材料和试剂
1. Eppendorf 1.5 mL 管（Thermo Fisher Scientific，目录号：05-408-129）
2. 1 M HEPES，pH 7.5（Thermo Fisher，目录号：15630080）
3. 5 M NaCl（ Thermo Fisher Scientific，目录号：00622643）
4. 500 mM EDTA（ Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9260G）
5. 十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：8170341000）
6. 羟胺-HCl（ Thermo Fisher Scientific，目录号：270100010）
7. Pierce 蛋白酶抑制剂片剂，不含 EDTA（Thermo Fisher Scientific，目录号：A32955）
8. 磷酸酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：J63907.AA）
9. HDSF（圣克鲁斯，目录号：sc-221708A）
10. 甲硫代磺酸甲酯（MMTS）（Sigma-Aldrich，目录号：2949920）
11. 100% 丙酮（Thermo Fisher Scientific，目录号：186947）
12. 2-巯基乙醇（β-ME）（ Calbiochem ，目录号：UN2966）
13. 1 M 二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
14. 琼脂糖 S3 高容量酰基-RAC 捕获树脂（ Nanocs ，目录号：AR-SS-2）
15. 0.5 M Tris-HCl，pH 6.8（ Thermo Fisher Scientific，目录号：J63735.K2）
16. 100% 甘油（Thermo Fisher Scientific，目录号：15548224）
17. 溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B5525）
18. 3 kD截止离心过滤器（Millipore，目录号：Z677094）
19. 三氯乙酸（TCA）（ Thermo Fisher Scientific，目录号：184151000）
20. 考马斯染色（Bio-Rad，目录号：1610786）
21. Triton X-100（ Sigma-Aldrich，目录号：9036195）
22. 氢氧化钠（NaOH）（ Thermo Fisher Scientific，目录号：A16037.36）
23. 裂解缓冲液碱（见配方）
24. 裂解缓冲液——工作溶液（参见配方）
25. 结合缓冲液（见配方）
26. 阻塞缓冲区（参见食谱）
27. 5 × Laemmli样品缓冲液（参见食谱）
28. 1 × Laemmli样品缓冲液（参见食谱）
29. 1 M 二硫苏糖醇 (DTT)（参见食谱）
30. 100% TCA 备料（w/v）（见食谱）
31. Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液（ Thermo Fisher Scientific，目录号：LC26755）（参见食谱）
32. 70% 丙酮（见食谱）
33. 2 M 羟胺（见食谱）
34. 2 M 氯化钠（见食谱）
35. 5 M 氢氧化钠（见食谱）
36. 10% Triton X-100（见食谱）

设备
1. Sonicator （Fisher， Microson超声波细胞破碎仪，型号：CL-18）
2. 热块（Thermo Fisher Scientific，目录号：11715125D）
3. Vortex（科学工业，型号：G-560）
4. 离心机，（Eppendorf，目录号：0011627）
5. Nutator（ Thermo Fisher Scientific，型号：88881001）

软件

1. Excel 2016（微软）
2. GraphPad 棱镜（9.0 版）
3. Adobe 插画家 2023
4. CSS-Palm 4.0 – 棕榈酰化位点预测工具(Ren et al., 2008)

程序
A. 组织裂解
1. 在 1.5 mL Eppendorf 管中取四个新鲜收集或快速冷冻的小鼠视网膜，并添加 300 μ L裂解缓冲液（参见食谱） (Murphy and Kolandaivelu, 2016)。
2. – 15 psi 的压力对组织进行三次超声处理，每次四秒，两次脉冲之间在冰上孵育 30 秒。
3. 要溶解蛋白质，请添加 33 μL 的 10% Triton X-100（最终浓度为 1% Triton X-100），并在 4°C 下使样品章动 15分钟。
4. x g和 4 °C下离心3 分钟去除细胞和核碎片，并将上清液转移到新鲜的 1.5 mL 管中。

