材料和试剂
1. HEK293F 细胞（ATCC，目录号：CRL-1573）
2. Sf9细胞（ATCC，目录号：CRL-1711）
3. BL21（DE3）大肠杆菌细胞（ TransGen Biotech，目录号：CD601-02）
4. Lab Tek Chambered 盖玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：150682）
5. SMM 293-TII 表达培养基（Sino Biological，目录号：M293TII）
6. Sf-900 II SFM 培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：10902096）
7. 聚乙烯亚胺(PEI)（ Polysciences ，目录号：23966-2）
8. 直链淀粉珠（New England Biolabs ，目录号：E8035S）
9. LB 肉汤粉（ Sangon Biotech，目录号：A507002）
10. 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）溶液（ Sangon Biotech，目录号：B541007）
11. Tris（Sigma-Aldrich，目录号：77-86-1）
12. 苯甲基磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：329-98-6）
13. 乙酸（ Sangon Biotech，目录号：A501931）
14. 醋酸铵（ Sangon Biotech，目录号：A600032）
15. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（ HyClone ，目录号：SH80255.01）
16. HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：7365-45-9）
17. 咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：288-32-4）
18. 甘油（ Sinopharm ，目录号：56-81-5）
19. DTT（二硫苏糖醇）（ Inaclo ，目录号：0281）
20. 麦芽糖（Sigma-Aldrich，目录号：69-79-4）
21. Rosetta (DE3) pLysS-感受态大肠杆菌细胞（TIANGEN，目录号：CB108-02）
22. Strep- Tactin树脂（IBA Lifesciences ，目录号：2-1201-002）
23. D-脱硫生物素（Sigma-Aldrich，目录号：D1411）
24. HisPur (tm) Ni-NTA 树脂（Thermo Fisher Scientific，目录号：88222）
25. MBP Trap HP 柱（GE Healthcare，目录号：28-9187-78）
26. TEV 蛋白酶（ Solarbio ，目录号：P2060）
27. 氯化钠（ NaCl ）（ Sangon Biotech ，目录号：A610476）
28. PIPES（ Sangon Biotech，目录号：A620434）
29. 氯化钾（ KCl ）（ Sangon Biotech，目录号：A610440）
30. MgCl 2 （ Sangon Biotech，目录号：B601193）
31. EGTA（ MedChemExpress ，目录号：HY-D0861）
32. 乙二胺四乙酸（EDTA）（ MedChemExpress ，目录号：HY-Y0682）
33. 5'-三磷酸腺苷（ATP）（ MedChemExpress ，目录号：HY-B2176）
34. MOPS（ MedChemExpress ，目录号：HY-D0859）
35. Triton X-100（ Solarbio ，目录号：T8200）
36. 蛋白酶抑制剂混合物（ MedChemExpress ，目录号：HY-K0012）
37. 葡萄糖氧化酶（ Solarbio ，目录号：G8030）
38. 过氧化氢酶（ Solarbio ，目录号：C8070）
39. 牛血清白蛋白（BSA）（Solarbio，目录号：A8010）
40. 甲基纤维素（ MedChemExpress ，目录号：HY-125861）
41. 蔗糖（ Solarbio ，目录号：S8271）
42. ATP-Mg（Sigma Aldrich，目录号：A9187）
43. 缓冲液 A（参见配方）
44. 缓冲液 B（参见配方）
45. 缓冲液 C（参见配方）
46. 裂解缓冲液（见配方）
47. 基本缓冲区（参见食谱）
48. 加载缓冲区（见食谱）
49. 高盐缓冲液（见配方）
50. 洗涤缓冲液（见配方）
51. TIRF 缓冲区（参见食谱）
52. 洗脱缓冲液（见配方）
53. 存储缓冲区（参见配方）

