材料与试剂

1. 1.5 mL Eppendorf 管（Eppendorf，目录号： 0030121872）
2. 移液器吸头 ( Biozym )
3. 玻璃巴斯德移液器（Thermo Fisher，目录号： 1367820C）
4. 50 mL 锥形离心管（Falcon，目录号： 352070）
5. 100 μm细胞过滤器（Corning，目录号： 352360）
6. Gch1 -GFP 报告小鼠 [GENsat.org；股票名称： Tg (Gch1-EGFP)GU68Gsat/ Mmucd ；货号：012014-UCD ]
7. Neurobasal 培养基（ Thermo Fisher，目录号：21103049）
8. 黑色平底 TC 处理的 384 孔板，预涂有聚 D-赖氨酸（BD Biocoat ，Corning，目录号： 354663）
9. 层粘连蛋白（Sigma，目录号： L2020）
10. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（Thermo Fisher，10010023）
11. Liberase -TH（罗氏，目录号： 5401135001）
12. 胰蛋白酶 0.5%（Gibco，目录号： 15400-054）
13. Dulbecco 改良的 Eagle 培养基（DMEM）（Thermo Fisher，目录号： 12491015）
14. 胎牛血清（FBS）（Gibco，目录号： 26140079）
15. L-谷氨酰胺（Gibco，目录号： 25030-024）
16. 青霉素和链霉素（Sigma，目录号： P0781）
17. DNase-I（Sigma，目录号： D5025）
18. 30% BSA 溶液（Sigma，目录号： A9205）
19. 50 × B-27 补充剂（Thermo Fisher，目录号： 17504044）
20. 台盼蓝（Invitrogen，目录号： T10282）
21. 碘化丙锭（ Thermo Fisher，目录号： P1304MP）
22. Phorbol 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯（PMA）（Sigma，目录号： P1585）
23. Go6976（ Tocris ，目录号： 2253）
24. 完整的媒体（见食谱）
25. DRG 媒体（见食谱）

设备

1. 移液器（P20、P200 和 P1,000）（Gilson，目录号：F167360）
2. C离心机（ Eppendorf，型号：5810R ）
3. 海道尔夫 Unimax 1010 摇板机
4. 本生灯（USBECK，W. Germany）
5. 血细胞计数器（ Marienfeld ，目录号：0630010 ）
6. PerkinElmer/Evotec Opera QEHS 2.0 型激光转盘共聚焦荧光显微镜
7. 无菌组织培养柜（Szabo Scandic， SafeFAST Premium 212）

软件

1. 珀金埃尔默 Acapella 语言(PerkinElmer)

程序

A. 384 孔 DRG 培养

以下是用于包被一个 384 孔板的 DRG 培养的优化方案；工作应在组织培养柜中的无菌条件下进行。
1. μL层粘连蛋白（10 μ g /mL 在 PBS 中）在 37 ° C下保持 3 小时。
2. Gch1 -GFP 报告小鼠中分离出 DRG ，并均匀地收集成两只（用于离心过程中的平衡目的）1.5 mL Eppendorf 管，其中装有 1.4 mL 的 neurobasal 介质。
3. 收集所有 DRG 后，让它们通过重力沉降，并通过用 1，000 μL尖端移液来尽可能多地去除 neurobasal 介质。
4. 向 DRG添加 350 μL的自由酶-TH 溶液，并在 37 °C 下孵育 80 分钟。
5. 去除liberase -TH 溶液，并在 1 mL 的 PBS 中缓慢清洗 DRG，再次让 DRG 通过重力沉降。
6. 通过移液去除 PBS。
7. 稀释 250 μL的 0.5% 胰蛋白酶 1:1。将产生的 0.25% 胰蛋白酶溶液的350 μL添加到管中，并在 37°C 下孵育7 分钟。
8. 添加 1 mL 完全培养基（参见食谱）以停止胰蛋白酶反应。
9. 允许 DRGs 通过重力沉降并通过小心移液去除上清液。
10. 用 1 mL 的完整介质清洗。
11. 允许 DRGs 通过重力沉降并通过小心移液去除上清液。
12. 添加 1 mL 的完整介质和 DNase-I（10微克/mL）。
13. 在本生灯火焰上对三个巴斯德移液器的尖端进行火焰抛光，以实现不同直径的移液器开口：大、中和小（图 1）。

