材料和试剂
1.Nunc 15 和 50 mL 锥形无菌聚丙烯离心管（Thermo Scientific ，目录号：339650、339652）
2.22 号手术刀刀片（Swann-Morton，目录号：0508）
3.100 mm TC 处理的培养皿（Corning，目录号：430167）
4.T175 细胞培养瓶（Greiner Bio-One，目录号：661175）
5.Nunc 未处理的 24 孔板（Thermo Scientific ，目录号：144530）
6.农奴克隆 Sphera 24 孔板（Thermo Scientific ，目录号：174930）
7.Costar 6.5和12 mm Transwell® ，0.4 μm孔聚酯膜插入物（Stem Cell Technologies，目录号：38024 ， 38023)
8.40和 100 μm细胞过滤器（Falcon，目录号：352340、352360）
9.S teritop螺纹瓶顶过滤器（0.22 μm ）（Merck Millipore，目录号：SCGPS01RE）
10.10/100/1,000 μL QSP 低保留过滤移液器吸头（Thermo Scientific，目录号：TFLR102-10-Q、TFLR113-100-Q、TFLR1121000-Q ）
11.5/10/15 mL Stripette血清移液器（Corning，目录号：4487、4488、4489）
12.巴斯德吸管长度约. 225 毫米（品牌，目录号：747720）
13.5 mL 圆底聚苯乙烯试管（Falcon，目录号：352052）
14.β-BODIPY TM FL C12-HPC（ Invitrogen，目录号： D3792）
15.LysoTracker TM红 DND-99（ Invitrogen，目录号： L7528）
16.Matrigel 生长因子减少 (GFR) 基底膜基质，无酚红，无 LDEV（Corning，目录号：356231）
17.高级 DMEM/F-12（Gibco，目录号：12634010）
18.DMEM（ Gibco，目录号：10569010）
19.Zeocin TM选择试剂（100 mg/mL）（ Gibco，目录号：R25005）
20.Geneticin TM选择性抗生素（G418 硫酸盐）（50 mg/mL）（ Gibco，目录号：10131035）
21.HEPES（ Gibco，目录号：15630056）
22.GlutaMAX补充剂（Gibco，目录号：35050061）
23.青霉素 - 链霉素（Gibco，目录号：15140122）
24.重组人 Rspondin1（ Stem Cell Technologies，目录号：78213； Peprotech ，目录号：120-38）
25.Rspondin1 表达 293T 细胞系（Sigma-Aldrich，目录号：SCC111）
26.重组人头蛋白（Stem Cell Technologies，目录号：78060； Peprotech ，目录号：120-10C）
27.B-27 补充剂（50 × ），无血清（Gibco，目录号：17504044）
28.N-乙酰-L-半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A9165）
29.烟酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：N0636）
30.Y-27632 二盐酸盐（ Tocris ，目录号：1254）
31.A 83-01（ Tocris ，目录号：2939）
32.SB 202190（Sigma-Aldrich，目录号：S7067）
33.重组人 KGF（FGF-7）（ Peprotech ，目录号：100-19）
34.重组人 FGF-10（ Peprotech ，目录号：100-26）