B. 阻断游离硫醇基团

1. 准备包含 MMTS 的阻塞缓冲区（每 300 µL 阻塞缓冲区添加 4 µL MMTS）。
2. 将步骤 A4 中的上清液分成 100 μL 等分试样（在 1.5 mL 管中），并添加三卷含有 MMTS（300 μL）的阻塞缓冲液。
注意：每次使用前短暂涡旋反应混合物以保持溶液均匀。
3. °C 的热块中孵育样品16 分钟，每 2 分钟使用 5 秒涡流。

C. 蛋白质沉淀

1. 在每个管中加入 1.1 mL 的 100% 冰冷丙酮，倒置三次，并在 -20 °C下孵育20 分钟。
2. x g和 4 °C下将样品离心15 分钟以沉淀蛋白质。
3. 丢弃上清液，用冰冷的 70% 丙酮轻轻涡旋洗涤蛋白质沉淀四次，然后在 4 °C下以最快速度离心 1 分钟。
注意：在第一次洗涤期间去除沉淀物以去除沉淀物和 Eppendorf 管壁之间残留的 MMTS。

D. 用羟胺 (HA) 裂解硫酯键并使用琼脂糖 S3 高容量酰基 RAC 树脂捕获棕榈酰化蛋白质

1. 在室温 (RT) 下将蛋白质颗粒风干约 30 分钟，以去除残留的丙酮。
注意：不要过度干燥蛋白质沉淀以避免重悬问题。
2. 通过短暂的超声处理将每个颗粒重新悬浮在 200 µL 的结合缓冲液中，并将样品合并到一个试管中（例如，200 µL ×三个试管 = 600 µL）。
3. 将 40 µL 琼脂糖 S3 高容量树脂移入标记为 Elute + HA (E + HA) 和 Elute - HA (E -HA) 的两个干净的 1.5 mL Eppendorf 管中的每一个中，并用 500 µL 结合洗涤以平衡树脂缓冲一次。让珠子通过重力沉淀并丢弃洗涤缓冲液。
注意：确保树脂在使用前均匀悬浮。
4. 移液器将 75 μL 的汇集样品移至标记为总计的干净 1.5 mL Eppendorf 管中。
5. 将 250 µL 样品添加到每个 E +HA 和 E -HA 管中（如果样品体积更多，相应地添加额外的珠子并为 +HA 和 -HA 分配相等的样品体积；如果样品体积较少，则将其制成使用洗脱缓冲液最多 600 µL）。
6. 在 E + HA 管中加入 45 μL 的 2 M 羟胺，并在 E -HA 管中加入 45 μL 的 2 M 氯化钠。
7. 章动所有样品，包括 RT 的总分数样品 2 小时。
8. 让珠子在重力作用下落下，并从每个 E +HA 和 E-HA 管中收集 75 µL 上清液，放入标记为未结合 +HA (UB +HA) 和未结合 -HA (UB -HA) 的干净 1.5 mL Eppendorf 管中，分别。

E. 结合蛋白的洗脱

1. 通过添加 1 mL 的结合缓冲液并轻轻反转管约六次来清洗 E + HA 和 E -HA 珠子。让珠子在重力作用下掉落并丢弃上清液。再重复洗涤步骤三次。
2. 将含有 10 mM DTT 的 75 μL 结合缓冲液添加到每个 E + HA 和 E -HA 管中，并在 RT 孵育 10 分钟以洗脱结合的蛋白质。
注意：要制作上述洗脱缓冲液，请在 990 µL 结合缓冲液中加入 10 µL 1M DTT，并通过涡旋充分混合。根据需要扩大规模。
3. 重复洗脱步骤 2-3 次并汇集洗脱液。
注意：大部分 (90%) 的蛋白质在第一部分（即洗脱 1）中被洗脱。用已知的棕榈酰化蛋白（例如，视紫红质、Goα 和 PRCD）通过蛋白质印迹法检查每个洗脱组分。如果第二次和第三次洗脱显示大量已知的棕榈酰化蛋白质，则合并洗脱液并使用 TCA 沉淀或合适的Microcon截止过滤器浓缩样品。
4. 要浓缩样品，将合并的洗脱液转移至 Pierce Concentrator 3K MWCO 过滤器，并在室温下以6,000–9,000 × g离心 30 分钟。
笔记：
a. °C下储存约一个月，直至进一步处理。
b. 可选：可以使用 TCA 沉淀进一步浓缩洗脱液。请参阅下面的协议。

