材料和试剂
1. INRA 717-1B4 ( Populus tremula × Populus alba ) 杂交杨
2. 玻璃盘
3. 单刃刀片（ Personna ，目录号：94-120-71）
4. 直径 100 毫米和深 20 毫米的培养皿（Fisher Scientific，目录号：FB087511Z）
5. Magenta GA-7 植物培养箱（Fisher Scientific，目录号：50-255-176）
6. Basix TM聚苯乙烯血清移液器 10 mL（Thermo Scientific，目录号：14-955-234）
7. 50 mL 管（Thermo Scientific，目录号：339650）
8. 0.45 µm 过滤器（Millipore，目录号：SLHV004SL）
9. 圆底一次性玻璃培养管（10 mL）（Fisher Scientific，目录号：14-961-27）
10. 96孔黑色/透明底板（Thermo Scientific，目录号：165305）
11. 40 µm无菌细胞过滤器（Fisher Scientific，目录号：08-771-1）
12. Murashige和 Skoog (MS) 具有常量营养素和微量营养素的基础盐（Caisson Labs，目录号：MSP01）
13. MS 维生素溶液（Caisson Labs，目录号：MLV01）
14. MES 水合物（Thermo Scientific，目录号： H5672.36）
15. KOH（Fisher Scientific，目录号：M1064621000）
16. 蔗糖（Fisher Scientific，目录号： AA36508A1）
17. 活性炭（Sigma-Aldrich，目录号： C9157）
18. 凝胶赞TM CM（ Gelrite® ， Sigma -Aldrich，目录号： G1910）
19. 吲哚-3-丁酸（IBA）（ PhytoTech Labs，目录号： 1358）
20. Cellulase Onozuka TM R-10 (Yakurut Co., Cellulase Onozuka TM R-10)
21. Macerozyme TM R-10 (Yakurut Co., Macerozyme TM R-10)
22. D-甘露醇（Sigma-Aldrich，目录号： M4125）
23. KCl （Sigma-Aldrich，目录号： P3911）
24. CaCl 2 （Sigma-Aldrich，目录号： C4901）
25. NaCl（Fisher Scientific，目录号： BP358）
26. MgCl 2 （Fisher Scientific，目录号：AC223211000）
27. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）
28. 聚乙二醇 MW 6000（PEG）（Sigma-Aldrich，目录号：81260）
29. 去离子蒸馏水 (ddH 2 O)
30. 生根媒体（见食谱）
31. 细胞壁降解酶混合物（见食谱）
32. W5 解决方案（参见食谱）
33. MMg溶液（参见配方）
34. 40% PEG 溶液（见配方）
35. WI 解决方案（参见食谱）

设备

1. 生长室（Percival，型号：CU-36L4）
2. 豪塞尔 Scientific TM 3200 血球计数器（Fisher Scientific，目录号：02-671-54）
3. 微量移液器套装 0.5 – 10 µL、10–100 µL和 100–1,000 µL （康宁，目录号：4071、4073、4075 ）
4. 微量移液器吸头 0.1–10 µL、5–300 µL 和 100–1,000 µL（Fisher Scientific，目录号：02-707-454、02-707-447、02-707-408）
5. 水浴（Fisher Scientific，型号：等温度105)
6. 真空室（BVV，型号： GV3G）
7. 轨道摇床（Lab-Line，型号： 3520）
8. 离心机（ Thermo Scientific，型号： Sorvall TM RC 6+) 带摆动铲斗 (SH3000)
9. EVOS M7000 成像系统（Invitrogen，型号： AMF7000）

软件

1. ImageJ（美国国立卫生研究院， imagej.nih.gov ）

程序

A. 植物生长

1. 在 Magenta GA-7 植物培养箱中的固化生根培养基（参见食谱）中繁殖 717-1B4 杂交杨树的小型植物。
2. ° C 和 150 µmol/m 2 s 辐照度下，在 16:8 小时光/暗条件下控制的生长室中将植物生长约 1–2 个月。