设备

1. 镍柱（Bio-Rad，目录号：12009287）
2. Mono Q 5/50 GL 柱（GE Healthcare，目录号：17-5166-01）
3. HiTrap Q HP（GE Healthcare，目录号：17-1154-01）
4. Superdex200 增加 10/300 GL（GE Healthcare，目录号：28990944）
5. 超滤盘（Sigma-Aldrich，目录号：PLGC07610）
6. Allegra X-14离心机， 45 Ti 型转子手册，JS-4.750 吊桶式转子和吊桶，4 × 50 mL，9 × 15 mL 适配器（Beckman Coulter，型号：Allegra X14，目录号：A99464）
7. 37 °C 水浴（Thermo Fisher Scientific，型号：TSCIP19）
8. 37°C 和 5% CO 2的培养箱（Thermo Fisher Scientific，型号： HERACell 150i）
9. 共聚焦荧光显微镜（NIKON，A1 HD25）
10. 尼康 SIM/STORM（TIRF）
11. 场发射扫描电子显微镜 (FE-SEM) (FEI Quanta 200)
12. 临界点干燥机（世佳生物，型号：SCD-350M）

软件

1. NIS-Elements 软件（实验室成像）
2. 图片J

程序

A. Arp2/3 复合物的纯化

1. 表达载体构建：将人Arp2/3-ArpC1a-ArpC5复合体的7个亚基全长开放阅读框亚克隆到pCAG载体中。为促进蛋白质纯化，在 ArpC1a 的N端添加两个链球菌标签（ Doolittle 等人，2013a 和 2013b ）。
2. 细胞转染：在 SMM 293-TII 表达培养基中将 HEK293F 细胞培养至每毫升 1.5 – 180 万个细胞的密度。使用PEI将质粒瞬时转染到 HEK293F 细胞。将复合物每个亚基的 0.25 毫克质粒（总共 1.75 毫克）和 3 毫克 PEI 在 50 mL 新鲜培养基中混合 25 分钟，然后添加到 800 mL 培养物中。在 37 °C 下培养转染细胞，并在摇床中补充 5% CO 2 48 – 72 小时。
3. 目的蛋白的提取纯化：
a. 通过离心收集细胞并重悬于冰冷的缓冲液 A 中。
b. 在 4°C 下旋转时，使用 1% Triton X-100 溶解细胞膜 1 小时。
c. 使用 45 Ti 转子在 4°C 下以 20,000 x g离心细胞裂解物1 小时以去除细胞碎片。
d. 收集上清液并将其加载到 Strep- Tactin树脂上。
e. 用缓冲液 B 进行大量洗涤以去除未结合的蛋白质。
f. mM D-脱硫生物素的缓冲液 B 洗脱结合的蛋白质。
g. 使用缓冲液 C 通过 Superdex200 Increase 10/300 GL 柱进一步纯化目标蛋白。
h. 将包含所有七个亚基的峰值分数汇集并浓缩到 10 mg/ mL。

B. PWCA 的纯化

1. 载体构建：将人WHAMM蛋白的PWCA结构域克隆到含有N端MBP标签的pCAG载体中（ Liu et al., 2017 ）。 PWCA 域从 HEK293F 细胞系中表达和纯化。
2. 当培养物达到每毫升 1.2–160 万个细胞的密度时，使用 2 毫克 PEI 转染具有 1 毫克质粒的细胞。
3. 目的蛋白的提取纯化：
a. 48-72小时后，收获细胞并在冰冷的裂解缓冲液中裂解 1 小时，同时在 4°C 下旋转。
b. × g离心1 小时去除不溶性物质在 4°C。
c. 在 4°C 下旋转时，用直链淀粉珠孵育上清液 2 小时。
d. mM麦芽糖的相同缓冲液洗脱结合的蛋白质。
e. 使用 Mono Q 5/50 GL 柱通过阴离子交换进一步纯化洗脱的蛋白质。
f. 使用加载缓冲区作为运行缓冲区，以 1 mL/min 的速度将蛋白质加载到 Mono Q 列上。
g. 使用高盐缓冲液进行梯度洗脱。
h. 汇集并将包含 PWCA 域的分数加载到Superdex 75 10/300 GL 列上以进行最终纯化。

