材料和试剂
1. 移液器过滤器吸头 [ Sarstedt ，目录号：70.3010.275 (10 μL )，70.3030.265 (20 μL ), 70.3030.375 (100 μL ), 70.3030.110 (200 μL ), 70.3060.275 (1,000 μL )]
2. 1.5 m L管（Eppendorf，目录号：0030 120.086）
3. 2.0 m L管（Eppendorf，目录号：0030 120.094）
4. 200微升 PCR 板（ Sarstedt ，目录号：72.1980.202）
5. 200 μL PCR 管（ Neolab ，目录号：7-5207）
6. 琼脂糖（ Biozym ，目录号：840004）
7. 100 bp DNA ladder（ Thermo Fisher，目录号：5628019）
8. 基因标尺 1 kb Plus DNA 阶梯（ Thermo Fisher，目录号：SM1331）
9. AMPure XP 珠子（ Beckman Coulter，目录号：A63881）
10. 磁珠_ MyONE TM链霉亲和素 C1（Thermo Fisher，目录号：65001）
11. 无核酸酶水（Sigma，目录号：3098）
12. 乙醇（Carl Roth，目录号：P075.1）
13. Tris（Carl Roth，目录号：5429.2）
14. HCl （Carl Roth，目录号：9277.2）
15. NaOH （Carl Roth，目录号：P031.2）
16. EDTA · 2H 2 O（Carl Roth，目录号：8043.3）
17. NaCl （Carl Roth，目录号：3957.4）
18. PEG 8000（Sigma，目录号： 89510-250G-F）
19. 人类CD34 + 微珠试剂盒（ Miltenyi Biotec ，目录号：130-046-702)
20. Ficoll-Paque Plus（GE Healthcare，目录号：17144002）
21. 无血清StemSpan TM SFEM II 培养基（ Stemcell ，目录号：09655）
22. 人类 SCF（ PeproTech ，目录号：300-07）
23. 人类 TPO（ PeproTech ，目录号：300-18）
24. 人 FLT3L（ PeproTech ，目录号：300-19）
25. 人 IL-6（ PeproTech ，目录号：200-06）
26. UM171（干细胞，目录号：72912）
27. StemRegenin 1（SR1）（干细胞，目录号：72342）
28. AAV6系统（ Cell Biolabs ，目录号： VPK-410-SER6）
29. 快速文摘 NotI （赛默飞世尔，目录号： FD0593）
30. CrRNA (IDT)
31. Alt -R ® CRISPR-Cas9 tracrRNA （IDT，目录号：1072534）
32. Alt- R® 斯普。 Cas9 D10A 切口酶V3（IDT，目录号：1081063）
33. P3 原代细胞 4D-Nucleofector TM X 试剂盒 L（ Lonza ，目录号：V4XP-3012）
34. 死细胞去除试剂盒（ Miltenyi Biotec ，目录号：130-090-101)
35. KOD 热启动 DNA 聚合酶（Merck Millipore，目录号：71085）
36. NucleoSpin凝胶和 PCR 清理（ Macherey -Nagel，目录号： 740609.50）
37. 核键 Xtra Maxi 套件（ Macherey -Nagel，目录号： 740414.50 ）
38. GenFind V3 试剂盒（ Beckman Coulter，目录号： C34880）
39. Illumina Tagment DNA TDE1 酶和缓冲液试剂盒（Illumina，目录号： 20034197 ）
40. 酵素 DNA clean and concentrator-5（ Zymo research，目录号： D4003）
41. 总理之星 GXL 聚合酶（Takara，目录号： R050B ）
42. 量子比特 dsDNA HS 测定试剂盒（Thermo Fisher，目录号：Q32851）
43. 高灵敏度 D1000 ScreenTape测定（安捷伦，目录号：5067）
44. QIA快凝胶提取试剂盒（ Qiagen ，目录号：28704）
45. T4 DNA 连接酶（ NEB ，目录号：M0202 ）
46. 六氨合钴(III) 氯化物（ HexCo ）（Sigma，目录号：481521-25G）
47. 无血清冷冻培养基 BAMBANKER（Nippon Genetics，目录号：5802）
48. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（Thermo Fisher，目录号： 20012027）
49. Platinum Taq聚合酶（ Thermo Fisher，目录号： 15966005）
50. Nextera公司 XT 索引试剂盒 v2 组 A（Illumina，目录号：FC-131-2001）
51. 5 M四甲基氯化铵溶液 (TMAC)（ Sigma，目录号： T3411-500ML）
52. 凝胶上样染料，橙色（6 × ）（NEB，目录号：B7022S）
53. Q5高保真DNA 聚合酶（NEB，目录号：M0491S）
54. Wizard基因组 DNA 纯化试剂盒（ Promega ，目录号：A1120）
55. ProNex公司尺寸选择性纯化珠（ Promega ，目录号：NG2001）
56. 高灵敏度 DNA生物分析仪试剂盒（安捷伦，目录号：5067-4626）
57. TOP10 细菌（Invitrogen，目录号：C404003）
58. LB 琼脂粉（Invitrogen，目录号：22700025）
59. 羧苄青霉素（Sigma，目录号：C1613-1ML）
60. T4 DNA 连接酶（NEB，目录号：M0202M）
61. P3 原代细胞电穿孔缓冲液（参见配方）
62. 完整的无血清StemSpan TM SFEM II 培养基（参见配方）
63. 70% 乙醇（见食谱）
64. 50% ( wt / vol ) PEG 8000（参见配方）
65. 5 M NaCl （见食谱）
66. 2.5 N NaOH （见配方）
67. 0.5 M EDTA（见食谱）
68. 1 M Tris-HCl (pH 7.4)（参见配方）
69. 1 M Tris-HCl (pH 8.0)（参见配方）
70. 1 × TE 缓冲液 (pH 8.0)（参见配方）
71. 黑白缓冲区（参见食谱）
72. 20毫米六氨合钴(III) 氯化物（见食谱）
73. 50 mM桥接适配器（参见食谱）
74. dsODN (IDT)的正向和反向寡核苷酸（表 1）。
75. 底漆 (Eurofins)（表 1）

