材料和试剂
1. T-25 或 T-75 烧瓶（ Thermo Fisher，目录号：156499 或 156367）
2. 15 mL 锥形离心管（Thermo Fisher，目录号：14-959-53A）
3. 50 mL 锥形离心管（Thermo Fisher，目录号：14-959-49A）
4. 非组织培养处理的 24 孔板（Sigma，目录号：CLS3738）
5. 组织培养处理过的 24 孔或 6 孔板（ StemCell ，目录号：38017 或 38016）
6. 保鲜膜（GLAD Flex'N Seal 食品储存塑料袋）
7. 1.5 mL 聚丙烯微量离心管（Fisher Scientific，目录号：07-000-243）
8. 5 mL 聚丙烯弹簧锁微量离心管（ Fisher Scientific，目录号：14-568-101 ）
9. 5 mL 一次性移液器（VWR，目录号：76201-710）
10. VWR 单个管（FACS 管）（VWR，目录号：83009678）
11. 1 mL注射器（Covidien，目录号：1180125158）
12. 酒精准备垫（ Dukal ，目录号：853）
13. 刀片（VWR，目录号：55411-050）
14. 微血细胞比容毛细管（Thermo Fisher，目录号：22-363-566）
15. 0.22 µm 过滤器（Sigma Millipore，目录号：GSWP04700）
16. NSG 小鼠 (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/ SzJl ) (The Jackson Laboratory, Strain #005557)
17. 细胞系：Raji B 细胞（ATCC，目录号：CCL-86）
18. 人外周血单核细胞 (PBMC)，新鲜（ Zenbio ，#SER-PBMC-200）
19. CD19 CAR 结构：pHR-SP-CD19 ScFv (FMC63) – myc-CD8 Stalk-CD8 (CD28-41BB-CD3) cyto- sfGFP （ Su实验室，质粒 #XSB848）（ Xiao 等人，2022 年）
20. 慢病毒包装质粒（第二代）：pMD2.G 和 psPAX2（ Addgene ，#12259 和 #12260）
21. 聚凝胺（Sigma，目录号：H9268）
22. OKT-3 抗体（Thermo Fisher，目录号：11161D）
23. 重组人 IL-2（ PeproTech ，目录号：200-02）
24. 1 × Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (DPBS)（Thermo Fisher，目录号：10010023）
25. Gibco TM HEPES (1 M)（Thermo Fisher，目录号：15-630-080）
26. 1 mg/mL retronectin （Takara，目录号：T100A/B，DPBS 中的库存溶液）
27. BSA（Sigma，目录号：A7030）
28. AIMV（Thermo Fisher，目录号：12055083）
29. RPMI 1640（Thermo Fisher，目录号：11875093）
30. 人血清（ GemCell ，目录号：100-512）
31. 青霉素 - 链霉素 - 谷氨酰胺（PSG）（Life Tech，目录号：MT30009CI）
32. 热灭活胎牛血清（FBS）（Life Tech，目录号：16140071）
33. PSG（Life Tech，目录号：MT30009CI）
34. EDTA（Thermo Fisher，目录号：15-575-020）
35. 人类TruStain FcX TM （Fc 受体阻断溶液）（ BioLegend ，目录号：4223020）
36. 抗人 CD3 抗体（BD Biosciences，目录号：558117）
37. 抗人 CD8 抗体（ BioLegend ，目录号：344750）
38. 抗人 CD4 抗体（ BioLegend ，目录号：300508）
39. 抗人 CD279（PD-1）抗体（ BioLegend ，目录号：621608）
40. 抗人 CD366（Tim-3）抗体（ BioLegend ，目录号：345012）
41. 抗人 CD223（LAG-3）抗体（ BioLegend ，目录号：345012）
42. 单克隆抗 FMC63 scFv抗体（ ACROBiosystems ，目录号：FM3-Y45）
43. 红细胞裂解缓冲液（Sigma，目录号：R7757-100ML）
44. 超级电脑 eBeads Plus 补偿珠（Thermo Fisher，目录号：01-3333-42）
45. 基质胶（VWR，目录号：47743-716）
46. DPBS/2% BSA（见配方）
47. T 细胞培养基（T 细胞培养基）（参见食谱）
48. Raji B 细胞的细胞培养基（Raji 培养基）（参见食谱）
49. FACS 染色缓冲液（参见配方）