C. 帽蛋白 ( CapZ )的纯化

1. 帽蛋白cDNA （ α1β2 ， Mus 肌肉）转化为含有N端 6×His 标签的pET-3d 载体。
2. 通过蛋白质表达转化将表达载体转移到Rosetta (DE3) pLysS感受态大肠杆菌细胞中。
3. 目标蛋白的提取纯化：
a. 在 37°C 的LB 培养基中培养细菌，并在 OD 600 0.6 – 1.0 和 0.5 mM IPTG 下诱导蛋白质表达 3 小时。
b. 通过离心收集细胞沉淀并重悬于冰冷的裂解缓冲液中。
c. 超声波裂解细胞；然后，使用 45 型 Ti 转子在 4°C 下以 20,000 x g离心 1 小时，去除细胞碎片。
d. 收集上清液并将其加载到 Ni-NTA 树脂上。
e. 用洗涤缓冲液洗涤树脂。
f. 用洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白质。
g. 使用 Mono Q 5/50 GL 柱通过阴离子交换进一步纯化洗脱的蛋白质。
h. 使用加载缓冲区作为运行缓冲区，以 1 mL/min 的速度将蛋白质加载到 Mono Q 列上。
i. 使用高盐缓冲液进行梯度洗脱。
j. 汇集并将含有封盖蛋白的分数加载到Superdex 75 10/300 GL 柱上以进行最终纯化。

D. 肌球蛋白 1D 的纯化

1. 在 sf-900 II SFM 培养基中将 Sf9 细胞培养至 2 × 10 6 个细胞/mL 的密度，并与包含在g a中的全长 Myo1D 构建体的病毒一起孵育 N 端6×His 标签。
2. 60 小时后，收集细胞，通过冻融循环裂解，并在 4°C 下离心。
3. × g离心30 分钟去除不溶性物质。
4. 用 1 mL 的 Ni-NTA 树脂在 4°C 的滚筒上孵育上清液 1 小时，然后转移到柱中。
5. 用洗涤缓冲液清洗柱子。
6. 用洗脱缓冲液洗脱肌球蛋白 1D 。
7. 280确定。
8. 通过超滤盘 (10 KD) 浓缩蛋白质。
9. 将蛋白质储存在储存缓冲液中。
10. 考马斯蓝染色的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶确定蛋白质的纯度。

E. Ub8 的表达和纯化

1. 600 ~0.8 和 0.5 mM IPTG 在 18°C 下诱导16 小时。
2. mM Tris (pH 8.0)、150 mM中重悬细胞氯化钠和 2毫米苯甲基磺酰氟（PMSF）。
3. 将细胞悬浮液转移到冰上并超声处理以破坏细胞，然后在 4°C 下以 47,850 x g离心1 小时。
4. 通过 Ni-NTA 柱分离蛋白质。
5. Hitrap Q HP 柱进一步纯化蛋白质。
6. 醋酸酸化 Ub8 溶液。
7. 适用于Hitrap SP HP 色谱柱。
8. mM醋酸铵 pH 4.5中使用NaCl (0–1 M)的线性梯度洗脱。
9. 通过凝胶过滤进一步纯化 Ub8 蛋白。在 150 mM中平衡凝胶过滤柱 ( Superdex 200 10/300) NaCl 、40 mM Tris- HCl (pH 7.4)、10% 甘油和 1 mM DTT。
10. 闪冻 Ub8 蛋白并储存在-80°C。
F. p62的表达和纯化