表 1.寡核苷酸和引物
姓名顺序
dsODN-转发 5′-PG*T*TTAATTGAGTTGTCATATGTTAATAACGGT*A*T-3′
dsODN-反向 5'-PA*T*ACCGTTATTAACATATGACAACTCAATTAA*A*C-3'
I5-Nextera-3' - GSP (-) TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGTTTAATTGAGTTGTCATATGTTAATAACGGT公司
I5-Nextera-5' - GSP (+) TCGTCGGCAGCGTCAGATGTTATAAGAGAGATACCGTTATTAACATATGACAACTCAATTAA公司
I7-Nextera-反向 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAG
下桥 GCGACTATAGGGCACGCGTGGNNNNNN[AmC3]
上桥 [磷]CCACGCGTGCCCTATAGTCGC[AmC3]
U2-C-适配器 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNGACTATAGGGCACGCGTGG
U1-C-基因特异性 TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGACAGNNNNN[基因特异性]
FC1-i5-U1 (N501) AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC塔格特克TCGTCGGCAGCGTC
FC2-i7-U2 (N701) CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT tcgcctta GTCTCGTGGGCTCGG公司

设备

1. 96 孔磁铁支架（ Thermo Fisher，目录号：AM10027）
2. 6 孔磁铁架（ Cytiva ，目录号：28948964 ）
3. 组织培养 6 孔板（ Sarstedt ，目录号：83.3920）
4. 组织培养 12 孔板（ Sarstedt ，目录号：83.3921）
5. 冷冻小瓶（ Sarstedt ，目录号：72.380.992）
6. 16 孔核比色皿条（ Lonza ，目录号：V4XP-3032）
7. Lonza 4D-Nucleofector（ Lonza ，目录号： AAF-1003B ）
8. 移液器（吉尔森）
9. 多通道移液器 (Eppendorf)
10. PCR热循环仪（Eppendorf，目录号：6331000017）
11. 纳米液滴（赛默飞世尔）
12. 热混合器（Eppendorf）
13. 旋涡仪（科学产业）
14. 离心机（Eppendorf）
15. 组织培养箱设置在 37 °C，5% CO 2 （粘合剂）
16. 录音机（安捷伦，目录号：G2991BA）
17. Qubit 2.0荧光计（Invitrogen，目录号：Q32866）
18. 化学博士 XRS 凝胶成像系统（Bio-Rad）
19. 标准紫外透照仪（Cleaver Scientific）
20. TC20自动细胞计数器（Bio-Rad，目录号：1450102）
21. 管辊（ Starlab ，目录号：N2400-7010）
22. 2100 BioAnalyzer仪器（Agilent，目录号：G2939BA）

软件

1. 脆金（MDC， https://crisprgold.mdc-berlin.de ）
2. R 4.0.3 编程语言（R-project， https://www.r-project.org/ ）
3. R-studio 集成开发环境（R-studio, https://www.rstudio.com/ ）
4. GelAnalyzer 19.1 凝胶密度测定软件（ GelAnalyzer ， http://www.gelanalyzer.com/?i=1 ）
程序

A. 设计间隔缺口sgRNA

注意：为了测试sgRNA的基因编辑效率，您可以选择适合您实验室的任何可用系统，例如 T7EI（T7 核酸内切酶 I）或 ICE 分析后的 Sanger 测序。此外， sgRNA可以作为一对寡核苷酸订购，克隆到表达载体中，并在人类细胞系（如 HEK293T）中进行测试。您还可以订购合成sgRNA ，生成 Cas9 核酸酶和合成sgRNA的预组装核糖核蛋白 (RNP) 复合物，并对 PCR 扩增子进行体外 T7EI 测定。
1. 定义 5 '和 3 '侧翼突变热点的区域（图 1），间隔距离为 200 – 350 bp。

图 1. 间隔缺口sgRNA的设计池。显示间隔距离为 200-350 bp的选定区域的方案，位于突变的侧翼。 5 '和 3 '池设计了 PAM 位点配置朝外（PAM-out）的sgRNA 。

2. CrispRGold软件使用 PAM 输出配置在选定区域设计sgRNA池。结合Cas9 D10A 切口酶, 5 ' sgRNA对正链进行切割，而 3 ' sgRNA会在 dsDNA 分子的相反链上刻上缺口。
3. 订购设计的sgRNA ，将它们克隆到合适的质粒中，并在 ICE 分析后使用 T7EI 测定或 Sanger 测序测试这些sgRNA的基因编辑效率。
4. 选择几对 PAM-out sgRNAs （一个 5 ' sgRNA和一个 3 ' sgRNA ) 具有相同且高的基因编辑效率 (>80%)，用于间隔缺口基因修复方法。