B. 细胞壁降解酶混合物的制备

1. 如所述制备细胞壁降解酶混合物（参见食谱）。
2. 将溶液在 55°C 下加热 10 分钟，以降低缓冲液中可能存在的蛋白酶活性。将溶液储存在冰上。

C. 杨树健康叶片叶肉原生质体的分离

1. 从在洋红色盒子中生长的生根杨树克隆中收集完全展开的叶子（宽度 > 1 厘米，叶片长度 > 2 厘米）（图 2a）。
2. 在玻璃板上用锋利的单刃刀片将十片完全展开的叶子（预计恢复 ~7 × 10 6 个细胞）切成 2 毫米宽的切条。
3. 在 100 毫米深的培养皿中将叶条浸入 10 mL 的细胞壁降解酶混合物中。
4. 通过在 ~ 40 mmHg 压力下将真空室中的溶液抽真空 30 分钟，将酶溶液渗透到叶条中。关闭真空，但再保持压力 2.5 小时。
5. 慢慢释放真空。使用轨道摇床（~80 rpm）轻轻摇动混合物 10 分钟。同时，在冰上预冷 50 mL 管。
6. 将 10 mL 预冷的 W5 溶液（参见食谱）添加到细胞壁降解酶-叶条混合物中。用手轻轻摇晃混合均匀。
7. 将 40 µm 细胞过滤器放在冰上预冷的 50 mL 管上。将混合物通过细胞过滤器以从原生质体混合物中滤除细胞碎片。绿色流出物含有叶肉原生质体。
8. 取下细胞过滤器并关闭 50 mL 管的盖子。在 4 °C 下以 100 x g离心3 分钟，使细胞旋转。通过移液器去除上清液（~19.8 mL），然后留下带有剩余溶液（~0.2 mL）的绿色颗粒。
9. 添加 1 mL 的 W5 溶液并重新悬浮颗粒。将管置于冰上 30 分钟以进行细胞回收。
10. 同时，在显微镜下使用血细胞计数器对原生质体进行计数。将 10 μL 的细胞溶液滴在血细胞计上，然后覆盖滑动玻璃。使用 EVOS 成像系统估计细胞计数。
11. × g离心3 分钟来降低细胞重悬。完全去除 W5 溶液后，根据估计的细胞计数添加足够的MMg溶液（参见食谱），使最终浓度达到 1 × 10 3 个细胞/µL。

D. PEG介导的原生质体转化

1. 2 O将质粒稀释至最终浓度为 1 µg/µL 的纯质粒 DNA。
2. 将 100 µL 的原生质体溶液（1 × 10 5 个细胞）添加到玻璃培养管中。将 20 µL 质粒 (20 µg) 直接添加到原生质体中，而不会在移液过程中造成任何损失。轻敲质粒-原生质体混合物数次以混合。
3. 将 120 µL 40% PEG 溶液（参见食谱）添加到 120 µL 质粒-原生质体混合物中。将 PEG 溶液缓慢倒入原生质体溶液的表面，以防止 PEG 与质粒-原生质体预混合。 PEG 将平滑地淹没在质粒-原生质体混合物下方，并且将观察到 PEG 和质粒-原生质体混合物之间的清晰分离。一旦将 PEG 添加到所有混合物中，轻轻敲击几次，直到混合物全部呈绿色。混合物中 PEG 的最终浓度为 20%。
4. 在室温下将混合物孵育 15 分钟。通过向转化后的原生质体混合物中添加 500 μL 的 W5 溶液来停止孵育。请注意，为了足够稀释 PEG，需要至少添加两卷 W5 溶液（480 μL）。
5. 以 100 x g离心3 分钟，使转化的原生质体旋转下来。完全去除上清液而不与原生质体颗粒有任何接触。
6. 用 150 µL WI 溶液（参见食谱）重悬原生质体颗粒并轻敲。
7. 将原生质体-WI 悬浮液转移到 96 孔光学微孔板中。盖上盖子，然后在室温下避光孵育板。