35.重组人调蛋白β-1（ Peprotech ，目录号：100-03）
36.Primocin （ InvivoGen ，目录号：ant-pm-1）
37.地塞米松（ Tocris ，目录号：1126）
38.8-Bromo-cAMP，钠盐（ Tocris ，目录号：1140）
39.IBMX（ Tocris ，目录号：2845）
40.CHIR 99021（ Tocris ，目录号：4423）
41.重组鼠 WNT3A（ Peprotech ，目录号：315-20）
42.L WNT3A 细胞系（ATCC，目录号：CRL-2647）
43.PneumaCult -ALI 培养基（ StemCell Technologies，目录号：05001）
44.肝素溶液（ StemCell Technologies，目录号：7980）
45.氢化可的松原液（ StemCell Technologies，目录号：7925）
46.DAPT （ Tocris ，目录号：2634）
47.PIPES （Sigma-Aldrich，目录号：P1851）
48.溶组织梭菌的胶原酶（Sigma-Aldrich，目录号：C9407）
49.TrypLE选择酶（10 × ），无酚红（Gibco，目录号：A1217701）
50.磷酸盐缓冲盐水（ PBS）（Gibco，目录号：10010023）
51.胎牛血清（FBS），合格，热灭活（Gibco，目录号：10082147）
52.缓冲液 EL 红细胞裂解缓冲液（Qiagen，目录号：79217）
53.UltraPure TM 0.5 M EDTA，pH 8.0（ Invitrogen，目录号：15575020）
54.甲醛溶液 [即 37% 多聚甲醛 (PFA)]（ Sigma-Aldrich，目录号：252549）
55.Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
56.牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A9418）
57.DAPT（Sigma-Aldrich，目录号：D9542）
58.鬼笔环肽 - Atto 647N（Sigma-Aldrich，目录号：65906）
59.ProLong TM玻璃抗淬灭封固剂（Invitrogen，目录号：P36980）
60.戊二醛（购自港大电镜组）
61.盐酸(HCl)（ Sigma-Aldrich，目录号：320331）
62.氢氧化钠(NaOH)（ Sigma-Aldrich，目录号：221465）
63.基础培养基（见食谱）
64.膨胀介质（见食谱）
65.远端分化培养基（DD 培养基）（见食谱）
66.近端分化培养基（PD 培养基）（参见食谱）
67.Rspondin1 条件培养基（参见食谱）
68.Noggin 条件培养基（参见食谱）
69.WNT3A 条件培养基（参见食谱）

设备

1.SterilGARD e3 II 类 A2 型生物安全柜（ Baker Co，目录号：SG404-INT ）
2.Forma Steri -Cycle i160 CO 2 165 L 培养箱（ Thermo Fisher Scientific，目录号：51030301 ）
3.New Brunswick Innova® 44 /44R 可堆叠培养箱摇床（ Eppendorf，目录号：M1282-0002）
4.离心机（Eppendorf，型号：5810R）
5.FE20-Kit FiveEasy台式 pH 计（Mettler Toledo，型号：FE20-KIT）
6.LightCycler 96 仪器（Roche，目录号： 381711）
7.倒置常规显微镜（Nikon，型号：Eclipse TS100）
8.共聚焦显微镜（蔡司，型号：LSM 800)
9.透射电子显微镜（FEI，型号： Tecnai G2 20 S-TWIN）
10.细胞分析仪（BD Biosciences，型号： FACSCanto II & LSRFortessa ）
11.Midi Plus 移液控制器（Sartorius，型号：710931）
12.Research Plus 机械移液器（Eppendorf，目录号：3123000900）