TCA沉淀
a. 添加一卷 TCA [50 µL 100% TCA 库存准备 (w/v)] 到四卷蛋白质样品（200 µL 洗脱蛋白质样品），并在冰上孵育管 15 分钟。
b. × g和 4 °C下离心管 5分钟沉淀蛋白质。
c. 小心地去除上清液，使蛋白质颗粒完好无损。
d. 用 200 µL 冰冷的丙酮清洗沉淀物，并以 18,500 × g和 4离心管摄氏度 5分钟。丢弃上清液并重复洗涤步骤。
e. 将颗粒风干 5-10 分钟以去除残留的丙酮。

F. 通过 SDS-PAGE/ LC-MS/MS 鉴定棕榈酰化蛋白

1. 要进行免疫印迹，添加 18.75 µL 的 5 × Laemmli样品缓冲液含有终浓度为 5% 2-巯基乙醇 (β-ME) 和 10 mM DTT 至 75 µL 总样品和未结合样品。
2. 添加 70 µL 的 1 × 莱姆利样品缓冲液含有 5% β-ME 和 10 mM DTT 到 +HA 和 -HA 洗脱组分。
3. 让管子在 RT 下静置 20 分钟，每 5 分钟间歇混合一次。
4. 将样品在水浴中的浮动架上煮沸 5 分钟，然后以 6,000 × g离心在 RT 下 30 秒。
5. 要通过质谱法检测棕榈酰化蛋白质，请在 80 V 的 12% SDS-PAGE 凝胶上运行样品 30 分钟（图 1 和 2）。
2 O彻底清洁电泳设备并使用新鲜的 SDS-PAGE 缓冲液。
6. 将凝胶转移到干净的玻璃托盘上并进行考马斯染色（图 3A）。
7. 过夜脱色后，切割蛋白质条带以进行凝胶内消化（参见图 3A）并处理样品以进行 LC-MS/MS 分析(Edmonds et al., 2017)
8. 为了进一步验证，执行免疫印迹并用针对感兴趣的蛋白质的抗体探测印迹，以识别/显示它们的棕榈酰化状态（图 1 和 2）。

图1.通过已知棕榈酰化蛋白质的免疫印迹验证酰基树脂辅助捕获 (Acyl-RAC)。使用硫丙基琼脂糖凝胶 6B 珠纯化和检测野生型小鼠视网膜中已知的棕榈酰化蛋白 Goα（上图）和视紫红质（中图）。磷酸二酯酶 6 (PDE6 α ) 是一种异戊二烯化蛋白质，未被棕榈酰化，用作对照（下图）。 HA = 羟胺，T = 总量，U = 未结合，E = 洗脱。在 HA (+ HA) 存在下的洗脱代表棕榈酰化蛋白质部分的分离。在没有 HA (-HA) 的情况下洗脱用作内部控制来验证纯化方案。

图2. Western blots 展示了使用琼脂糖 S3 微珠纯化棕榈酰化蛋白。 A.使用琼脂糖 S3 高容量珠从视网膜提取物中分离的棕榈酰化蛋白质通过 4% – 20% SDS-PAGE 分离，并用已知的棕榈酰化蛋白质进行免疫印迹，即进行性杆锥变性（PRCD，上图）和 Goα（中图） ). β-微管蛋白（下图）未被棕榈酰化，用作对照。 B. Western blots 显示使用本 Acyl-RAC 方案从其他组织（脑和肺）中有效分离棕榈酰化蛋白。使用 Goα（阳性对照，上图）和 β-微管蛋白（阴性对照，下图）检测印迹。