图 1 。火焰抛光（使用本生灯）移液器，具有三种比较尺寸的移液器开口

14. 机械研磨 DRG，从正常直径的移液器到中等，最后到小，将 DRG 分离成单细胞悬浮液（每个移液器大小，研磨 10-15 次）。
15. 通过将 2 mL 的 30% BSA 溶液与 4 mL 的 PBS 混合，在 50 mL 管中制备 10% BSA 溶液。
16. 在 10% BSA 溶液上分离 DRG 悬浮液层 1 mL。
17. μL的完整介质清洗管，然后转移并覆盖到 10% BSA 管中。
18. ×离心 g在 4 °C 下保持 15 分钟。
19. 先小心去除 BSA 界面，然后去除其余的 BSA 上清液（顶层）。然后，小心去除所有 BSA 下层，确保不破坏细胞沉淀。
20. 首先在 2 mL 的完整介质中小心地并用重悬 DRG 颗粒，然后再加入 20 mL。此时，将 DRG 颗粒合并为 20 mL。
21. 将细胞悬浮液通过 100 μm细胞过滤器传递到新鲜的 50 mL 锥形管中。
22. x g离心15 分钟。
23. 小心去除上清液。
24. 在 2 mL DRG 培养基中重悬细胞沉淀（参见食谱）。
25. μ L ）对 DRG 神经元进行计数，并将所得混合物的 10 μL添加到血细胞计数器中。
26. 调整音量以确保 25,000 个神经元/ mL 的密度。
27. 从井中完全去除层粘连蛋白溶液。
28. 40 μL （约 1，000 个神经元）的 DRG 添加到每个孔中。
29. °C 下用 5% CO 2孵育板（时间点设置为第 0 天）。

B. 化合物与碘化丙锭（PI）加成

1. 电镀神经元后二十四小时（即第 1 天），从化学库中添加化合物。化合物的制备方式应是将 10 μL的每种化合物添加到 40 μL的 DRG 中，以提供所需的最终工作浓度。以大约 1 mL/min 的速率添加化合物，以尽量减少细胞干扰。
2. 在摇床上以 120 rpm 的速度摇动板 5 分钟。
3. °C 下用 5% CO 2孵育板。
4. 微克/mL）的工作溶液以识别死细胞。
5. 将 50 μL的 PI 溶液添加到 DRG（即 1：1 混合物）中。
6. °C 和 5% CO 2条件下孵育板20 分钟。

C. 神经元成像

1. PI 染色后，立即将板转移到PerkinElmer/Evotec Opera QEHS 2.0 型激光旋转圆盘共聚焦荧光显微镜。
2. nM激光和 PI 使用 561 nM激光可视化和成像Gch1 -GFP 细胞。将每个井分成 15 个部分并获取每个部分（图 2）。

图2 。单个Gch1 -GFP 表达的背根神经节 (DRG) 神经元的共聚焦成像。 A. 每384孔分为15个区域；对每个切片拍摄 GFP 和碘化丙锭 (PI) 的共聚焦荧光图像。合并所有 15 个部分，并为每个孔提取各种参数。 B. 单井分段的代表性 GFP 荧光图像，描绘了由车辆 (DMSO)、PMA 和 Go6976 诱导的高表达 GFP DRG 神经元（红色箭头）。比例尺，30 µm。

3. 继续图像分析。

数据分析

图像分析
1. 使用自动显微镜随附的 PerkinElmer Acapella 语言编写的脚本分析生成的图像。使用 GFP 通道图像进行核检测子程序。使用以下脚本过滤掉太小、太大、太宽或太窄的第一轮候选核 [请参阅原始论文中的补充图 3 (Cronin et al., 2022) ] ：