程序

A.肺类器官的衍生和扩增

1.准备
a.准备基础培养基（配方 1）并将其保存在冰上或 4°C。
b.准备膨胀培养基（配方 2）并在 37 °C 下预热。
c.在 4°C 下解冻基质胶并将其保存在冰上。
注意：Matrigel 会在室温下凝固。
d.在标准细胞培养箱中预热 24 孔悬浮培养板，该培养箱具有 5% CO 2和 37 °C 的湿润气氛。
e.通过用火焰（如本生灯）燃烧尖端，将开口从 ±1.5 缩小到 ≤ 1 毫米，准备开口较窄（ ≤ 1毫米）的玻璃巴斯德移液器。冷却巴斯德移液器。使用前对巴斯德移液器进行高压灭菌。
注意：燃烧程序还旨在平滑玻璃移液器的锋利边缘并减少细胞损伤。可以使用任何具有窄开口（ ≤ 1 毫米）和光滑边缘的细尖巴斯德移液器。
f.2-3毫升的基础培养基冲洗巴斯德移液器，上下移液几次，以避免细胞过度附着，然后再使用它们机械剪切类器官（即步骤 A3e 和 B2e）。
2.肺类器官的推导
a.从因各种疾病接受外科手术的患者中获取新鲜切除的肺组织。将组织运输到冷基础介质中（最好在 4°C 的冰上）并尽快处理。
注意：肺组织/活检应从远端肺区切除，应由与病变组织相邻的正常组织（包括细支气管和肺泡）组成，直径应为 ±0.5 厘米。
b.在 100 mm 细胞培养皿中用无菌手术刀将组织切成小块（ ≤ 1 mm）。用 10 mL 的冷基础介质清洗组织块，并将其转移到 15 mL 离心管中。在 4 °C 下以 400 × g离心5 分钟。丢弃上清液。
c.，最终浓度为2 mg/ mL ，辅以胶原酶。在 37°C 的摇动培养箱中以 120 rpm 的转速消化组织块 30-40分钟。
d.使用 10 mL 血清移液器上下移液 20 次，剪切消化的组织块。通过 100 μm细胞过滤器过滤细胞悬浮液。
e.（可选）用冷基础培养基从细胞过滤器中回收剩余的组织片，并将它们转移到 15 mL 离心管中，通过移液进行第二轮机械剪切，然后过滤以提高细胞产量。
f.将 FBS 添加到最终浓度为 2% 的流通中，以终止酶消化。在 4 °C 下以 400 × g离心5 分钟。丢弃上清液。
g.（可选）将颗粒重新悬浮在 2 mL 的红细胞裂解缓冲液中，并在室温下孵育 5 分钟以去除红细胞。
h.用 10 mL 的冷基础培养基清洗细胞。在 4 °C 下以 400 × g离心5 分钟。丢弃上清液。
i.将沉淀重悬于冷基质胶中。添加80-160 μL基质胶，用于从直径约 0.5 厘米的肺组织中获得的细胞。将 40 μL细胞悬浮液分配到预热的 24 孔悬浮培养板的每个孔中，并在标准细胞培养 CO 2培养箱中于37 °C孵育 10 – 15 分钟，使基质胶液滴凝固。
j.加入 500 μL的扩增培养基，并在标准细胞培养 CO 2培养箱中孵育板。每2-3天补充一次培养基，注意不要破坏基质胶液滴。观察类器官并定期在光学显微镜下监测它们的生长情况（图 1 ）。
注意：在初始培养中，有肺成纤维细胞等非上皮细胞类型，传代2-3代后会逐渐消失。

图1。肺类器官的衍生和扩展。（A）。顶部，示意图概述了肺类器官 (LO) 在扩展介质（Exp 介质）中的衍生和扩展。底部，显微照片显示在第 0、5、9、13 和 19 天从分离的肺细胞中提取的肺类器官正在生长。比例尺 = 500 μm 。 (二).将肺类器官应用于免疫荧光染色，以标记 P63+ 基底细胞、FOXJ1+/ACCTUB+ 纤毛细胞、MUC5AC+ 杯状细胞、CC10+ 俱乐部细胞和 SFTPB+ AT2 细胞（绿色）。分别用 DAPI（蓝色）和 Phalloidin-647（白色）对细胞核和肌动蛋白丝进行复染。比例尺 = 20微米。