图3.通过 LC-MS/MS 鉴定的视网膜棕榈酰蛋白。 A. SDS-PAGE 后进行考马斯蓝染色：从-HA（左泳道，对照）和+HA（右泳道）珠子的洗脱物在 10% 聚丙烯酰胺凝胶上分离，并在室温下用考马斯蓝染色 1 小时，然后过夜用高压灭菌的 Milli-Q 水脱色以显示蛋白质条带。蛋白质条带被切割（如虚线所示）用干净的刀片进行凝胶内消化，样品被送到哈佛质谱核心进行 LC-MS/MS 鉴定视网膜棕榈酰蛋白。 B.显示在-HA 和+HA 组分中检测到的独特蛋白质总数的维恩图。重叠表示在两个级分中检测到的非特异性蛋白质。

数据分析

使用 Microsoft Excel，我们确定了仅存在于 +HA 部分中的潜在棕榈酰化蛋白质。在 +HA 和 -HA 组分中检测到的蛋白质被认为是非特异性蛋白质，并被排除在分析之外。为了验证该协议，我们根据与已发表文献的比较，展示了先前已知的棕榈酰化蛋白质（表 1）和未表征的棕榈酰化蛋白质（表 2）的列表。 CSS Palm 4.0 – 棕榈酰化位点预测软件用于预测表中列出的所有蛋白质的潜在棕榈酰化位点，具有高/中置信度阈值(Ren et al., 2008).

表1. Acyl-RAC 捕获的已知棕榈酰化蛋白质。的列表通过 LC-MS/MS 在 +HA 级分中检测到的视网膜棕榈酰化蛋白，并将其与已发表的文献进行比较以确认棕榈酰化状态

表2. Acyl-RAC 捕获的潜在棕榈酰化视网膜蛋白。的列表通过 LC-MS/MS 在 +HA 级分中检测到未表征的视网膜棕榈酰化蛋白。

食谱

1. 裂解缓冲液基
25 mM HEPES（1.25 mL 的 1 M HEPES，pH 7.5）
25 mM NaCl（250 µL 5 M NaCl）
1 毫米 EDTA（500 毫米 EDTA 的 100 µL）
使用 Milli-Q 水最多 50 mL
存放于室温

2. 裂解缓冲液 - 工作溶液
10 mL 裂解缓冲液基
1 片 Pierce 蛋白酶抑制剂迷你片，不含 EDTA
10 µL 磷酸酶抑制剂
10 µL HDSF（去棕榈酰化抑制剂）
储存在-20 °C

3. 结合缓冲液
100 mM HEPES（5 mL 的 1 M HEPES，pH 7.5）
1 毫米 EDTA（500 毫米 EDTA 的 100 µL）
1% SDS（5 毫升 10% SDS 溶液）
使用反渗透 (RO) 水最多 50 mL
存放于室温

4. 阻塞缓冲区
100 mM HEPES（5 mL 的 1 M HEPES，pH 7.5）
1 毫米 EDTA（500 毫米 EDTA 的 100 µL）
2.5% SDS（12.5 mL 的 10% SDS 溶液）
使用 RO 水最多 50 mL
存放于室温

5. 5 × Laemmli样品缓冲液
3.0 克 SDS
15 mL 0.5 M Tris-HCl，pH 6.8
15 毫升 100% 甘油
0.02%溴酚蓝
每管分装 950 µL 并储存在 -20 °C
使用前，将 50 μL 的β-ME 和 10 mM DTT（10 μL 的 1 M DTT）添加到管和涡流中，以彻底混合。

6. 1 × Laemmli样品缓冲液
稀释 5 × Laemmli样品缓冲液（含 β-ME 和 DTT）和高压灭菌蒸馏水/Milli-Q 水。涡旋以彻底混合。储存在 -20 °C 。

7. 1 M 二硫苏糖醇 (DTT)
154.2 毫克 DTT
1 mL 高压灭菌 Milli-Q 水
分装并储存在 -20 °C

8. 100% TCA 备料（ w/v）
将 27.5 克 TCA 溶解在 20 mL Milli-Q 水中。
溶解后，用 Milli-Q 水补足至 50 mL
储存在 4 °C