B. 设计DNA 供体模板

注意：为了量化基因校正效率，我们通过将沉默突变引入正确序列或开发正确的整合 PCR 来插入诊断限制酶位点，这使我们能够放大修复和未修复的等位基因。为了将 DNA 供体片段克隆到 AAV 基因组载体中，我们将NotI位点连同六个随机核苷酸插入到 DNA 供体片段的两端。
1. '和 3 '的 DNA 供体模板每个切口位点外至少有 0.5 – 1.5 kb 的HA （图 2）。
2. 为了最小化两个切口位点之间的微型同源序列（以绿色突出显示；图 2），我们通过引入沉默突变（在修复编码外显子中的突变的情况下）或通过部分消融该序列（在将 cDNA 插入基因座）。

图 2. 设计 DNA 供体模板。显示携带 5 '和 3 '同源臂的DNA 供体模板配置的方案，两侧是用于基因校正的修饰序列（标记为绿色）和两端的NotI位点，用于克隆到pAAV载体中。

3. 将NotI限制酶位点添加到 DNA 供体模板的两端。
4. 从 IDT 订购 dsDNA 模板。

C. 间隔缺口 RNP 的生成

sgRNA和 Cas9 D10A的数量用于 20 μL电穿孔反应的切口酶。对于 100 μL电穿孔的反应，按比例放大。
1. 订购 crRNA、 tracrRNA和 Cas9 D10A 来自 IDT 的切口酶。
2. 在 PCR 管中以 1:1 的摩尔比混合 20 μL的每个 crRNA (100 pmol ) 和 20 μL的tracrRNA (100 pmol )来生成sgRNA复合物。
3. 将混合物在 95°C 下孵育5 分钟，然后在热循环仪中以 1°C/s 的速率降至室温。
4. sgRNA复合物储存在 -20 °C 最多六个月或 -80 °C 最多一年。
5. 2 μL的sgRNA （100 pmol ）与 0.75 μL的 Cas9 D10A混合来生成 RNP 复合物 以 2:1 的摩尔比在 PCR 管中加入切口酶（~50 pmol ），并在 25 °C 下在热循环仪中孵育混合物 10 分钟。
注意：组装的 RNP 应在使用前新鲜制作。

D. AAV6 供体载体的生产和纯化

注意：我们建议使用高保真 KOD 热启动 DNA 聚合酶对 DNA 供体模板进行 PCR 扩增。但是，您可以使用实验室中可用的任何高保真 DNA 聚合酶。 AAV6 供体载体的生产和纯化在我们之前的方案中有详细描述（Tran 等人，2020）。
1. 高保真DNA 聚合酶，用特定的正向和反向引物（携带六个随机核苷酸、 NotI位点和目标特定序列）放大包含NotI 的 dsDNA 供体模板（步骤 B4）。
2. NucleoSpin凝胶和 PCR 清理试剂盒纯化 PCR 产物。
3. NotI限制酶消化 PCR 产品，并在 0.8% 琼脂糖凝胶上加载。
4. 切割消化的 dsDNA 条带并使用任何凝胶提取试剂盒对其进行纯化。
5. 使用 T4 DNA 连接酶将纯化的 dsDNA 模板克隆到NotI线性化的pAAV载体中。
6. 使用热休克法将克隆的pAAV载体转化为感受态 TOP10 细菌。
7. μg /mL羧苄青霉素的 10 厘米 LB 琼脂培养皿上传播转化细菌，并在 30 °C的细菌培养箱中培养这些培养皿过夜。
8. 在 30 °C 的温度下，用含有 50 μg /mL卡比西林的 2 mL 液体 LB 培养基接种细菌菌落并接种这些菌落。
9. 使用任何质粒纯化试剂盒提取质粒并通过 Sanger 测序确认插入。
10. 使用NucleoBond生产大量pAAV供体载体 Xtra Maxi 套装。
11. (Tran ) 转染、纯化、浓缩和计算 AAV6 供体颗粒的拷贝数等人，2020）。

E. 培养人类 HSPC

注意：为了实现人CD34 +细胞的充分扩增，我们建议您培养~4 × 10 5 HSPCs 每 2 mL 在 6 孔板的孔中，每天监测培养，直到这些细胞用于电穿孔。如果扩增的细胞密度较高，您应该将它们分装到 6 孔板的新孔中。
1. Ficoll-Paque Plus从健康供体或患者的动员外周血或骨髓中分离人 CD34 + HSPC，并根据制造商的协议遵循人 CD34 +微珠套件。
2. 在无血清冷冻培养基 (BAMBANKER) 中以每毫升 1 × 10 6的密度冷冻分离的CD34 + HSPC ，并储存在液氮中以便长期储存。
3. 解冻冷冻小瓶并在 6 孔板的孔中以每 2 mL 完全无血清StemSpan TM SFEM II 培养基 4 × 10 5 个的密度培养 CD34 + HSPC 。
4. 培养 24 小时后用新培养基交换一半的旧培养基。
5. 培养后 72 小时，收获扩增的HSPC 并使用 TC20 细胞计数系统计数细胞数。
6. 将 2 × 10 5 个HSPC 转移到 1.5 mL Eppendorf 管中并以 300 ×离心克5 分钟。
7. 去除上清液，用室温 PBS 洗涤细胞沉淀两次，然后进行 F 部分或 G 部分。