3.肺类器官的扩张
a.2-3周传代一次并分裂肺类器官。
b.1，000 μL移液器在介质中上下移液 10 次，从而破坏基质胶液滴。将混合物转移到 15 mL 管中。如果收获了几口有机体进行传代，则用冷基础培养基加满至 10 mL 的总体积。将混合物在冰上孵育 5 分钟。在 4 °C 下以 400 × g离心5 分钟。丢弃上清液。
c.用冷基础培养基清洗有机体一次。在 4 °C 下以 400 × g离心5 分钟。丢弃上清液。
d.（可选）将类器官重悬于 1 – 2 mL 的 10 × TrypLE并在 37°C 下孵育 5 分钟以消化类器官。将终浓度为 2% 的 FBS 添加到类器官中以终止酶消化（即添加 20 1 mL 的 10 × FBS 的μL 尝试）。
注意：当机械剪切方法不足以将肺类器官剪切成小块或类器官的大小变化很大时，特别是当后续实验需要相对均匀大小的类器官时，首选胰蛋白酶消化。
e.用巴斯德吸管上下吹打 20-40次，将类器官剪切成单细胞和小细胞簇。
f.在光学显微镜下检查剪切的类器官，以确保类器官碎片足够小（例如，少于 10 个细胞）。如有必要，重复机械剪切。
g.用冷基础培养基清洗细胞。在 4 °C 下以 400 × g离心5 分钟。丢弃上清液。
h.将颗粒重新悬浮在估计体积的冷基质胶中，根据原始培养物中的类器官密度和传代方法，以 1:2 至 1:10 的比例拆分类器官。我们通常在机械剪切传代时采用 1:2 至 1:4 的比例，在酶消化传代时采用 1:6 至 1:10 的比例。
注意：细胞密度应约为每 40 个2 × 10 4 – 4 × 10 4个细胞 μL基质胶。
i.将 40 μL细胞悬浮液分配到预热的 24 孔悬浮培养板的每个孔中，并在标准细胞培养 CO 2培养箱中于37 °C孵育 10 – 15 分钟，使基质胶液滴凝固。
j.加入 500 μL的扩增培养基，并在标准细胞培养 CO 2培养箱中孵育板。每2-3天补充一次培养基，注意不要破坏基质胶液滴。
注意：肺类器官可以每 2-3 周传代一次，持续大约一年（即 16-24代）。

B.肺类器官的远端分化产生肺泡类器官

1.准备
准备远端分化培养基（DD 培养基）（配方 3）并在 37 °C 下预热。
2.悬浮培养的远端分化
a.在扩张培养基中培养肺类器官 12-14天，为分化培养准备足够的类器官（来自步骤 A3j 的肺类器官）。
b.1，000 μL移液器在介质中上下移液 10 次，从而破坏基质胶液滴。将混合物转移到 15 mL 管中。如果收获了几口有机体进行传代，则用冷基础培养基加满至 10 mL 的总体积。将混合物在冰上孵育 5-10分钟。在 4 °C 下以 400 x g离心5 分钟。丢弃上清液。
注意：使用冷基础培养基（保持在冰上）清洗类器官并在冰上孵育以完全去除基质胶。残留的基质胶可能会影响后续悬浮培养的效果。
c.用冷基础培养基清洗有机物。在 4 °C 下以 400 x g离心5 分钟。丢弃上清液。
d.将类器官重悬于 1 – 2 mL 的 10 × TrypLE并在 37°C 下孵育 5 分钟以消化类器官。添加终浓度为 2% 的 FBS 以终止酶消化（即添加 20 1 mL 的 10 × FBS 的μL 尝试）。
e.使用巴斯德移液器上下移液 20-40 次，将类器官剪切成单个细胞。
f.在光学显微镜下检查以确保类器官被剪切成单个细胞。如有必要，重复机械剪切。
g.用 10 mL 的冷基础培养基清洗细胞。通过 40 μm细胞过滤器过滤细胞悬浮液。在 4 °C 下以 400 x g离心5 分钟。丢弃上清液。
h.根据估计的细胞数量，将颗粒重新悬浮在 1 – 10 mL 的 DD 培养基中。在显微镜下用血细胞计数器计数细胞数。使用 DD 培养基将细胞浓度调整为每毫升 2 × 10 5 个。
i.Nunclon的每个孔中分配 500 μL细胞悬浮液（1 × 10 5 个细胞）球体 24孔悬浮培养板。
笔记：
1)在 24 孔板中生成一盘肺泡类器官需要大约 2.4 × 10 6 个细胞。
2) 悬浮培养时不要在每个孔中放入过多的细胞，因为如果密度过高，细胞可能会形成聚集体，这可能会影响肺泡分化。
Nunclon的超低细胞贴壁面 Sphera培养板。
j.在标准细胞培养箱中孵育细胞 10 – 14 天以使其成熟（图 2 ）。每隔一天直接向每个孔中添加 100 μL的 DD 培养基，而无需去除旧培养基，因为蒸发会减少孵育过程中培养基的体积。在将板放回培养箱之前，通过轻轻摇动均匀分布细胞。

