 分钟，然后进行 30 个 98°C 10 秒、60°C 15 秒和 68°C 1 分钟/kb 的循环。
4. 应用和电泳 10毫升聚合酶链反应产品装入 0.8% 的琼脂糖凝胶中。
5. 用溴化乙锭溶液对琼脂糖凝胶进行染色后，使用凝胶文档系统对图像进行放大。

用Km r确认Lcho_3510基因的基因替换。 Lc3510-F-out/Km-Lc3510-2（左）、Lc3510-Km-1/Lc3510-R-out（中）和 Lcho1694-F-BamHI/ Lcho1694 - R -BamHI（右）引物组用于菌落 PCR（参见表2、3和参考文献K unoh等人，2022 年）。由 1 kb Plus DNA ladder（表示为 M）确定的大小标记 (kb) 由左侧的数字和箭头表示。

表 3. 菌落 PCR 引物
姓名引物序列
Lc1694-F-BamHI 5'-CGGGATCCATGTCGAGATCGACCGCCAGCG-3'
Lc1694-R-BamHI 5'-CGGGATCCTTACTTTGCGTGACGAGCGCAGC-3'

测序
6. 如步骤 N1–N3 中所述，使用位于替换基因外部的引物 rs执行菌落 PCR 。
7. 通过琼脂糖凝胶提取纯化产生的 PCR 产物。
8. 表 2中列出的测序引物对 PCR 产品进行排序（外包给 Eurofins）。

甘油原液
9. 选择已确认的菌落（从步骤 M17 开始），接种到 25 m L的 MSVP 中，并在 RT 中孵育一天。
10. 将 0.75 mL 的细胞培养物转移到 1.5 mL 管中，与等体积的 50% 甘油溶液混合，并储存在 -80 °C。

数据分析

使用 R 软件版本 4.1.2 [R 核心团队 (2022)]通过未配对的 Welch 的t测试和 Bonferroni-Holm 方法进行统计分析。 R：一种用于统计计算的语言和环境。 R 统计计算基金会，奥地利维也纳。 ( https://www.R-project.org/ )] （参见图 6、8B 和 9 ）。

笔记

1. 枯草芽孢杆菌168 细胞的基因组DNA可以使用诸如 Wizard® 基因组 DNA 纯化试剂盒 (Promega) 等试剂盒制备。
2. 终止密码子下游的km r基因的转录，我们使用了枯草芽孢杆菌 spoVG转录终止子，因为它被证明可以形成稳定的构型 (Hudspeth et al., 1992)。但是，其他终止符也可用于此目的。
3. 对于体内克隆（iVEC3 系统），大肠杆菌菌株 (SN1187) 被设计为利用XthA的核酸外切酶 III 活性暴露每端约 40 bp 的同源区域，从而使 DNA 退火，而 DNA 聚合酶 I PolA的活性用于退火 DNA 的缺口修复（Nozaki 和 Niki，2019）。尽管我们推荐该系统，因为它具有成本效益，但也可以使用其他克隆试剂盒，例如 In-Fusion ® HD 克隆试剂盒 ( Clontech )。
4. 质粒 pUC18-mob- ∆ Lcho_3510:: Km r 可从 RIKEN BRC Japan collection (RDB No.19817 pUC18_delLcho3510) 获得。如果L. cholodnii请与我们联系需要应变 WT*。
5. 经菌落PCR及后续琼脂糖凝胶电泳检测，未检测到单交叉重组整合整个质粒时大小对应的长条带（见图5），说明获得的菌落大部分为双交叉重组。
6. ，我们使用大肠杆菌S 17-1作为捐助者。然而，已知 S 17-1菌株会悄悄转移噬菌体 Mu。因此，我们鼓励使用无 Mu 供体菌株，例如MFD pir ( Ferrières et al., 2010)。
7. 我们检查了不同供体-受体比例的偶联效率。 WT*（步骤 M6）和 S17-1（步骤 M11）的细胞悬浮液在膜过滤器上混合之前进行稀释。缀合后，将洗涤后的细菌悬浮液（步骤 M16）连续稀释并铺板在含有利福平和利福平/卡那霉素的 MSVP 上，以分别计数总 WT* 细胞及其转缀合物。图 6表明当 WT*:S17-1 比率为 1:1 时，效率往往最高。