F. Tn5 介导的 GUIDE- seq的RNP和dsODN电穿孔

注意：通过将 1 mL完整的无血清StemSpan TM SFEM II 培养基添加到 12 孔板的孔中，制备 1 mL预热培养基，并在电穿孔前将其放入 37 °C 的培养箱中。对于长期储存，退火的dsODN应储存在 -80 °C。
1. 如前所述订购dsODN的正向和反向寡核苷酸（Tsai 等人，2015 年）来自 IDT 。
2. 通过混合 50 μL的每个寡核苷酸（100 pmol ）来退火两个dsODN寡核苷酸，在 95 °C 下孵育 5 分钟，并在热循环仪中以 1 °C/s 的速率降至室温。
3. 在步骤 E7 中用 PBS 最后一次清洗后，去除上清液，并通过上下吹打10 次，用 20 μL P3原代细胞电穿孔缓冲液重悬细胞沉淀。
4. 将 2.75 μL的 5 '和 3 '组装 RNP（步骤 C5）和退火dsODN的 0.5 μL （25 pmol ）添加到细胞悬浮液中，并通过上下吹打五次来充分混合。
5. 将混合物转移到 16 孔核比色带的孔中。
6. Lonza 4D-Nucleofector的 DZ-100 程序对细胞进行电穿孔。
7. 电穿孔细胞转移到预热的无血清StemSpan TM SFEM II 培养基中。
8. 2的培养箱中。
9. 2-3天更换一次培养基。
10. 在电穿孔后第 10 天，通过上下吹打五次来收获编辑过的 HSPC，将细胞悬浮液转移到 15 mL Falcon 管中，并以 300 × 克5 分钟。
11. 用室温 PBS 洗涤细胞沉淀 3 次。
12. 使用死细胞清除套件耗尽死细胞并遵循制造商的规范。
13. 根据制造商的协议使用GenFind V3 试剂盒分离gDNA 。
14. 使用NanoDrop测量gDNA的浓度并将gDNA稀释至 20 ng/ μL 。
15. 在 0.8% 琼脂糖凝胶上加载 500 ng gDNA来检查 gDNA 的质量（图 3），然后继续进行 H 部分。
注意：为了获得良好的 Tn5 介导的 DNA标记效果，我们建议使用GenFind V3 试剂盒进行gDNA分离。该试剂盒可产生高质量的gDNA ，DNA 片段大小 >20 kb（图 3）。但是，您也可以使用您实验室提供的具有同等质量的其他gDNA分离试剂盒。

图 3.基因组 DNA 的质量控制。将样品 #1 和 #2 的500 ng gDNA加载到 0.8% 琼脂糖凝胶上。基因标尺 1 kb Plus DNA ladder用作标记。 gDNA片段的最佳长度为 >20 kb。

G. LAM-HTGTS 的RNP电穿孔和 AAV6 感染

注意：我们通常以 1 ×的 MOI 使用 rAAV6 供体载体感染电穿孔HSPC 10 5基因组拷贝/细胞。较高的 MOI 会导致细胞死亡；我们建议仔细滴定您的rAAV供体颗粒。
1. 在步骤 E7 最后一次用 PBS 洗涤时，去除上清液并重悬 2 × 10 5 HSPCs 与 20 μL P3 Primary Cell电穿孔缓冲液，上下吹打 10 次。
2. 将 2.75 μL的 5 '和 3 '间隔缺口 RNP（步骤 C5）添加到细胞悬浮液中，并通过上下吹打五次来充分混合。
3. 混合物转移到 16 孔核比色带的孔中。
4. 电穿孔使用Lonza 4D-Nucleofector的 DZ-100 程序的细胞。
5. 电穿孔细胞转移到预热的完整无血清StemSpan TM SFEM II 培养基中。
6. 将盘子放入 37°C 和 5% CO 2的培养箱中。
7. 电穿孔细胞的孔中， MOI 为 1 × 10 5 基因组拷贝/细胞。
8. 在 AAV 感染后 6-8 小时，用新完成的无血清StemSpan TM SFEM II 培养基更换一半培养基。
9. 2-3天更换一次培养基。
10. 通过上下吹打 5 次收集细胞，将细胞悬液转移至 15 mL Falcon 管中，并以 300 × 克5 分钟。
11. 用室温 PBS 洗涤细胞沉淀 3 次。
12. 制造商的规格使用死细胞去除套件去除死细胞。
13. 分离gDNA （参见步骤 F15 的说明）并继续进行第 I 部分。

H. Tn5 转座酶介导的 GUIDE- seq

注意：准确浓度的gDNA对于可重现的 Tn5 介导的标记化至关重要。我们描述了一个 Tn5 标记的 DNA 协议，用于恰好 100 ng 的gDNA 。如果您想对多于或少于 100 纳克的gDNA执行协议，则应优化这些条件。 Tn5 介导的 DNA标记应产生 300 – 1,500 bp范围内的 DNA 片段。如果 DNA 片段小于或大于此，您应该分别减少或增加标记的孵育时间。重要的，您必须在室温下进行 Tn5介导的 DNA标记；不要使用涡流混合。本协议中使用的底漆与Tran 等人中描述的相同。 (2022) 。
1. 将以下试剂逐步添加到 8 孔 PCR 条的孔中：