笔记：
1) 确保细胞均匀分布；如果它们紧密地集中在井中，它们可能会形成聚集体，这可能会损害肺泡分化。
在 DD 培养基中悬浮培养后的第 3-4天，在显微镜下可以辨别具有内腔和薄壁的类器官。经过 10 天的远端分化培养，肺泡类器官已经足够成熟，可以模拟原生肺泡上皮细胞，适用于后续的实验操作。
3）薄而扁平的AT1细胞很脆弱。轻轻移液器以避免在分化培养和下游过程中干扰 AT1 形态。

图 2。肺泡类器官的产生。（A）。顶部的示意图概述了在远端分化培养基（DD 培养基）中生成肺泡类器官 ( AlvO ) 的远端分化方案。 Exp 介质 = 扩展介质。底部，显微照片显示第 0 天的单细胞悬浮液和第 14 天的成熟肺泡类器官。比例尺 = 100 μm 。 (二).将肺泡类器官应用于免疫荧光染色以标记 AQP5+ AT1 细胞（红色）和 SFTPB+/HTII-280+ AT2 细胞（绿色）。分别用 DAPI（蓝色）和 Phalloidin-647（白色）对细胞核和肌动蛋白丝进行复染。比例尺 = 20微米。

C.肺类器官的近端分化以生成优化的二维气道类器官

1.准备
a.准备近端分化培养基（PD 培养基）（配方 4，无 PIPES，pH 7.4）并在 37°C 下预热。
b.准备近端分化培养基（PD 培养基）（配方 4，带 PIPES，pH 6.6）并在 37°C 下预热。
c.在标准细胞培养箱中用基础培养基预孵育Transwell插入物过夜。对于 24 孔插入物，分别在顶部和底部腔室中添加 200 和 500 μL的基础介质。
2.Transwell插入物的近端分化
a.在扩增培养基中培养肺类器官 12-14天，为分化培养准备足够的细胞（来自步骤 A3j 的肺类器官）。
b.根据步骤 B2b–B2g 将肺类器官分离成单个细胞。
c.根据细胞数量将沉淀重悬于1-4 mL 的扩增培养基中。用血细胞计数器计数细胞数。用扩增培养基将细胞浓度调整为每毫升 1.3 × 10 6 个。
d.从预孵育的Transwell插入物的顶部和底部室中取出基础培养基。将 100 μL细胞悬浮液（1.3 × 10 5 个细胞）播种到 24 孔插入物的顶室。在底室中加入 500 μL的膨胀介质。在标准细胞培养 CO 2培养箱中孵育细胞两天，让细胞生长和附着。
Transwell插入物中生成一盘二维气道类器官需要大约 3.12 × 10 6 个细胞。
e.在顶部和底部腔室中用 PD 介质 (pH 7.4) 替换膨胀介质。在标准细胞培养 CO 2培养箱中孵育细胞两天，让细胞达到汇合。
注意：2D 类器官在从扩展介质变为 PD 介质 (pH 7.4) 2-3 天后达到汇合。
f.将 PD 介质 pH 值 7.4 替换为顶部腔室中的 PD 介质 pH 值 6.6，同时将 PD 介质 pH 值 7.4 保留在底部腔室中（即顶部/底部的 pH 值 6.6/7.4）。在标准细胞培养 CO 2培养箱中孵育细胞10 天以使其成熟（图 3 ）。每2-3天补充一次顶部腔室中的 PD 介质 pH 值 6.6 和底部腔室中的 PD 介质 pH 值 7.4 。
注意：在 PD 培养基中分化后第 7 天，在光学显微镜下，在有机体中通常可以辨别出活动跳动的纤毛。经过 14 天的近端分化培养后，2D 气道类器官已准备好进行实验操作。

图 3.生成优化的 2D 气道类器官。（A）。示意图概述了在不同 pH 值的近端分化培养基（PD 培养基）中生成 2D 气道类器官 ( AwO ) 的近端分化方案。 Exp 介质 = 扩展介质。 (二).将二维优化的气道类器官应用于免疫荧光染色以标记 ACCTUB+ 纤毛细胞（红色）。分别用 DAPI（蓝色）和 Phalloidin-647（白色）对细胞核和肌动蛋白丝进行复染。比例尺 = 20微米。