图 6. 不同供体-受体比例的偶联效率。通过未配对的 Welch's t检验和 Bonferroni-Holm 方法进行统计分析，表明没有显着差异。

8. 我们认为当 WT* 细胞的细胞表面没有鞘时，WT* 和 S17-1 之间的结合是有效的（图 7 ）。由于我们之前报道过 SP-6 细胞在无钙条件下培养时会变得无鞘（ Kunoh等人，2021），因此收获在常规 MSVP 中培养的 WT* 细胞并在缺乏 Ca 的 MSVP 中进一步培养（MSVP-Ca）再增加 6 小时（步骤 M3）（图 8A ）。正如预期的那样，图 8B表明在 MSVP-Ca 中额外培养的结合效率比没有额外培养 ( MSVP+Ca ) 的结合效率高约 2 倍。

抑制鞘形成提高结合效率的策略

图 8。抑制鞘形成的结合效率。明场图像表明在缺钙条件下培养时聚集体形成减少(A)。在无钙培养基中培养或不培养细胞的结合效率 (B) 。通过未配对的 Welch's t检验进行统计分析。 * p < 0.04。

9. 为了验证所描述的方法是否普遍适用于基因转移，我们使用了另外三个设计用于靶向Lcho_1694 、 Lcho_2352和Lcho_2734位点的质粒。如图9所示，代表性质粒的结合效率相当，我们认为我们的方法可用于针对不同基因座的构建。

图 9.针对不同位点的质粒的结合效率。通过Welch 的t检验和 Bonferroni-Holm 方法进行统计分析，表明没有显着差异。

图 9所示的实验中，当分别使用25 × 4 和 8 × 2 mL 的霍洛氏乳杆菌和大肠杆菌培养物进行偶联时，平均获得了大约 250 个菌落。经菌落PCR证实，大部分候选菌落的基因置换正确。这些结果暗示我们可以按照本协议中的描述设置诱变实验。

食谱

1. MSVP（ ATCC 1917 ）中等
准备用于培养 SP-6 细胞的 MVSP 培养基（Emerson 和Ghiorse ，1993）（见表4、5 ）。从用于缺钙培养基 (MSVP-Ca) 的 MSVP 原始配方中省略CaCl 2 · 2H 2 O。要分离自发的利福平抗性突变体 (WT*)，请依次将细胞悬浮液传播到含有 5、10 和 20 μ g /mL 利福平的 MSVP 板上。含有 20 μ g /mL 利福平和 50 μ g /mL 硫酸卡那霉素的 MSVP 板可用于筛选含有Km r基因的 WT* 重组体，因为大肠杆菌S17-1 细胞对利福平敏感，而非重组 WT* 细胞对卡那霉素敏感，但对利福平不敏感。

表 4. MSVP 培养基的组成
成分量（克/升）浓度（毫米）
(NH4) 2 SO 4 0.24 1.81
MgSO 4 · 7H 2 O 0.06 0.24
CaCl 2 · 2H 2 O 0.06 0.41
KH 2 PO 4 0.02 0.15
Na 2 HPO 4 0.03 0.14
肝素 2.383 10.00
用 0.1 N NaOH 将 pH 值调节至 7.0，用超纯水填充至 1 L，然后高压灭菌
成分量（毫升/升）浓度（毫米）
10 毫米亚铁4 1.00 0.01
20%丙酮酸钠 5.00 9.09
维生素原液（见表5） 1.00 -
通过过滤对这些溶液进行灭菌并在使用前添加

表 5. 维生素储备液的组成
成分量（毫克/升）浓度（毫米）工作浓度 ( nM )
生物素 20.00 0.04 0.04
叶酸 20.00 0.05 0 .05
硫胺素· HCl 50.00 0.15 0.15
D-(+)-泛酸钙 50.00 0.10 0.10
维生素B12 1.00 0.74 (纳米) 0.74 (下午)
核黄素 50.00 0.13 0.13
烟酸 50.00 0.41 0.41
盐酸吡哆醇 100.00 0.49 0.49
对氨基苯甲酸 50.00 0.36 0.36
过滤灭菌，使用前添加