设备
1. 水浴（Thermo Scientific Precision，型号：UX-12150-00）
2. 细胞培养箱，37 °C ，含 5% CO 2 （Thermo Fisher，目录号：51033776）
3. 流式细胞仪分析仪（BD、LSR II 流式细胞仪或 Thermo Fisher、Attune 流式细胞仪）
4. 带有摆动转子和板架的离心机（Thermo Fisher，目录号：75009210）
5. 数字电子卡尺（Fine Science Tools，目录号：30087-00）
6. EasySep TM Magnet（ StemCell ，目录号：18000）
7. 自动细胞计数仪（Thermo Fisher，型号：Countess 3）
软件

1. FlowJo 软件（ BD， https://www.flowjo.com/solutions/flowjo ）
2. Prism 软件（Dotmatics 的 GraphPad， https://www.graphpad.com/ ）

程序
A. CD19 CAR-T细胞的产生

1. 按照食谱准备 T 细胞培养基。将介质储存在 4°C，并在使用前将其加热至 37°C。
注意： T 细胞培养基应在两个月内使用。
2. （第 1 天）计数捐助者 PBMC 数量。在含有 300 IU/mL IL2 和 50 ng/mL OKT-3 的 2 mL T 细胞介质中，每孔板 7.5 × 10 6个细胞。
注意：OKT-3 抗体可以替换为Dynabeads TM人 T 激活剂 CD3/CD28（Thermo Fisher，#11161D 或等效物）。根据用户手册准备珠子。
3. （第 2 天）涂层非组织培养物——在每孔 1.5 mL DPBS 中用终浓度为 20 µg/mL 的retronectin处理 6 孔板。用保鲜膜包裹盘子，在 4°C 下孵育盘子过夜。
注意： Retronectin孵育可在 5% CO 2培养箱中于 37 °C 下进行 4-6 小时。通常，每个 CAR-T 转导将使用两个 6 孔板（12 孔，18 mL r etronectin缓冲液）。
4. （第 3 天）将离心机预热至 32°C。
5. 使用 5 mL 一次性移液器从 6 孔板中去除retronectin溶液，然后在室温下用 2 mL 的 DPBS/2% BSA 封闭板 30 分钟。
6. 在冰上解冻慢病毒。
7. 用 2 mL 的 DPBS 清洗每个孔，并将 DPBS 留在孔中 retronectin包被的板。
8. 根据 T 细胞数量（0.5-100 万）和感染复数（MOI）（10-50）计算用于转导的慢病毒体积。
根据您的病毒滴度和总量进行调整 (5 – 100)。当用慢病毒转导 T 细胞时，应计算 MOI。一般来说，病毒转导的协议必须针对每种病毒独立优化。呈现的分步说明提供了一个起点。
这是一个例子：
- 要转导的 T 细胞数量：10 6 个细胞
- 病毒滴度：2 × 10 8 TU/mL
- 教学语言：20
例子：
（细胞数/病毒滴度）× MOI = 病毒载体体积
(1 × 10 6 个细胞/2 × 10 8 TU/mL) × 20 = 100 μL
9. 将上述计算量的慢病毒添加到 T 细胞培养基中。然后，从盘子中取出 DPBS 并添加 2 mL/well 的病毒介质。
10. 用保鲜膜包裹盘子，在 32°C 下以 2，000 x g旋转盘子2 小时。
11. 在旋转过程中，收获、清洗和计数要转导的 T 细胞。
注意：建议包括未转导孔的阴性对照和转导孔的阳性对照（例如 GFP）。
12. 当板的离心完成后，去除病毒培养基。
13. 在 T 细胞培养基（300 IU/mL IL-2）中每孔添加 0.5 × 10 6 – 1 × 10 6 个T 细胞，浓度为每孔 0.25 × 10 6 个细胞，含有8 µg/mL 聚凝胺。
14. 包裹板并以 500 x g旋转10 分钟，加速度和制动器设置为 32°C 的最低设置。
15. 轻轻地从离心机中取出盘子，并将其放在培养箱中过夜。
16. （第 4 天）将转导的细胞转移到新的组织培养物上——经过处理的 6 孔板以去除retronectin 。来自经过相同处理的孔的细胞可以以每孔0.5 × 10 6 个细胞的浓度合并到 T-25 或 T-75 烧瓶中。
17. 如果可用，请使用荧光显微镜验证 CAR-GFP 表达（有关代表性数据，请参见图 1）。