D.类器官的表征

1.检查细胞类型特异性基因或其他细胞基因的 mRNA 表达
RT-qPCR 测定：添加 350 μL细胞裂解缓冲液以收获用于 RNA 提取、逆转录和细胞基因表达检测的类器官。
注意：使用自体未分化肺器官进行比较/控制。
2.评估细胞类型特异性标记物和其他细胞蛋白的蛋白表达
a.免疫荧光染色和成像
我。在室温下用 1 mL 的 4% PFA 固定有机体 60 分钟。取出 PFA 并用 2% FBS/PBS 清洗有机体一次。
二.在室温下用 1 mL 的 0.1% Triton X-100 渗透 organoids 10 分钟。取出 Triton X-100 并用 2% FBS/PBS 清洗有机体一次。
三.在室温下用 1 mL 的 3% BSA 阻断有机体 60 分钟。取出 BSA（无需清洗）。
四.在 4°C 下用 2% FBS/PBS 稀释的初级抗体孵育有机体过夜。去除抗体并用 2% FBS/PBS 清洗五次。
注意：有关抗体的最佳稀释度，请参阅产品数据表。
v. 用二抗孵育类器官在 4°C 下在 2% FBS/PBS 中稀释过夜。去除抗体并用 2% FBS/PBS 清洗有机体五次。
注意：加入荧光物质（即二抗）后避免光照。
六.在 4°C 下用 2% FBS/PBS 稀释的 DAPI 和 Phalloidin 对有机体进行复染。去除染料并用 2% FBS/PBS 清洗有机体一次。
七.使用 Prolong 玻璃抗褪色封固剂将有机物安装在带有玻璃盖玻片的玻璃滑梯上，然后进行共聚焦成像。
注意：载玻片可在 4 °C 的黑暗环境中储存约 1 – 2 周。
b.流式细胞术分析
我。在 37°C 的 1 mL 10 mM EDTA 中孵育有机体 30 – 60 分钟。
二.使用巴斯德移液器上下移液 20-40 次，将类器官剪切成单个细胞。
三.在室温下用 1 mL 的 4% PFA 固定细胞 15 – 30 分钟。取出 PFA 并用 2% FBS/PBS 清洗细胞一次。
四.在 4°C 下用 1 mL 的 0.1% Triton X-100 渗透细胞 5 分钟。取出 Triton X-100 并用 2% FBS/PBS 清洗细胞一次。
v. 用在 2% FBS/PBS 中稀释的一抗在 4 °C 下孵育细胞 60 分钟。去除抗体并用 2% FBS/PBS 清洗细胞一次。
注意：有关抗体的最佳稀释度，请参阅产品数据表。
六.用二抗孵育细胞在 4°C 下在 2% FBS/PBS 中稀释 60 分钟。去除抗体并用 2% FBS/PBS 清洗细胞一次。
注意：加入荧光物质（即二抗）后避免光照。
七.以每毫升 1 × 10 6 个细胞的密度将细胞重悬于 2% FBS/PBS 中，并将细胞转移到 5 mL 圆底聚苯乙烯流管中。继续进行流式细胞术。
3.其他的
a.电子显微镜 (EM) 成像：
用 1 mL 的 2.5% 戊二醛固定有机体过夜，然后进行 EM 处理（切片和染色）以进行超微结构成像。
注：请参考香港大学电子显微镜组提供的详细方案（ https://emunit.hku.hk/documents/SamplePreparationTechnique.pdf ）。
b.用于评估肺泡类器官中 AT2 细胞功能的活细胞染色和成像：
我。在 0.5 mL 的 DD 培养基中重新悬浮肺泡有机体，辅以 1 μM的β-BODIPYTM FL C12-HPC。在标准细胞培养箱中在 37°C 下孵育有机体过夜。
注意：加入荧光物质后应避免曝光。
二.将肺泡有机物收集到 15 mL 离心管中。用 10 mL 的基础介质清洗有机体。以 300 × g离心5 分钟。丢弃上清液。
三.在 0.5 mL 的 DD 培养基中重新悬浮有机体，辅以 100 nM的LysoTracker红色。在室温下孵育有机体 30 分钟。
四.重复洗涤（步骤 D3b.ii）。
v. 将活的类器官安装到载玻片上并立即进行共聚焦成像。

