材料和试剂
材料
1. 1.5 mL管（ Axygen ，目录号：MCT-150-C）
2. 0.2 mL PCR管（ Axygen ，目录号：PCR-02-CP）
3. 10 和 100 μL移液器（Eppendorf，目录号：3120000224 和 3120000828）
4. 10 和 100微升微量移液器（ Ax ygen ，目录号：TGL-10FT-17-R和 TF-100 ）
5. 培养皿（广东环凯，目录号： 20221700）
6. 接种环（广东环凯，目录号： 00416571）

菌株

1. 蜡样芽孢杆菌 ATCC 14579 （ATCC，目录号：ATCC 14579）
2. 苏云金芽孢杆菌ATCC 10792（ATCC，目录号：ATCC 10792）
3. 枯草芽孢杆菌 6633 （ATCC，目录号： ATCC 6633)
4. 单核细胞增生李斯特氏菌ATCC 19115（ATCC，目录号：ATCC 19115）

试剂

1. 营养琼脂平板（广东环凯，目录号：1024089）
2. Taq DNA 聚合酶（Thermo Fisher Scientific，目录号：10966018）
3. 标记 D，100 – 2,000 bp （ Sangon Biotech，目录号：B600335-0050）
4. GoldView TM （ Coolaber ，目录号：GD001-1mL * 5）
5. 50 × TAE 缓冲液（Sango Biotech，目录号：B548101-0500）

设备

1. 培养箱（上海民权仪器，型号：LAB-0001-0004-SHMQ）
2. 台式离心机（Eppendorf，型号：5415D）
3. 超声波清洗机（LANGEE，型号：UC-9120）
4. 热循环仪（Bio-Rad，型号： C1000 Touch）
5. 电泳成像系统（Bio-Rad，型号： GelDoc XR Biorad ）
6. 分光光度计（ Thermo Fisher，型号： NanoDrop TM One Microvolume UV-Vis ）
7. 高压灭菌器（ ZEALWAY，型号： GR60DA）

软件

1. 图像实验室（Bio-Rad）

程序

1. °C 、200 rpm 过夜（大约 8-12小时）下培养在甘油中保存的菌株（在材料中列出）。
2. μL接种环蘸取少量过夜培养物，并在营养琼脂板上轻轻划线。然后，在 37 °C下培养板过夜。
3. 将单个菌落悬浮到1.5 mL管中的 30 μL ddH 2 O中。
注： B. cereus ATCC 14579、 B. thuringiensis ATCC 10792 、B. subtilis的菌落大小 ATCC 6633和L. monocytogenes ATCC 19115在图1和表1中推荐，DNA质量列在表2中。

图 1.蜡样芽孢杆菌(A)、苏云金芽孢杆菌(B) 、 B. subtilis (C) 和L. monocytogenes (D)在培养皿上形成的菌落。比例尺代表 10 毫米。
表 1.蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、 B. subtilis和L. monocytogenes
微生物菌落大小
蜡样芽孢杆菌ATCC 14579 2 – 4毫米
苏云金芽孢杆菌ATCC 10792 1 – 2毫米
枯草芽孢杆菌ATCC 6633 1 – 3毫米
单核细胞增生李斯特氏菌ATCC 19115 0.2–0.5毫米

4. 在室温下以 40 kHz 和 120 W 超声处理细菌悬浮液 5 分钟，然后在室温下以 10,000 × g离心1 分钟。
注意：无需在脉冲之间设置暂停。
5. 小心地将上层水相转移到新的 1.5 mL 管中，不要干扰颗粒。
6. 使用 1 μL上清液作为 DNA 模板通过 PCR测试 DNA 样品。 PCR 引物列于表 3。Taq DNA 聚合酶是添加和 PCR参数如下：初始变性：95 ℃ ，3分钟；变性：95 ℃ ，30秒；退火：55 ℃ ，30秒；延伸：72 ℃ ，1分钟；最终延伸：72 °C ，10 分钟；循环次数：25×。在 1.2% 琼脂糖凝胶（在 1 × TAE稀释剂中）电泳后，所有扩增子在紫外光下用GoldView TM染色可视化。结果如图 2 所示。
注意：如果增加 PCR 反应周期，条带会更亮。

图2 。蜡样芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌， B. subtilis和L. monocytogenes DNA 通过电泳分析。泳道 M：100 – 2,000 bp DNA 阶梯（标记 D）。 B. c：蜡样芽孢杆菌； B. t：苏云金芽孢杆菌； B. s：枯草芽孢杆菌； L. m：单核细胞增多性李斯特菌。 DNA：超声提取DNA 5分钟。阳性对照：使用商业试剂盒提取的 DNA（ 1 μL DNA 模板）。 CK：检查对照（无模板）。

表 2. DNA 样本的质量通过分光光度法分析
微生物核酸（ng / μL ） A 260 /A 280 A 260 /A 230
蜡样芽孢杆菌ATCC 14579 20.343 1.517 0.641
苏云金芽孢杆菌ATCC 10792 19.43 1.5 0.605
枯草芽孢杆菌ATCC 6633 21.935 1.303 0.634
单核细胞增生李斯特氏菌ATCC 19115 6.321 1.808 1.018

分别用于蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特菌和枯草芽孢杆菌的引物序列
微生物目标基因引物序列（5 ′至 3 ′ ）
蜡样芽孢杆菌ATCC 14579 gmk F-TTAAGTGAGGAAGGGTAGG
R-AATGTTCACCAACCAAA
苏云金芽孢杆菌ATCC 10792 pycA F-GTGAAAGCAAGAACACAAGC
R-ATATGTTTTTTATCCAACTGCG
枯草芽孢杆菌ATCC 6633 SigB F-ATGACACAACCACAAAAACTACGA公司
R-TTACATTAACTCCATCGAGGGATCT
单核细胞增生李斯特氏菌ATCC 19115 prfA F-GTCAAAACATACGCTCTTATC公司
R-ACATAATCAGTCCAAGTAGATGC

致谢

该协议改编自以前的工作（Chen et al., 2022; Li et al., 2022）。本研究得到广东省基础与应用基础研究重大专项（2020B0301030005）、广东省重点实验室（2020B121201009）和广东省科学院创新驱动发展能力建设专项（2020GDASYL-20200301002）的资助。

利益争夺

不存在利益冲突或利益冲突。

参考

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