图 1. T 细胞群 (A)、GFP 的 CAR 表达 (B) 和抗 FMC63 抗体 (C) 的检测。未转导的 T 细胞和 CD19 CAR-T 细胞在 CD3 +群体上预门控； CD4 +和 CD8 +门控于 CD3 + ； CAR-T 细胞根据 GFP 表达或抗 FMC63 染色进行门控。数据首先发表于Xiao 等人。 (2022 ) 并以修改后的方式呈现。

18. （第 6 天）在转导后三天对 CAR-GFP 表达进行流式细胞术分析（参见程序 B）（代表性数据参见图 1）。
19. 继续每天检查 T 细胞培养。使用自动细胞计数器计算细胞数。当细胞密度达到 1 × 10 6 个细胞/ mL 时分期培养。
注意： 9-12天的扩增期应该足以获得足够的 CAR-T 细胞用于小鼠注射。在用Dynabeads TM刺激后，CD3 的表达会暂时下调，这可能会影响 CAR-T 上 CD3 的染色。

B. CAR-GFP表达的流式细胞术分析

1. 计算转导的 CD19 CAR-T 细胞和未转导的 T 细胞的细胞数。在 4 °C 下离心 50 万个细胞 5 分钟（300 – 400 × g ）并丢弃上清液。
2. 按照步骤 B1 将细胞沉淀重悬于 FACS 染色缓冲液中并离心细胞。然后，将颗粒重新悬浮在 50 μL的 FACS 染色缓冲液中，以达到 1 × 10 7 / mL的最终细胞密度。
3. [可选] 阻断非特异性 Fc 介导的相互作用：用 5 μL人TruStain预孵育细胞染色前，每 100 μL FcX TM在冰上放置 5 – 10 分钟。
4. 向细胞中加入推荐量的荧光染料标记的抗体，并在黑暗中在冰上孵育 30 分钟（例如，2.5 μL抗人 CD3 抗体、2.5 μL抗人 CD8 抗体和 2.5 μL抗人 CD4 100 μL FACS 染色缓冲液中 50 万个细胞的抗体）。
注意：更高的温度和/或更长的孵育时间可能会导致非特异性细胞标记。
在冰上进行的染色需要增加孵育时间。
5. 在每个 1.5 mL Eppendorf 管中加入 1 mL 的 FACS 染色缓冲液。在室温下以 300–400 × g离心样品5 分钟，然后弃去上清液。
6. 在适当体积 (400 – 600 μL ) 的 FACS 染色缓冲液中重悬染色细胞。
7. 准备单色补偿控制并按照手册 ( MAN0019374_UltraComp_eBeads_and_UltraComp_eBeads_Plus_Compensation_Beads_PI ) 设置补偿。
8. 设置补偿后，在流式细胞仪 LSRII 或 Attune 流式细胞仪上获取数据。
注意：细胞必须在染色后 1 小时内进行分析。
9. FlowJo软件分析 T 细胞纯度和 CAR 表达（代表性数据见图 1）。
注意：我们建议使用转导率更高 (~50%) 的 CAR-T 细胞进行体内研究。请增加病毒体积以获得更高的转导率。