2. LB培养基
将 20 克 LB肉汤溶解在 1，000 mL 蒸馏水中，并在 121 °C下高压灭菌15 分钟。对于LB板，添加 1.5% 的琼脂。高压灭菌后，根据需要加入 50 μ g /mL 的硫酸卡那霉素和氨苄西林钠盐。

3. SOC介质
在蒸馏水中溶解 20 克胰蛋白胨、5 克酵母提取物、0.5 克氯化钠和 0.186 克氯化钾，用 5 N NaOH 溶液将pH值调节至 7.0，并用蒸馏水填充至 1，000 mL。在 121 °C下高压灭菌15 分钟后，加入 10 mL 的 1 M MgSO 4和 1 M MgCl 2溶液（见配方 5）和 20 mL 的 1 M 葡萄糖溶液（见配方 6）。

4. 注意培养基
溶解8克营养肉汤在 1,000 mL 蒸馏水中，在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟。对于NB板，添加 1. 5%的琼脂。

5. 1 M MgSO 4和1 M MgCl 2溶液
将 24.65 克 MgSO 4 · 7H 2 O 和 9.52 克 MgCl 2溶解在 100 mL 蒸馏水中，并在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟。

6. 1 M 葡萄糖溶液
D-葡萄糖溶解在 100 mL 的蒸馏水中，并使用 0.22 μ m注射器过滤器进行消毒。

7. NaCl 溶液 (0.9%, 5 M)
将 0.052 或 29.22 g NaCl 溶解在超纯水中，将体积调整至 100 mL，并分别在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟。

8. 缓冲液
加入0.61 g Tris-HCl (10 mM) 和 0.23 g EDTA-4Na (1 mM)，用盐酸 (HCl) 调节 pH 至 8.0，用超纯水调节体积至 500 mL，并在 121 下高压灭菌°C 15 分钟。

9. 十缓冲区
混合 5 mL 的 1 M Tris-HCl 缓冲液（ pH 8.0 ）、1 mL 的 0. 5 M EDTA-4Na（ pH 8.0 ）、10 ml 的 5 M NaCl 和 484 mL 的超纯水，然后121 °C 高压灭菌 15 分钟。

10. 10% SDS 溶液
将 10 克 SDS 溶解在超纯水中，并将体积调整为 100 mL。

11. CTAB/氯化钠溶液
将 10 克 CTAB 和 4.09 克 NaCl (0.7 M) 溶解在超纯水中，将体积调整至 100 mL，并在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟。

12. 3 M醋酸钠 ( CH 3 COONa ) 溶液
取 40.82 g CH 3 COONa · 3H 2 O 溶于超纯水中，定容至 100 mL，121 °C 高压灭菌 15 min。

13. 50 × TAE 缓冲液
将 242 克 Tris 和 22.6 克EDTA-4Na 溶解在含有 57.1 mL 乙酸的超纯水中，并将体积调整到 1，000 mL。

14. 2 × TSS解决方案
将 4 g PEG8000、0.49 g MgSO 4 · 7H 2 O 和 4 mL 甘油溶解在 LB 培养基中（参见配方 2），将体积调整至 20 mL，并在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟。

15. TSS解决方案
将 25 mL 灭菌 LB 培养基（参见配方 2）和 20 mL 2 × TSS 溶液（参见配方 14）与 5 mL DMSO 混合。

16. 50%甘油溶液
将 50 mL 甘油与 50 mL 超纯水混合，在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟。

17. 利福平溶液
将 50 mg 利福平与 1 mL DMSO混合，并在 4°C 下储存。

18. 卡那霉素溶液
将 50 毫克卡那霉素硫酸盐与 1 毫升超纯水混合，并在 4°C 下储存。

19. 氨苄青霉素溶液
将 50 毫克的氨苄西林钠盐与 1 毫升的超纯水混合，并在 4°C 下储存。

致谢

我们承认 NBRP- E。 NIG的大肠杆菌大肠杆菌菌株 SN1187。我们也感谢博士。 Tamaki H. 和 Morinaga K. (AIST) 提供了pSUP5011质粒。这项研究得到了日本科学技术厅 (JPMJER1502, JPMJMI21G8) 的财政支持和普利司通公司的奖学金捐赠。