表 1. Tn5 介导的ed DNA标记
脚步试剂体积 (µL)
1个无核酸酶水 3个
2个 gDNA (20 ng/µL)（F 部分） 5个
3个 2 × TD缓冲器 10
4个 TDE1 (Tn5) 酶 2个
全部的 20

2. 上下吹打 10 次，避免气泡，小心混匀。
3. 关闭PCR 条并在 280 × g下短暂离心30 秒。
4. 孵育PCR 条 7 分钟。
5. 将PCR 条转移到冰上。
6. 根据制造商的协议，使用Zymo DNA clean 和 concentrator-5清理Tn5 标记的 DNA 片段。
7. µ L 无核酸酶水洗脱tagmented DNA 片段。
8. 通过在 1.2% 琼脂糖凝胶上加载 3 μ L的洗脱液（参见图 4）来检查tagmented DNA 片段的质量，然后继续执行步骤 H9。

图 4.标记DNA 片段的验证。琼脂糖凝胶分析显示用 (+) 或不用 (-) Tn5 转座酶处理的gDNA片段化。 Tn5 介导的标记应产生 ~0.3 – 1.5 kb范围内的 DNA 片段（用白色虚线标记）。

9. 根据表 2 在 96 孔板的孔中准备第一个 PCR 。

表 2. 扩增dsODN标记的扩增子
试剂体积 (µL)
10 ×缓冲液（不含 MgCl 2 ） 3个
氯化镁2 , 50毫米 1.2
dNTP 混合物，10 mM 0.6
Platinum Taq聚合酶（5 U/ µL ） 0.3
TMAC (0.5 M) 1.5
I5-Nextera-3 ′ -GSP (-) 或 5 ′ -GSP (+)-forward (10 μ M ) 1.5
I7-Nextera-reverse (10 μ M ) 0.75
标记DNA（步骤 H7） 10
无核酸酶水 11月15日
全部的 30

10. ×旋转平板 g 1 分钟。
a. 在以下条件下使用着陆程序在热循环仪上运行板：
b. 95 °C 5 分钟。
c. 15 个周期 [95 °C 30 秒，70 °C（-1 °C/周期）2 分钟，72 °C 30 秒]。
d. 10 个循环（95°C 30 秒，55°C 1 分钟，72°C 30 秒）。
e. 72 °C 5 分钟。
f. 4 °C 保持。
11. AMPure XP 珠子（1.2 × ；每 1 μL样品1.2 μL珠子）纯化和清理 PCR 产物，如下所示：
a. 将 36 μL AMPure XP微珠添加到 PCR 反应中。
b. μL多通道移液器上下移液 15 次，混合均匀。
c. 将 PCR 板在室温下孵育 5 分钟。
d. 将 PCR 板放在 96 孔磁性支架上 5 分钟或直到溶液澄清。
e. 使用多通道移液器去除上清液。
f. 将 PCR 板从磁力架中取出，向珠子中加入 200 μL新鲜制成的 70% 乙醇，并通过上下吹打混合。
g. 将盘子放在磁力架上 2 分钟，然后去除上清液。
h. 再重复一次步骤 f–g。
i. 让珠子风干 3-5分钟。
j. 将板从磁力架中取出，加入 18 μL无核酸酶水，混合磁珠，室温孵育 2 分钟。
k. 将盘子放在磁力架上 5 分钟。
l. 将 15 μL的洗脱 DNA 转移到 96 孔 PCR 板的新孔中，然后继续执行步骤 H12。
12. 根据表 3，在 96 孔板的孔中准备第二个索引 PCR 。

表 3. 索引 PCR 片段
试剂体积 (µL)
无核酸酶水 2.4
10 × Platinum Taq Mg 2+游离缓冲液 3个
50毫摩尔Mg 2+ 1.2
Platinum Taq (5 U/ μL ) 0.3
dNTP 10毫米 0.6
TMAC (0.5 M) 1.5
Nextera-I5 条形码引物 (10 μ M ) 3个
Nextera-I7 条形码引物 (10 μ M ) 3个
第一个PCR 产物 15
全部的 30

13. 在以下条件下使用着陆程序在热循环仪上运行板：
a. 95 °C 5 分钟。
b. 15 个周期 [95 °C 30 秒，70 °C（-1 °C/周期）2 分钟，72 °C 30 秒]。
c. 10 个循环（95°C 30 秒，55°C 1 分钟，72°C 30 秒）。
d. 72 °C 5 分钟。
e. 4 °C 保持。
14. AMPure XP 微珠（0.7 × ，见上文）纯化和清理 PCR 产物。
15. 用 30 µL 1 × TE 缓冲液 (pH 8.0)洗脱PCR 产物。
16. 通过在 1.5% 琼脂糖凝胶上加载 3 µL 洗脱液来验证PCR 产品的大小（图 5）。

图 5. 5 '和 3 '富集PCR 产物的验证。琼脂糖凝胶分析显示 5 ' （左）和 3 ' （右）富集的 PCR 产物。 PCR 产物的大小范围约为 0.3 – 1.5 kb。