C. 体内Raji B 肿瘤杀伤试验

1. 从杰克逊实验室订购 6–7 周大的 NSG 小鼠。小鼠交付后，让它们适应当地设施一周，然后再进行肿瘤细胞注射。
2. 在将它们注射到小鼠体内之前，在Raji 培养基（如食谱）中解冻和培养 Raji B 细胞3-5天。
3. 计算 Raji 细胞数量并在 4°C 下以 300 – 400 x g离心10 分钟。丢弃上清液。
4. 用预冷的 PBS 重悬 Raji 细胞。在 4 °C 下以 300 – 400 × g离心细胞悬液10 分钟并弃去上清液。重复一次。
5. 用预冷的 PBS 重悬 Raji 细胞（每只小鼠 50 μL 中的1 × 10 6 Raji 细胞）并将细胞转移到 1.5 mL Eppendorf 管中。
6. 将细胞与等体积的 Matrigel 混合（Matrigel 储存在 -80 °C 冰箱中。需要在冰上解冻），例如，50 µL 细胞与 50 µL Matrigel。这个过程需要在冰上进行。
7. 将冰上的混合细胞转移到动物设施中进行肿瘤注射。
8. 注射前，沉淀混合细胞并避免气泡。通过 1 mL 注射器取 100 μL 混合物。
9. 进行皮下注射。用酒精准备垫润湿小鼠的右侧，直接将细胞注入小鼠体内。
10. 7 天后，准备 CAR-T 细胞输注。在注射 T 细胞时，肿瘤大小应介于 20 和 100 mm 3之间。
11. 计数 CD19 CAR-T 细胞数并在 4°C 下以 300 – 400 x g离心 C AR-T 细胞10 分钟。丢弃上清液。
12. 用预冷的 PBS 重悬 CD19 CAR-T 细胞并在 300 – 400离心细胞悬液 × g在 4 °C 下保持 10 分钟；然后，丢弃上清液。重复一次。
13. 用预冷的 PBS 重悬 CD19 CAR-T 细胞（每只小鼠在 100 µL 中加入1 × 10 7 个细胞）并将细胞转移到 1.5 ml Eppendorf 管中。
14. 将 100 µL PBS 中的 1 × 10 7 个CD19 CAR-T 细胞静脉内注入荷瘤 NSG 小鼠；对照小鼠将通过尾静脉注射用 100 µL PBS 进行治疗。
15. 每隔一天监测小鼠的体重和肿瘤大小。使用卡尺测量肿瘤大小。肿瘤体积使用以下公式计算：V = ½（长度 × 宽度2 ）（代表性数据见图 2）。

PBS 处理和 CD19 CAR-T 处理的携带 Raji 小鼠的体重 (A)和肿瘤大小 (B)。 (A) CAR-T 细胞输注后测量小鼠体重。 (B) 未处理的 PBS 组（蓝色，7 只小鼠）和 CD19 CAR-Ts 处理组（红色，6 只小鼠）的个体肿瘤生长情况。数据首先发表于Xiao 等人。 (2022 ) 并以修改后的方式呈现。

16. 在 CAR-T 细胞输注后第 7、14 和 21 天，通过刀片和毛细管取尾血以验证 CAR-T 细胞百分比和耗竭状态（参见程序 D）（代表性数据如图 3 和图 4所示） .