数据分析

类器官相关的基因表达、免疫荧光染色、流式细胞术、电子显微镜、功能评估等下游表征和分析，请参考我们的刊物（ Zhou 等人，2018 年；邱等，2022 ）。

笔记

1.所有程序均在生物安全柜中进行。
2.这些协议是可重复的，并已应用于在我们的实验室中生成来自多个捐赠者的肺类器官和分化的肺泡/气道类器官。
3.如基因、年龄、健康状况）而存在一定程度的变异。
4.肺类器官可以冷冻保存，用于长期储存和生物样本库。
5.条件培养基（ Rspondin1、Noggin 和 WNT3A）可以用市售的重组蛋白代替。
6.如果在 4 °C 下正确储存，扩增和分化培养基（配方 2 – 4）可保持稳定使用约 2 – 4 周。准备新鲜培养基以获得最佳性能。

食谱

1.基础培养基
试剂终浓度数量
高级 DMEM/F-12不适用500 毫升
肝素 (1 M)10毫米5毫升
GlutaMAX (200 毫米)
青霉素-链霉素 (10,000 U/mL)2毫米
100 单位/毫升5毫升
5毫升
全部的不适用515 毫升

2.膨胀介质
试剂终浓度数量
基础培养基不适用加满至 100 毫升
响应1
脑袋
B-27 补充剂 (50 × )
N-乙酰-L-半胱氨酸 (500 mM)
烟酰胺 (1 M)
Y-27632 (50 毫米)
A 83-01 (500 μ M)
SB 202190（10 毫米）
FGF-7（5微克/毫升）
FGF-10（100微克/毫升）
普莫星(50 毫克/毫升)
Heregulin β-1* (10 μM )10%
10%
1 ×
1.25毫米
10毫米
5微米
500纳米
1微米
5纳克/毫升
20 纳克/毫升
100微克/毫升
5纳米10毫升
10毫升
2毫升
250微升
1毫升
10微升
100微升
10微升
100微升
20微升
200微升
50微升
全部的不适用100 毫升
*仅用于类器官的初始推导（第一代）

3.远端分化培养基（DD培养基）
试剂终浓度数量
基础培养基不适用加满至 100 mL
地塞米松 (10 μ M )
8-溴-cAMP (100 mM)
IBMX (50 毫米)
B-27 补充剂 (50 × )
普莫星(50 毫克/毫升)
WNT3A*
CHIR99021* (10 毫米)50纳米
100微米
100微米
1 ×
100微克/毫升
50%
3微米500微升
100微升
200微升
2毫升
200微升
50 毫升
30微升
全部的不适用100 毫升
*添加 50% WNT3A 或 3 μM CHIR99021

4.近端分化培养基（PD培养基）
试剂终浓度数量
PneumaCult -ALI 基础培养基不适用450 毫升
PneumaCult -ALI 10 ×补充剂1 ×50 毫升
PneumaCult -ALI 维护补充剂 (100 × )
肝素 (2 毫克/毫升)
氢化可的松 (96 μg /mL)
DAPT (10 毫米)
普莫星 (50 毫克/毫升)
管道* # (1 M)1 ×

4微克/毫升
480 纳克/毫升
10微米_
100微克/毫升
2毫米5毫升

1毫升
2.5 毫升
500微升
1毫升
1毫升
全部的不适用510 毫升
*准备两个 PD 媒体，一个有 PIPES，一个没有
#对于带有 PIPES 的 PD 培养基，在添加 PIPES 后用 HCl 和 NaOH 将 pH 值调整至 6.6