利益争夺

作者声明，他们没有已知的可能影响本文报告的工作的竞争经济利益或个人关系。

伦理

本研究经筑波大学安全处理改性活生物体委员会批准，并根据该委员会的指导方针进行。

参考

Bocioaga , D., El Gheriany , IA, Lion, LW, Ghiorse , WC, Shuler, ML 和 Hay, AG (2014)。模型锰氧化变形菌遗传系统的开发，Leptothrix discophora SS1。微生物学（阅读） 160（第 11 部分）：2396-2405。
Copeland, A., Lucas, S., Lapidus, A., Glavina del Rio, T., Dalin , E., Tice, H., Bruce, D., Goodwin, L., Pitluck , S., Chertkov , O ., 等。 (2008)。 Leptothrix的完整序列乔氏菌SP-6。提交到 EMBL/GenBank/DDBJ 数据库。
Emerson, D. 和Ghiorse , WC (1992)。 Leptothrix discophora 鞘形成菌株的分离、培养维护和分类以及与鞘相关的锰氧化活性的表征。 Appl Environ Microbiol 58(12)：4001-4010。
Ferrières , L., Hémery , G., Nham , T., Guérout , A.-M., Mazel, D., Beloin, C., Ghigo, J.-M. （2010）。无声的恶作剧：噬菌体 Mu 插入污染了大肠杆菌随机诱变的产物，使用由广泛宿主范围 RP4 结合机制动员的自杀性转座子递送质粒进行。 J Bacteriol 192(24)：6418-6427。
Furutani , M.、Suzuki, T.、Ishihara, H.、Hashimoto, H.、 Kunoh , H. 和 Takada, J. (2011)。细菌糖原纤维的初始组合和元素沉积在培养的Leptothrix sp中形成未成熟的鞘。菌株 OUMS1。矿物质1(1)：157-166。
Hudspeth, DS 和 Vary, PS (1992)。巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的 spoVG 序列。生物化学生物物理学报1130(2)：229-231。
Kunoh , T.、 Kunoh , H. 和 Takada, J. (2015a)。铁氧化细菌Leptothrix产生的氧化铁复合物的生物合成及其功能的工业应用前景展望。 J微生物生物化学技术7(6)：419-426。
Kunoh , T.、Suzuki, T.、 Shiraishi , T.、 Kunoh , H. 和 Takada, J. (2015b)。用超纯水处理Leptothrix细胞会对它们的生存能力构成威胁。生物学（巴塞尔） 4(1)：50-66。
Kunoh , T.、Morinaga, K.、Sugimoto, S.、Miyazaki, S.、 Toyofuku , M.、Iwasaki, K.、Nomura, N. 和 Utada, AS (2020)。多功能纳米纤维附属物介导Leptothrix cholodnii的附着、丝化和丝状适应性。 ACS 纳米14(5)：5288-5297。
Kunoh , T.、Yamamoto, T.、Sugimoto, S.、Ono, E.、Nomura, N. 和 Utada, AS (2021)。 Leptothrix cholodnii细胞对营养限制的反应。前微生物学12, 691563。
Kunoh , T.、Yamamoto, T.、Prasad, M.、Ono, E.、Li, X.、Sugimoto, S.、Iida, E.、Obana, N.、Takeda, M. 、Nomura, N. 和宇多田 (2022)。丝状细菌Leptothrix的多孔薄膜形成。 Appl Environ Microbiol 88(23)：e0134122。
Nozaki, S. 和 Niki, H. (2019)。核酸外切酶 III (XthA) 强制大肠杆菌体内 DNA 克隆以产生粘性末端。细菌学杂志201(5)： e00660-18。
斯普林 (2006)。 Leptothrix属和Sphaerotilus属在：Dworkin，M.， Falkow ，S.，Rosenberg，E.，Schleifer，KH 和Stackebrandt ，E.（编辑）。原核生物（第758–777页）。纽约，施普林格。
van der Waarde , J.、 Krooneman , J.、 Geurkink , B.、van der Werf, A.、 Eikelboom , D.、 Beimfohr , C.、 Snaidr , J.、 Levantesi , C. 和Tandoi , V.（2002 年） ).工业废水处理厂膨胀污泥的分子监测。水科学技术46(1-2): 551-558。
吉原 H. (2002)。鉴定鞘形成所必需的基因细线虫霍洛尼。横滨国立大学工学研究科硕士论文。