1. 通过转化将 MBP-mCherry-p62 结构（His6-MBP-Tev-mCherry 载体骨干）转移到 BL21（DE3）大肠杆菌细胞中，并在 37°C 下传播到细菌培养板中进行过夜培养。
2. rpm的细菌摇床中于 37 °C 孵育持续 14 – 18 小时。
3. 将 1% 的细菌溶液接种到 1 L 液体 LB 培养基中，并在 37°C 下扩大培养。
4. 当 OD 600达到 ±0.6 时，添加 0.2 mM IPTG 以在 16 °C 下诱导蛋白质表达过夜。
5. ×收集细菌 g 15 分钟。用 PBS 再次洗涤。
6. 添加 30 mL 的裂解缓冲液、涡旋和摇动以完全重悬细菌。
7. 将重新悬浮的细菌放入冰上的 50 mL 玻璃烧杯中。
8. 超声波粉碎细菌 10 分钟，强度为 60%，超声处理 5 秒，间隔 3 秒。
9. ×离心超声处理溶液 g在 4 °C 下保持 30 分钟。
10. 收集上清液并用MBP Trap HP 柱纯化蛋白质。
11. 使用 TEV 蛋白酶去除 MBP-mCherry-p62 融合蛋白中的 MBP 标签 ( Raran-Kurussi et al., 2017 )。将等量的 TEV 蛋白酶添加到含有 MBP-mCherry-p62 融合蛋白的标准反应缓冲液（50 mM Tris- HCl pH 8.0、0.5 mM EDTA 和 1 mM DTT）中，孵育过夜 (4 °C) 或 1 – 2小时（37°C）。
12. 所得 mCherry-p62 蛋白用于体外相分离测定。

G. 在 Arp2/3 衍生的肌动蛋白网络上 p62 体的体外重建（图1）

1. Jiang 和 Huang，2017 ）中的描述准备肌动蛋白单体（1 μM ，50% 俄勒冈绿标记）。可以在配备 100倍油物镜的尼康显微镜下通过 TIRF 照明观察肌动蛋白丝的生长。
2. 要启动支链肌动蛋白聚合，添加 1 μM肌动蛋白（50% 俄勒冈绿色标记）、100 nM Arp2/3 复合物、600 nM CapZ和 300 nM PWCA 到管中，然后为总共50 μL混合溶液添加TIRF 缓冲器。
3. 小心地将 10 μL的混合溶液转移到 Lab Tek Chambered 盖玻片的中心。
4. 在腔室的焦平面上，可以通过 TIRF 显微镜观察到稳健的支化肌动蛋白聚合。
5. 将 10 μM Myo1D 添加到解决方案中并继续 TIRF 成像。
6. 将 0.5 μM mCherry-p62 和 3 μM Ub8 添加到溶液中并继续 TIRF 成像。
7. 扫描电子显微镜检查。对于常规固定程序，在盖玻片上生长 p62 体，在室温下用 PBS 缓冲液中的 2.5% 戊二醛固定 2 小时，用 PBS 缓冲液清洗三次，然后在室温下用 1% 锇固定 20 分钟。然后，将所有样品用分级系列的乙醇（50%、70%、80%、90%、100% 和 100%）脱水 2 分钟，并使用 CO 2 用临界点干燥机干燥。在使用Helios检测器以 2.0 kV 的加速电压使用聚焦离子束扫描电子显微镜检查之前，通过溅射镀膜在干燥的样品上涂上约 5 nm 厚的金膜（ Rong et al., 2012 ）。

图 1. p62 体重建试验示意图。分子未按比例绘制。

数据分析

在此重组测定中，所有成分均来自纯化的蛋白质。俄勒冈州绿色标记的肌动蛋白单体可以自组装成肌动蛋白丝（图 2，左图）。添加 Arp2/3 复合体、 CapZ和 PWCA 导致分支肌动蛋白网络的形成（图 2，右图）。 Myo1D 作为运动蛋白，对于分支肌动蛋白网络不是必需的；然而，它的包含加强了这种分支肌动蛋白结构。然后将 p62 体（mCherry-p62 和 Ub8）的支架蛋白引入分支肌动蛋白网络之上，以重建细胞骨架相关的 p62 体，这可以通过 TIRF 显微镜或扫描电子显微镜观察（图 3 和图 4）。然后，NIS-Elements 软件用于图像测量和协同定位分析。在这种体外试验中，与单独使用 p62/Ub8 相比，在存在分支肌动蛋白网络的情况下，支架蛋白的浓度阈值较低，p62 体的相分离大大加速（Feng 等人，2022 ）。使用ImageJ处理免疫荧光图像（必要时旋转、裁剪和调整亮度和对比度）。