5.Rspondin1条件培养基
a.准备选择培养基（500 mL DMEM + 60 mL FBS + 5 mL青霉素-链霉素 + 1.5 mL zeocin 选择试剂）。
b.准备生长培养基（500 mL DMEM + 60 mL FBS + 5 mL青霉素-链霉素）。
c.2培养箱中的选择培养基中的 T175 烧瓶中培养表达 Rspondin1 的 293T 细胞，并等待它们达到汇合。
d.在生长培养基中将细胞分成六个 T175 烧瓶，等待它们汇合。
e.去除生长培养基并在 50 mL 基础培养基（配方 1）中培养细胞 7 天。
f.收集培养基（即 Rspondin1 条件培养基）。以 300 x g离心5 分钟以沉淀细胞/细胞碎片，并通过 0.22 μm瓶顶真空过滤器过滤培养基。
g.将介质分装成小体积（~50 mL），并将它们储存在-80°C。

6.Noggin条件培养基
a.准备选择培养基（500 mL DMEM + 60 mL FBS + 5 mL p青霉素-链霉素+ 5 mL G418 硫酸盐）。
b.准备生长培养基（500 mL DMEM + 60 mL FBS + 5 mL 青霉素-链霉素）。
c.2培养箱中的选择培养基中的 T175 烧瓶中培养表达头蛋白的 HEK293 细胞，并等待它们达到汇合。
d.在生长培养基中将细胞分成六个 T175 烧瓶，等待它们汇合。
e.去除生长培养基并在 50 mL 基础培养基（配方 1）中培养细胞 7 天。
f.收集培养基（即 Noggin 条件培养基）。以 300 x g离心5 分钟以沉淀细胞/细胞碎片，并通过 0.22 μm瓶顶真空过滤器过滤培养基。
g.将介质分装成小体积（~50 mL），并将它们储存在-80°C。

7.WNT3A条件培养基
a.准备选择介质（500 mL DMEM + 60 mL FBS + 5 mL p enicillin-streptomycin + 625 μL zeocin）。
b.准备生长培养基（500 mL DMEM + 60 mL FBS + 5 mL 青霉素-链霉素）。
c.2培养箱中的选择培养基中的 T175 烧瓶中培养表达 Rspondin1 的 293T 细胞，并等待它们达到汇合。
d.在生长培养基中将细胞分成六个 T175 烧瓶，等待它们汇合。
e.将细胞分成 30 个 100 毫米的细胞培养皿（每盘 20 毫升），培养细胞 7 天。
f.收集培养基（即 WNT3A 条件培养基）。以 300 x g离心5 分钟以沉淀细胞/细胞碎片，并通过 0.22 μm瓶顶真空过滤器过滤培养基。
g.将介质分装成小体积（~50 mL），并将它们储存在-80°C。
致谢

香港大学李嘉诚医学院全景组学中心和电子显微镜组在共聚焦成像、流式细胞术和电子显微镜方面提供的帮助。这项工作部分得到了香港特别行政区政府食物及卫生局卫生与医学研究基金 (HMRF, 17161272 和 19180392) 对 JZ 的资助;香港特别行政区政府研究资助局一般研究基金（GRF，17105420）和合作研究基金（CRF，C7042-21G）给JZ； Health@InnoHK ，香港特别行政区政府创新科技署到KYY；以及香港养和医院、香港逸夫基金会、谭麦美妍、余伟强及余嘉玲、李运强慈善基金有限公司、许明、许海及周善兰慈善基金有限公司、陈妍的捐款Chuen Memorial Charient Foundation, Perfect Shape Medical Limited, Kai Chong Tong, Foo Oi Foundation Limited to KYY
该协议源自我们以前的出版物( Zhou 等人，2018 年；邱等，2022 ）。

利益争夺

JZ、KYY、MCC和CL被列为气道类器官专利（公开号：US-2021-0207081-A1）的发明人。 JZ、MCC、CL 和 KYY 是肺泡类器官临时专利（美国申请号：63/238,485）的发明人。其余作者声明没有竞争利益。

伦理

这项研究得到了香港大学/医院管理局香港西联网（UW13-364 和 UW21-695）的机构审查委员会的批准。从组织捐赠者那里获得了将其肺组织用于研究目的的知情同意书。

参考

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