图 3。循环中 CAR-T 细胞百分比的代表性数据。在CAR-T输注后第7、14和21天，采集未治疗组和治疗组小鼠的尾静脉血，通过FACS检测CAR-T细胞百分比。循环中 CAR-T 的百分比可用作确定 CAR-T 在体内持久性的参数。数据首先发表于Xiao 等人。 (2022 ) 并以修改后的方式呈现。

图 4。在 CD19 CAR-T 上表达的 T 细胞耗竭标志物的代表性数据。 CAR-T输注后第14天和第21天，采集小鼠尾静脉血，通过流式细胞仪检测PD-1、TIM-3、LAG-3等T细胞衰竭标志物的表达（同型抗体作为染色阴性对照）。数据首先发表于Xiao 等人。 (2022 ) 并以修改后的方式呈现。

17. 当肿瘤大小达到∼ 1,500 mm 3时，使用 CO 2吸入安乐死小鼠。

D. 体内CAR-T 细胞百分比和衰竭状态

1. 在 CAR-T 细胞输注后第 7、14 和 21 天，使用无菌手术刀刀片切割尾巴。夹住不超过 1 毫米的尾巴组织，并通过毛细管轻轻挤奶尾巴来收集血液。
2. 用无菌纱布施加压力来阻止血液流动。
3. 将血液转移到 100 μL 的 PBS 中，该 PBS 在 1.5 mL Eppendorf 管中含有 3 mM EDTA。
4. – 400 × g离心细胞悬液10 分钟并弃去上清液。
5. 在室温下用 0.2 mL 的红细胞裂解缓冲液孵育细胞 5 分钟以去除红细胞。用 1 mL 的 FACS 染色缓冲液和颗粒细胞（300-400×g）在 4°C 下加满管子5分钟。
6. 如有必要，重复步骤 D5 一次或两次。
7. 用 100 μL 的 FACS 染色缓冲液重新悬浮细胞。
8. 将荧光染料标记的抗体添加到细胞中，并在黑暗中在冰上孵育 30 分钟。准备单色补偿控制并设置补偿。
9. 在每个样品中加入 1 mL 的 FACS 染色缓冲液。在室温下以 300 – 400 × g离心样品 5 分钟并弃去上清液。
10. – 600 µL FACS 染色缓冲液中重悬染色细胞，并在流式细胞仪 LSRII 或 Attune 流式细胞仪上采集数据（有关代表性数据，请参见图 3 和 4）。

食谱_

1. DPBS/2% 牛血清白蛋白
500 毫升 DPBS 中的 10 克 BSA
通过 0.22 µm 过滤器过滤

2. T细胞培养基（T-cell media）
45% 综合平均运动量
45% 转速指数 1640
10% 人血清
1% 巴黎圣日耳曼
2.5% HEPES (1 M)

3. Raji B 细胞的细胞培养基（Raji 培养基）
RPMI 1640，10% 热灭活 FBS，1% PSG

4. FACS 染色缓冲液
含有 2% FBS 和 1 mM EDTA 的 DPBS

致谢

XS 得到了美国癌症协会研究学者资助、Charles H. Hood 基金会儿童健康研究奖、Andrew McDonough B+ 基金会研究资助、Gilead 科学研究血液学/肿瘤学学者计划、Rally 基金会和 Bear Necessities Foundation A 的支持协作儿科癌症研究奖励计划、Rally 青年学者计划、耶鲁 SPORE 皮肤癌 DRP 奖 CA121974、耶鲁 DeLuca 试点奖、NIGMS MIRA (R35) 计划 GM138299 和人类前沿科学计划早期职业研究资助。支持该研究项目的 FACS 服务、结果和/或产品由新泽西州罗格斯癌症研究所免疫监测共享资源生成，部分资金来自 NCI-CCSG P30CA072770-5920。本协议源自原始研究论文 ( Xiao et al., 2022; 10.1126/sciimmunol.abl3995 )。

利益争夺

XS 是 CAR 临时专利的共同申请人，该专利并非基于本手稿中的具体结果。其他作者声明他们没有竞争利益。

伦理

小鼠被安置在无特定病原体的条件下，并根据美国国立卫生研究院的指导方针得到照顾，所有程序均获得罗格斯大学动物护理和使用委员会 (PROTO202100020) 的批准。

参考

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