17. 按照制造商的规格使用 Qubit dsDNA HS 高灵敏度试剂盒测量 DNA 浓度。
18. 根据大小和浓度计算每个 DNA 文库的摩尔量。
19. 将等摩尔量的每个 DNA 文库混合到 2 mL Eppendorf 管中。
20. AMPure XP 微珠（0.9 × ，见上文）清洁并浓缩汇集的 DNA 文库。
21. μL无核酸酶水洗脱合并的 DNA 文库。
22. 保存 2 μL洗脱液用于最终质量控制。
23. 将 35 μL合并的 DNA 文库与 7 μL橙色凝胶上样染料( 6 × )混合。
24. 将混合物加载到1.2% 琼脂糖凝胶的两条车道（每条车道21 μL ）上。
25. 将 4 μL的 100 bp DNA 梯子加载到样品通道两侧的左右通道上。
26. 在 120 V 下运行凝胶 30 分钟。
27. 在标准 UV透射仪下，切出 350 – 1,000 bp范围内的条带（图 6）。

图 6. 最终文库大小选择前后。显示大小选择前后 DNA 文库的琼脂糖凝胶图像。切下大小范围 (0.35 – 1.0 kb) 的 DNA 片段并从凝胶中提取 DNA。

28. QIAquick提取 DNA 遵循制造商规格的凝胶提取套件。
29. 用 100 μL无核酸酶水洗脱 DNA 。
30. 将两条泳道汇集到一个 2 mL Eppendorf 管中。
31. AMPure XP beads (0.9 × )清理并浓缩最终的 DNA 文库。
32. 用 30 μL的 1 × TE 缓冲液 (pH 8.0)洗脱 DNA 。
33. 按照制造商的规格，使用 Qubit dsDNA 高灵敏度试剂盒测量最终 DNA 库的 DNA 浓度。
34. ScreenTape套件（图 7）验证洗脱 DNA（步骤 H22）和最终 DNA 文库（步骤 H32）的大小范围。

图 7.最终 DNA 文库的TapeStation分析。 TapeStation分析验证最终 DNA 文库的长度。 DNA 文库的大小范围约为 300 – 1,000 bp ，峰值为 541 bp。

35. 计算最终 DNA 文库的摩尔量。
36. 用 1 × TE 缓冲液 (pH 8.0)将最终的 DNA 文库稀释至 4 nM 。
37. 继续进行 Illumina 深度测序。

I. 林-HTGTS

注意：低分子量 DNA 片段（<1 kb）的污染会抑制 LAM-HTGTS；因此，通过使用ProNex大小选择性纯化微珠清理gDNA来去除任何 <1 kb 的片段至关重要。必须优化线性扩增 PCR，因为它不会放大任何会阻止线性扩增子生成和适配器结扎的双链产品。
1. 在 0.8% 琼脂糖凝胶上加载 50 – 100 ng 确保gDNA的高质量。如果检测到任何 <1 kb 片段（图 8），请使用1.0 × ProNex公司尺寸选择性纯化珠。

图 8. 基因组 DNA 的质量控制。琼脂糖凝胶图像显示了ProNex微珠纯化之前 (UP) 和之后 (PUR)的gDNA质量。 gDNA （UP：A 和 B）包含 <1 kb 的片段，可通过 1.0 × ProNex微珠纯化（ Pur ：A 和 B）。

2. PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶制备线性扩增 PCR 。

表4. 线性扩增 PCR
试剂体积 (µL)
无核酸酶水 28.5
5 × GXL 缓冲器 10
每个2.5 mM 4个
生物素结合基因特异性引物 (1 µM) 2个
基因组 DNA (30 ng/µL)（步骤 G13） 5个
GXL聚合酶 0.5
全部的 50

3. 涡旋混合反应并在 280 ×下旋转 g 1 分钟。
4. 使用以下程序对热循环仪进行放大：
a. 98 °C 5 分钟。
b. 80 个循环（98 °C 30 秒，60 °C 30 秒，68 °C 90 秒）。
c. 68 °C 2 分钟。
d. 4 °C 保持。
注意：第一次很重要，已建立的反应可选：在 0.8% 琼脂糖凝胶上检查 5 μL反应，以确保没有指数脱靶扩增。
5. 通过以下步骤进行生物素化 PCR 产物捕获：
a. 转移2 μL Dynabeads TM 每个 PCR 反应的MyONE TM链霉亲和素 C1放入 1.5 mL Eppendorf 管中并添加 150 μL 黑白缓冲区到管。
b. 将管子放在磁力架（6 孔磁力架）上 5 分钟。
c. 去除上清液并在管中加入 150 μL的 B&W 缓冲液。
d. 将管子从磁性支架中取出，通过上下吹打重新悬浮珠子。
e. 将珠子放在磁力架上 5 分钟，然后去除上清液。
f. 珠子重新悬浮在 2 μL中每个 PCR 反应的无核酸酶水，并按照表 5 所示混合反应。

表 5. 捕获生物素化 PCR 产物
试剂体积 (µL)
LAM-PCR 产物（步骤 I4） 50
5M氯化钠 14
0.5 M 乙二胺四乙酸 0.7
洗过的链球菌 2个
无核酸酶水 3.3
全部的 70

g. 在管辊上孵育反应 2-4小时。
注意：建议使用四小时，但反应可以滚动过夜。
h. 在磁力架上捕获 DNA-珠复合物。
i. 去除上清液，用 150 μL的 B&W 缓冲液清洗珠子三次。
j. μL无核酸酶水清洗珠子。
k. 珠子重新悬浮在 9 μL的无核酸酶水中。
6. 继续珠上结扎步骤如下：
a. 按照表 6 准备和混合试剂。