E. 荧光感应和图像分析

1. 请注意，根据荧光种类和实验目的，荧光可以在 12 小时至一周后在原生质体细胞中检测到。对于合成启动子筛选，建议孵育 48 小时。
2. 为了观察转化的原生质体中的合成启动子活性，我们通过使用 EVOS 7000 图像系统扫描 96 孔板来测量荧光。将孵育的 96 孔板放在 Evo 图像分析仪的板架上。
3. 将阅读模式设置为 96 孔板。选择用于绿色荧光蛋白 (GFP)、红色荧光蛋白 (RFP) 和明场图像的过滤器集。
4. 在具有最佳参数的 10× 物镜设置下拍照。使用这些图像计算转化效率和启动子活动。
5. 要从图像中计算荧光表达的原生质体，请使用集成在 ImageJ 软件中的自动选项。在菜单栏中转换时，通过转到编辑/选项/转换以缩放，将彩色图像转换为黑白格式。然后，通过选择图像选项将图像类型转换为 16 位灰度。
6. 单击具有所需阈值参数的单元格的图像/调整/阈值。对所有图像使用此阈值设置。然后，通过菜单中的分析/分析粒子选项分析粒子。收集计数和粒子信息以供进一步分析。对每个质粒进行三次重复转化以进行统计分析。

图 1. 杨树原生质体分离方案，然后将合成启动子基因构建体转化为制备好的原生质体

数据分析

杨树叶肉原生质体转化

细胞壁消化的杨树叶肉原生质体比拟南芥叶和体细胞培养的大豆和马铃薯的原生质体小（图 2b）。估计的原生质体细胞计数在6 × 10 6 –7 × 10 6范围内三种不同提取物中的细胞（数据未显示）。图 2c 显示了原生质体中不同荧光图像的代表性总结，该质粒使用含有由 2× 短 35S 花椰菜花叶病毒 ( CaMV ) 启动子驱动的 RFP 的质粒，以及在室温下孵育 48 小时后由设计的合成启动子表达的 GFP（图2c). RFP 和 GFP 荧光可以清楚地区分覆盖在单个原生质体上。转化效率通常高达 70%，这是由使用 20 µg 质粒的 RFP 表达细胞计数超过原生质体细胞总数决定的。

图 2.瞬态质粒转化后分离的杨树叶肉原生质体和荧光表达的代表性图像。 a) 用于叶切片以分离叶肉原生质体的生根培养基中的杨树克隆。植物生长两个月以收集适合原生质体分离的叶片。 b) 在纤维素酶溶液中真空浸润 3 小时后分离的原生质体图像。 c) 在 PEG 介导的含有 35S 驱动的 RFP 和合成启动子驱动的 GFP 的 20 µg 质粒转化后 48 小时孵育后分别拍摄 GFP、RFP 和明场图像。合并图像由 EVOS M7000 成像系统基于叠加在单个帧上的荧光和明场图像生成。条形显示 100 µm。

使用图像分析仪通过荧光检测进行合成启动子分析

通过用单个合成启动子替换启动子区域，总共生成了 19 种不同的质粒（图 3a；由于利益冲突，未列出确切的合成启动子序列）。绿色 GFP 代表每个合成启动子对在 0.5 M 甘露醇中孵育引起的渗透压的应激诱导能力（Yang 等人，2021）。与最初建立的杨树叶肉原生质体分离程序相比，这里使用减少 30% 的纤维素酶和 2 小时更长的真空渗透持续时间来分离原生质体（Guo et al., 2014）。在室温下孵育 48 小时后筛选荧光蛋白。这些图像是从相同的转化原生质体中收集的成对的 RFP 和 GFP 表达（图 3b）。我们在整个转化的原生质体中观察到 RFP 表达，确认当前质粒组向原生质体的转化是按照本协议成功进行的（图 3b）。在筛选合成启动子活性时，观察到各种范围的表达 GFP 的原生质体，这意味着我们可以通过渗透胁迫处理来区分不同的合成启动子激活的 GFP 表达。 GFP 表达的原生质体计数与 RFP 表达的原生质体计数的比率决定了 19 种合成启动子的合成启动子活性（图 3c）。