// 用户脚本开始

input( IN_Green_lo_pos_thresh , 300, "Green Low Positive Threshold"," i ", "Minimum Green intensity to qualify as Low Positive")
input( IN_Green_hi_pos_thresh , 1000, "Green High Positive Threshold"," i ", “符合高正标准的最小绿色强度”）
输入（ IN_max_nuc_area ，2000）
输入（ IN_min_nuc_area ，300）
输入（ IN_LowerWidthToLengthThresh ，0.3，“下宽度至长度阈值”）
输入（ IN_Green_channel ，1，“绿色通道”，“我”， “具有绿色核标记的通道”）
输入（ IN_viability_channel ，“viability_channel”，“i”，“具有活性核标记的通道”）
输入（ IN_Green_neg_thresh ，60，“绿色假核阈值”，“ i ”，“最小绿色”有资格成为真正细胞核的强度”)
input( IN_Viability_thresh , 75, “Viability Threshold”,” i “,”Minimum Viability intensity to qualify as Dead”)

set( Green_channel = _["IM_CH" & IN_Green_channel ])

//set ( viability_channel = _["IM_CH" & IN_viability_channel ])
set( viability_channel = IM_CH2)
Nuclei_Detection_Select ( green_channel )

//在开始对象过滤器之前进行所有测量

set(objects=nuclei)

CalcIntensity (image= Green_channel , objects=objects)
RenameAttr ( Green_intensity =intensity, objects=objects)

CalcIntensity (image= viability_channel , objects=objects)
RenameAttr ( viability_intensity =intensity, objects=objects)

set(nuclei=objects)

CalcAttr ( "Roundness" )
CalcWidthLength ()
DefineAttr ( WidthToLength , " half_width / full_length " )
set(nuclei=objects)

// 收集 Nuclei 的结果
if (defined(" all_Nuclei ")) // 不是第一个评估字段
AddObjects (Nuclei, objects= all_Nuclei , CheckOverlap =no)
set( all_Nuclei =objects) // 重命名AddObjects ()
else()
set( all_Nuclei =Nuclei) // 第一个评估字段
end()

end() // 有效图像字段分析结束
end() // foreach 循环结束image fields

//现在我们已经收集了所有的细胞核，开始过滤。做每个
单独分类的图像视图_ _
_ _ _
_ _ _ _ _ _
_ _ _

_ _ _ _ _ _
_ （ too_small =对象）
对象过滤器（区域> IN_min_nuc_area ，对象= all_Nuclei ）
设置（ all_Nuclei =对象）对象

过滤器（ WidthToLength < IN_LowerWidthToLengthThresh ，对象= all_Nuclei ）
设置（ too_skinny =对象）对象
过滤器（ WidthToLength > = IN_LowerWidthToLengthThresh , objects= all_Nuclei )
set( all_Nuclei =objects)

objectfilter ( ( Green_intensity <= IN_Green_neg_thresh ) , objects= all_Nuclei )
set( GreenFalseNuc =objects)
objectfilter ( ( Green_intensity > IN_Green_neg_thresh ) , objects= all_Nuclei )
set( all_Nuclei =objects)

// 为每个找到所有 12 个表型类3 个标记（ ubiq的lo_pos和hi_pos ）

// GreenNeg
objectfilter （（ Green_intensity <= IN_Green_lo_pos_thresh ），objects= all_Nuclei ）
set（ GreenNeg =objects）

objectfilter （（ Green_intensity <= IN_Green_lo_pos_thresh ）AND（ Viability_intensity > IN_viability_thresh ），objects= all_Nuclei )
set( GreenNeg_Dead =objects)

objectfilter (( Green_intensity <= IN_Green_lo_pos_thresh ) AND ( Viability_intensity <= IN_viability_thresh ) , objects= all_Nuclei )
set( GreenNeg_Alive =objects)

// GreenLoPos
objectfilter (( Green_intensity > IN_Green_lo_pos_thresh ) AND ( Green_intensity <= IN_Green_hi_pos_thresh ) , objects= all_Nuclei )
set( GreenLoPos =objects)

objectfilter (( Green_intensity > IN_Green_lo_pos_thresh ) AND ( Green_intensity <= IN_Green_hi_pos_thresh ) AND ( Viability_intensity > IN_viability_thresh ), objects= all_Nuclei )
set( GreenLoPos_Dead =objects)

objectfilter (( Green_in张力> IN_Green_lo_pos_thresh ) AND ( Green_intensity <= IN_Green_hi_pos_thresh ) AND ( Viability_intensity <= IN_viability_thresh ), objects= all_Nuclei )
set( GreenLoPos_Alive =objects)