表 6. 珠上连接
试剂体积 (µL)
DNA-珠复合物（步骤 I5k） 4.5
10 × T4 DNA 连接酶缓冲液 (NEB) 1个
BridgeAdapter 50 mM （参见食谱） 0.5
T4 DNA 连接酶 (NEB) 0.5
六钴20毫米 0.5
50% PEG8000（见配方） 3个
全部的 10
注意：在添加 50% PEG8000 之前，首先将 DNA 珠复合物添加到反应中。通过移液和涡旋彻底混合反应。

b. 使用以下程序孵育热循环器中的反应：22°C 1 小时，16°C 1 小时，14°C 1 小时，10°C 1 小时，并储存在 4°C。
c. 在磁力架上捕获 DNA-珠复合物。
d. 去除上清液，用 150 μL的 B&W 缓冲液清洗珠子三次。
e. μL无核酸酶水清洗珠子。
f. 珠子重新悬浮在 20 μL的无核酸酶水中。
7. 如表 7 所示，为珠上适配器 PCR 准备和混合试剂：

表 7. 适配器 PCR
试剂每个反应 (µL)
无核酸酶水 13.75
5 × Q5 缓冲器 5个
dNTPs 2个
U1-C-Gene 特异性嵌套正向 (10 μM ) 1个
U2-C-AdPrim (10 μM ) 1个
DNA-珠复合物 2个
Q5聚合酶 0.25
全部的 25

8. 在以下条件下执行珠上适配器 PCR：
a. 98 °C 5 分钟。
b. 30 个循环（98 °C 30 秒，60 – 65 °C 30 秒，72 °C 90 秒）。
c. 72 °C 2 分钟。
d. 4 °C 保持。
9. 加载5 μL的反应以及 100 bp梯子。长度分布的峰值应在300-500 bp的范围内（图 9）。

图 9. 珠上接头 PCR 产物的验证。显示珠上接头 PCR 产物大小范围的琼脂糖凝胶分析。珠上适配器 PCR 产物（A 和 B）的长度分布应在300 – 500 bp的范围内。

10. 用ProNex微珠 (1.2 × )纯化PCR 产物，然后进行 Illumina 文库制备。
11. 通过混合表 8 中的试剂，使用 Illumina 条形码序列标记不同的样本：

表 8. 索引 PCR
试剂每个反应 (µL)
无核酸酶水 10.75
5 × Q5 缓冲器 5个
dNTPs 2个
FC1-i5-U1 (10 μM ) 1个
FC2-i7-U2（10 μM ） 1个
来自步骤 I10 的纯化 PCR 产物 5个
Q5聚合酶 0.25
全部的 25

12. 在以下条件下执行索引 PCR：
a. 98 °C 5 分钟。
b. 5 – 10 个循环（98 °C 30 秒，55 °C 30 秒，72 °C 90 秒）。
c. 72 °C 2 分钟。
d. 4 °C 保持。
13. 加载5 μL的反应以及 100 bp梯子。长度分布的峰值应在 300 – 500 bp左右（图 10）。

图 10. 索引 PCR 产物的验证。琼脂糖凝胶分析显示带索引的 PCR 扩增子（样品：A 到 D）的长度分布，涂片峰值为 200 – 1,000 bp。负控制 (NC) 用作加载控制。

14. 使用GelAnalyzer软件中的密度测定法量化500 – 700 bp长的产品浓度。
15. ，使用作输入（或细胞数）的每质量gDNA的产品质量相等，以确保均匀的变体覆盖。
16. 加载 50 – 100 μL的反应物以及 100 bp梯子，并从凝胶上切下 500 – 1,000 bp涂片。
17. QIAquick凝胶提取试剂盒从琼脂糖中提取产品。测量Nanodrop上的浓度。
18. 在高灵敏度 D1000 ScreenTape或BioAnalyzer的高灵敏度 dsDNA 芯片上加载稀释到 10 ng/ μL的库来确保选择正确的大小（图 11）。

图 11.最终文库的BioAnalyzer轨迹。最终 DNA 文库的大小分布和摩尔浓度由高灵敏度BioAnalyzer dsDNA 芯片验证。 DNA 文库的长度在 600 – 1,200 bp范围内。

19. ScreenTape或BioAnalyzer软件计算样品的摩尔浓度，并按照相应的 Illumina 套件制造商手册中的说明继续库加载。

数据分析

对于 GUIDE- seq实验，进行了三个独立实验，每个实验重复两次。对于LAM-HTGTS 实验，进行了 3-6 个独立实验，每个实验重复两次。用于分析 GUIDE- seq和 LAM-HTGTS的管道基于以前的出版物(Giannoukos 等人，2018 年；丹纳等人，2021）。 GUIDE- seq和 LAM-HTGTS的详细分析已在方法部分和原始论文的补充图 S9 中进行了描述(Tran 等人，2022）。 Jupiter 笔记本、 conda环境和脚本可在https://github.com/ericdanner/SpacerNick上找到。简而言之，检查GUIDE- seq读数的正确启动，并将dsODN的序列修剪为使用 Bowtie2 全局映射到人类基因组 (hg38) 的相邻基因组序列。量化了与偏离预测的目标站点 5,000 bps 以内的区域对齐的映射读取。对于 LAM-HTGTS 分析，检查读数是否正确启动，然后与 AAV ITR 序列对齐以量化 AAV 整合。未对齐的读数被端到端映射到计算机生成的结果。然后将剩余的未映射读数修剪到 Cas9 目标位点，并与人类基因组 (hg38) 进行全局比对。该分析允许对 AAV 整合、野生型（非靶向）、插入缺失和缺失、倒置、HDR 和易位事件进行量化。