图 2. 显示肌动蛋白聚合的全内反射荧光 (TIRF) 图像。俄勒冈绿标肌动蛋白丝（左图）和重构的分支肌动蛋白网络（右图）。比例尺 = 10微米。

图 3. 分支肌动蛋白网络上的体外重组 p62 体。比例尺 = 5 µm。

图 4. FE-SEM 观察到的重组 p62 体的形态。场发射扫描电子显微镜(FE-SEM) 图像显示了 Arp2/3 衍生肌动蛋白网络上四个重组 p62 体的结构。比例尺 = 1 µ m。

笔记

1. 混合分支肌动蛋白聚合的组分时，建议先将 PWCA 和 Arp2/3 复合物共孵育 5 分钟，然后再与肌动蛋白和CapZ混合。否则，支化肌动蛋白聚合的效率会降低。
2. 建议在使用前超速离心肌动蛋白单体以去除沉淀物。

食谱

1. 缓冲液A
20毫米HEPES pH 值 7.4
40毫米氯化钠
1毫米数字地面电视
4 °C 保存，两周内使用

2. 缓冲区 B
20 mM管道 pH 6.8
150毫米氯化钾
2毫米氯化镁2
5毫米 EGTA
1mM乙二胺四乙酸
0.5毫米数字地面电视
0.2毫米ATP
5%甘油
4 °C 保存，两周内使用

3. 缓冲液C
20毫米拖把 pH 值 7.0
100毫米氯化钾
2毫米氯化镁2
5毫米EGTA
1毫米乙二胺四乙酸
0.5毫米数字地面电视
0.2毫米ATP
5%甘油
4 °C 保存，两周内使用

4. 裂解缓冲液
20毫米Tris pH 8.0
150毫米氯化钠
1毫米数字地面电视
1毫米乙二胺四乙酸
5%甘油
1% 海卫 X-100
蛋白酶抑制剂混合物
4 °C 保存，两周内使用

5. 基本缓冲区
20毫米Tris pH 8.0
150毫米氯化钠
1毫米数字地面电视
1毫米乙二胺四乙酸
4 °C 保存，两周内使用

6. 加载缓冲区
20毫米Tris pH 8.0
80毫米氯化钠
1毫米数字地面电视
1毫米乙二胺四乙酸
储存在-20°C

7. 高盐缓冲液
20毫米Tris pH 8.0
500毫米氯化钠
1毫米数字地面电视
1毫米乙二胺四乙酸
4 °C 保存，两周内使用

8. 洗涤缓冲液
20毫米HEPES pH 值 7.4
500毫米氯化钠
1毫米数字地面电视
5%甘油
30毫米咪唑
4 °C 保存，两周内使用

9. TIRF 缓冲区
1毫米氯化镁2
50毫米氯化钾
1毫米EGTA
10 mM咪唑 pH 8.0
0.2毫米ATP
100毫米数字地面电视
100 μ g/mL 葡萄糖氧化酶
20 μ g/mL过氧化氢酶
0.2% 牛血清白蛋白
0.5% 甲基纤维素
4 °C 保存，两周内使用

10. 洗脱缓冲液
50毫米Tris pH 7.5
250 mM咪唑
300毫米氯化钠
0.2毫米EGTA
4 °C 保存，两周内使用

11. 存储缓冲区
50毫米肝素 PH7.4
300毫米氯化钠
50 μM ATP-镁
10% 蔗糖
4 °C 保存，两周内使用

致谢

我们感谢博士。 Jiangfeng Shen、 Xiaoyu Fu、 Wanqing Du、 Wenkang Zhao、 Xuezhao Feng、 Mingrui Ding、 Jinpei Zhang 和Daxiao Sun 为优化该协议所做的有益努力和建议。本工作得到中国科学技术部的支持（2017YFA0506300），国家自然科学基金（31771536和 31860316）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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