9. 1 × SDS-PAGE 电泳缓冲液
500 mL 10 × Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液
4500 mL 反渗透水
彻底混合并储存在 RT

10. 70% 丙酮
70 mL 100% 丙酮 + 30 mL 高压灭菌 Milli-Q 水
存放于室温

11. 2 M 羟胺（为每次测定新鲜准备）
69.49 毫克羟胺-HCl
用 300 µL 高压灭菌的 Milli-Q 水溶解
用 NaOH 调节至 pH 7.5
用高压灭菌的 Milli-Q 水补足 500 µL

12. 2M 氯化钠
200 µL 5 M NaCl + 300 µL 高压灭菌 Milli-Q 水
存放于室温

13. 5M 氢氧化钠
将 10 g NaOH 颗粒溶解在 40 mL 高压灭菌的 Milli-Q 水中，然后冷却
使最终体积达到 50 mL
RT 储存在腐蚀性柜中

14. 10% 海卫一-X 100
将 5 mL Triton X-100 溶解在 45 mL 高压灭菌的 Milli-Q 水中
彻底混合并储存在 4 °C

致谢

这项研究得到了美国国立卫生研究院、资助号 RO1EY028959 (SK) 和西弗吉尼亚大学桥梁基金 (SK) 的支持。此外，我们感谢 Ramamurthy 博士在开发此 acyl-RAC 协议时提供的宝贵建议和支持。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

涉及动物的实验程序是按照美国国立卫生研究院 (NIH) 指南进行的。该协议得到了西弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准。

参考

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Burns, ME 和Arshavsky , VY (2005)。超越光子计数：脊椎动物视觉转导的试验和趋势。神经元 48 (3): 387-401。
Edmonds, MJ、Geary, B.、Doherty, MK 和 Morgan, A.（2017 年）。使用酰基生物素交换和酰基树脂辅助捕获方法分析脑棕榈酰蛋白质组。科学代表7 (1)：1-13。
Forrester, MT、Hess, DT、Thompson, JW、 Hultman , R.、Moseley, MA、 Stamler , JS 和 Casey, PJ (2011)。通过树脂辅助捕获对蛋白质 S-酰化进行位点特异性分析。脂质研究杂志 52 (2): 393。
Kolandaivelu , S.、Huang, J.、Hurley, JB 和 Ramamurthy, V. (2009)。 AIPL1，一种与儿童失明相关的蛋白质，与杆状磷酸二酯酶 (PDE6) 的 α 亚基相互作用并且对于其正确组装是必不可少的。生物化学杂志 284 (45)：30853-30861。
Maeda, A.、Okano, K.、Park、PSH、 Lem , J.、Crouch, RK、Maeda, T. 和Palczewski , K. (2010)。棕榈酰化可稳定未结合的杆状视蛋白。 Proc Natl Acad Sci USA 107 (18)：8428-8433。
Murphy, J. 和Kolandaivelu , S. (2016)。进行性杆锥变性 (PRCD) 的棕榈酰化调节蛋白质稳定性和定位。生物化学杂志 291 (44)：23036-23046。
Myers, B., Sechrest , ER, Hamner , G., Motipally , SI, Murphy, J. 和Kolandaivelu , S. (2022)。光感受器盘特异性蛋白 PRCD 中的 R17C 突变会导致额外的脂质化，从而改变蛋白质稳定性和亚细胞定位。国际分子科学杂志 23 (18): 10802。
Ren, J.、Wen, L.、Gao, X.、Jin, C.、Xue, Y. 和 Yao, X. (2008)。 CSS-Palm 2.0：用于棕榈酰化位点预测的更新软件。蛋白质工程设计 21 (11)：639-644。
Yang, Z. 和Wensels ，TG (1992)。培养的视网膜中视杆细胞外段 G 蛋白转导蛋白的 N-豆蔻酰化。生物化学杂志 267 (32)：23197-23201。