食谱

1. P3电穿孔缓冲液
μL P3 Nucleofector TM溶液 ( Lonza ) 中加入 3.6 μL补充剂，新鲜制备 20 μL P3原代细胞电穿孔缓冲液。
通过涡旋混合缓冲液并以 280 ×短暂旋转 g 1 分钟。
在室温下储存直至使用。

2. 无血清StemSpan TM SFEM II 培养基
无血清StemSpan TM SFEM II 培养基 ( Stemcell ) 添加了人 SCF (100 ng/ mL )、人 TPO (100 ng/ mL )、人 FLT3L (100 ng/ mL )、人 IL-6 (100 ng/ mL ) 、35 nM UM171 和 0.75 mM SR1。
在 4°C 下储存一星期。

3. 70% 乙醇
新鲜混合 30% (v/v) 与 70% (v/v) 乙醇。

4. 50%（重量/体积）聚乙二醇 8000
将 1 克 PEG 8000 溶解在 2 mL 的 H 2 O 中，并在 56 °C 下将溶液与热混合器混合。
μ m过滤器过滤溶液，准备等分试样，并将其储存在 -80 °C。

5. 5M氯化钠
将 292.2 g NaCl溶解在 800 mL 的H 2 O 中，并将总体积调整为 1 L。
高压灭菌并在室温下储存溶液。

6. 2.5N氢氧化钠
将 10 克NaOH溶解在 100 mL 的H 2 O中。

7. 0.5 M 乙二胺四乙酸
将 186.1 g EDTA·2H 2 O 溶解在 800 mL H 2 O中。
在磁力搅拌器上剧烈搅拌。
NaOH将 pH 值调整至 8.0 ，并填充至 1 L。
高压灭菌并在室温下储存溶液。

8. 1 M Tris-HCl (pH 7.4)
将 121.14 克 Tris 溶解在 800 mL 的 H 2 O中。
在磁力搅拌器上剧烈搅拌。
HCl将 pH 值调整至 7.4 ，并将 H 2 O填充至 1 L。
高压灭菌并在室温下储存溶液。

9. 1 M Tris-HCl (pH 8.0)
将 121.14 克 Tris 碱溶解在 800 mL 的 H 2 O中。
在磁力搅拌器上剧烈搅拌。
HCl将 pH 值调整至 8.0 ，并将 H 2 O填充至 1 L。
高压灭菌并在室温下储存溶液。

10. 1 × TE 缓冲液 (pH 8.0)
10毫米 Tris-HCl (pH 8.0)
1毫米乙二胺四乙酸 (pH 值 8.0)
将溶液储存在室温下

11. 黑白缓冲器
1M氯化钠
5毫米 Tris-HCl (pH 7.4)
1毫米乙二胺四乙酸 (pH 值 8.0)
过滤并在室温下储存溶液

12. 20毫米六氨合钴(III) 氯化物 ( HexCo )
将 5.3 克HexCo溶解在 1 L H 2 O中以制备 20 mM工作溶液。将溶液储存在室温下。

13. 50 mM桥接适配器
Hu 等人相同。 (2016) ] 通过在 25 mM中加热 400 mM （总）混合物氯化钠, 10毫摩尔 Tris-HCl (pH 7.4) 和 0.5 mM EDTA 在 98 °C 下使用热循环仪以 1 °C/min 的速率下降至室温。在无核酸酶的水中将混合物稀释至 50 mM ，等分，并储存在 -20 °C。

致谢

我们感谢 HP Rahn 、J. Pempe 、C. Salomon 和 C. Kocks （德国柏林亥姆霍兹协会 (MDC) Max-Delbrück 分子医学中心）提供的出色技术支持。该协议源自原始研究论文（Tran 等人，2022 年；DOI：10.1126/sciadv.abm9106）。
资助：该协议得到了柏林卫生研究所（BIH67000007，VTC 和 RK）、DFG（CH 1968/1-1，VTC 和 KR）和 Helmholtz-Gemeinschaft、Zukunftsthema“免疫学和炎症” （ ZT-0027，至韩国）。

利益争夺

KR、VTC、NTT 和 RK 是亥姆霍兹协会 (MDC) 的 Max-Delbrück 分子医学中心提交的与该协议相关的专利申请的发明人（欧洲专利申请号 21192657.1-1111，于 2021 年 8 月 23 日提交） .所有其他作者声明没有竞争利益。

伦理

人 G-CSF 动员的单采术来自Charite '医院的干细胞核心设施。该协议已由Charite '医院的机构审查委员会审查和批准。所有捐助者均获得知情同意。

参考

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