// GreenHiPos
objectfilter (( Green_intensity > IN_Green_hi_pos_thresh ), objects= all_Nuclei )
set( GreenHiPos =objects)

2. ，将剩余的接受核分为高强度、低强度或 GFP 阴性。
3. 根据 PI 荧光强度将细胞进一步分为活细胞或死细胞。仅活的 PI 阴性细胞被纳入进一步分析。
4. 以下参数将取决于所分析的特定目标基因；对于Gch1 -GFP，这些都是单独优化的。见注释。
5. 计算每个复合孔的三个不同参数：高表达 GFP 神经元的数量（#GFP Hi ）、每孔平均 GFP 强度（平均 GFP 强度）以及每孔鉴定的总神经元中高表达 GFP 神经元的百分比(% GFP H i /总细胞核)。
6. 对于每个参数，上下三个标准差（ ± 3 SD) 对载体 (DMSO) 对照样品进行评分。
7. 对于每个通过的阈值，分配以下评分：#GFP Hi = 1；平均 GFP 强度 = 3； % GFP Hi /total nuclei = 5. 总秩和分配给每个化合物。对于decrecers ，获得总分 > 1 的化合物被认为是命中；对于增加者，使用更严格的总分> 5。

笔记

1. 正 [PMA;佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯；蛋白激酶 C (PKC) 激活剂]、阴性（Go6976；P KC 抑制剂）和适当稀释的载体 (DMSO) 对照化学品作为每个板上的对照，以验证每个板上的算法阈值和数据一致性。
2. 在我们的屏幕中， Gch1 -GFP 表达可以分为高 GFP 表达和低 GFP 表达，如论文中所述。我们专注于化合物对 GFP 高表达神经元的影响。
3. 我们添加到 PerkinElmer 提供的多场分析脚本的 acapella 脚本部分如上所示。据推测，可以使用任何在不同波长下发现原子核、测量大小和测量强度的图像分析脚本语言。此外，我们用于选择用于分析包含的细胞的计算和阈值可能因不同的生物实验系统而异。

食谱

1. 完整介质（建议准备体积：100 mL）
DMEM + 10% FBS + L-谷氨酰胺 (5 mM) + 青霉素和链霉素 (5 mM)

2. DRG 介质（建议准备体积：50 mL ）
Neurobasal 培养基 + 50 × B-27 补充剂 + L-谷氨酰胺 (5 mM) + 青霉素和链霉素 (5 mM)

致谢

我们感谢哈佛干细胞研究所 (HSCI) 在运行屏幕方面的专业知识、基础设施和化学库。我们还要感谢 Woolf、 Penninger和 Rubin 实验室的所有成员，感谢他们提供的所有建议，并帮助生成了本协议的原始出版物（ Cronin 等人，2022 年）。 CJW 得到 NIH R35NS105076 和 HMS Blavatnik奖的支持。 JMP 得到奥地利联邦教育、科学和研究部、奥地利科学院和维也纳市的支持，并获得奥地利科学基金 (FWF)、维特根斯坦奖 (Z 271-B19) 和 T.冯扎斯特罗基金会。 LR 和 HSCI 得到HSCI 治疗筛选中心 (TSC) 资助 (# CF-0009-17-03) 的支持。

利益争夺

作者没有相互竞争的经济利益。

伦理

所有实验均在波士顿儿童医院机构动物护理和使用委员会的批准下进行。

参考

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Cronin, SJF, Rao, S., Tejada, MA, Turnes, BL, Licht-Mayer, S., Omura, T., Brenneis, C., Jacobs, E., Barrett, L., Latremoliere, A., 等阿尔。 (2022)。表型药物筛选揭示了代谢 GCH1/BH4 通路是 EGFR/KRAS 介导的神经性疼痛和肺癌的关键调节因子。 Sci Transl Med 14(660)：eabj1531。
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