图 3.通过渗透压诱导型合成启动子驱动的荧光蛋白诱导筛选合成启动子的比较图像。 a) 用于原生质体转化的质粒结构布局。启动子区域被替换为来自 19 个启动子中每一个的合成启动子。这些是从我们的实验室采用的，并从 A 到 S 随机标记。b) 荧光图像以筛选含有不同合成启动子驱动 GFP 和 35S 驱动 RFP 的质粒构建体的杨叶肉原生质体。 RFP 用作内部控制以确定转化率。 GFP 诱导能力通过在 0.5 M 甘露醇溶液中孵育 48 小时来确定。条形显示 100 µm。 c) 基于由合成启动子驱动的 GFP 表达原生质体细胞计数的荧光表达比图优于 RFP 对照表达，显示质粒向原生质体的可靠转化。表达这两种荧光蛋白的原生质体由 ImageJ 计数，如程序部分 E 部分所述。条形显示 GFP 表达的原生质体与 RFP 表达的细胞计数比率的平均值。误差棒显示了每个质粒的三个原生质体转化重复的比率百分比的标准偏差。

食谱

1. 生根媒体
a. 将 4.43 克 MS 基础盐与常量营养素和微量营养素、1× MS 维生素溶液、0.5 克 MES 水合物、30 克蔗糖、5 克活性炭和 1.5 克 Gelzan TM溶解 1 L ddH 2 O中的 CM。
b. 用 1 M KOH 将 pH 值调节至 5.7。
c. 高压灭菌解决方案。
d. 介质温度下降后，在介质中添加 100 μL 的 IBA（1 mg/mL 的库存溶液）。
e. 将50 mL 的介质倒入每个洋红色 GA-7 盒中，让其完全凝固。

2. 细胞壁降解酶混合物
a. 溶解 0.2 g 纤维素酶Onozuka TM R-10 和 0.08 g Macerozyme TM R-10 的缓冲溶液包括 1 mL 0.2 M MES 水合物 (pH 5.7)、5 mL 0.8 M D-甘露醇和 100 µL 2 M KCl 。
b. 将溶解的溶液在 55°C 下孵育 10 分钟。然后，在冰上冷却至少 5 分钟。
c. 添加 100 µL 的 1 M CaCl 2和 100 µL 的 10% BSA。
d. 可选择通过 0.45 µm 过滤器对酶溶液进行消毒。

3. W5解决方案
将 2 mL 的 0.2 M MES（pH 值 5.7）、6.16 mL 的 5 M NaCl、25 mL 的 1 M CaCl 2和 500 μL 的 2 M KCl与166.34 mL 的 ddH 2 O混合。

4. MMG溶液
将 5 mL 的 0.8 M D-甘露醇、150 μL 的 MgCl 2和 200 μL 的 0.2 M MES 水合物（pH 值 5.7）与 4.65 mL 的 ddH 2 O混合。

5. 40% PEG 溶液
在转换前准备 40% PEG 解决方案。
将 4 克 PEG 溶解在混合物中，包括 2.5 mL 的 0.8 M D-甘露醇、1 mL 的 1 M CaCl 2和 3 mL 的 ddH 2 O。如果 PEG 完全溶解，则溶液体积的总体积为10毫升。

6. WI解决方案
混合 6.25 mL 的 0.8 M D-甘露醇、200 μL 的 0.2 M MES（pH 7.5）、100 μL 的 2 M KCl和 3.45 mL 的 ddH 2 O。

致谢

这项工作得到了美国能源部科学办公室 (DE-SC0018347) 生物和环境研究的资助。本协议中的原生质体分离方法由 Guo 等人修改。 (2012)。质粒构建体采用作者未发表的工作。作者感谢我们实验室的技术人员和学生对这项工作的支持和贡献。

利益争夺

C. Neal Stewart Jr. 是田纳西大学研究基金会指定的合成启动子和生物技术知识产权的发明人。

参考

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