材料与试剂

以下列表提供了我们实验室中日常使用的材料和设备的示例。具有相似规格的试剂和设备也可以使用。
列出的所有材料和试剂均按照制造商的说明进行处理和储存。

1. 聚偏二氟乙烯转移膜，0.2 µm（PVDF 膜）（Thermo Fisher Scientific，目录号：88520）
2. Whatman 3MM CHR 纸（Cytiva，目录号：3030-335）
3. β-磷酸甘油（AppliChem，目录号：A2253，CAS 号：819-83-0）
4. β-巯基乙醇（VWR BHD Chemicals，目录号：25351.182，CAS 号：60-24-2）
5. 丙烯酰胺双溶液（BioAcryl-P 30%，37.5:1）（Alfa Aesar，目录号：J61505）
6. 过硫酸铵（APS）（Sigma-Aldrich，目录号：A3678，CAS 号：7727-54-0）
7. 抑肽酶（Sigma-Aldrich，目录号：A1153，CAS 号：9087-70-1）
8. BCA 蛋白测定：试剂 A（Thermo，目录号：23228）和试剂 B（Thermo，目录号：23224）
9. Bis-Tris 超纯（Thermo Fisher Scientific，目录号：J12112.22，CAS 号：6976-37-0）
10. 牛血清白蛋白 (BSA)（Sigma-Aldrich，目录号：A7906，CAS 号：9048-46-8）
11. 溴酚蓝（Amresco，目录号：0449-25G，CAS 号：115-39-9）
12. 染料浓缩试剂（ Bio-Rad，目录号：500-0006）
13. 乙二胺四乙酸 (EDTA)（VWR Life Science，BHD Prolabo Chemicals，目录号：443885J，CAS 号：6381-92-6）
14. 甘油（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP229-1，CAS 号：56-81-5）
15. 甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G8898-1KG，CAS 号：56-40-6）
16. HRP 缀合的抗小鼠抗体（Jackson ImmunoResearch，目录号：115-035-003，使用的浓度：1： 5，000 ）
17. HRP 缀合的抗兔抗体（Jackson ImmunoResearch，目录号：111-035-003，使用的浓度：1：5,000）
18. 盐酸 (HCl)（Thermo Fisher Scientific，目录号：H/1200/PB15，CAS 号：7647-01-0）
19. 异丙醇（Sigma-Aldrich，目录号：1.09634.1011，CAS 号：67-63-0）
20. 亮肽素（Sigma-Aldrich，目录号：L9783，CAS 号：24125-16-4）
21. MES-SDS 运行缓冲液（Thermo Fisher Scientific，目录号：NP0002）
22. 甲醇（Fisher Chemical，目录号：M/4000/PB17，CAS 号：67-56-1）
23. N,N,N',N'-tetramethyl-ethane-1,2-diamine (TEMED)（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP150-20，CAS 号：110-18-9）
24. 脱脂奶粉（雀巢 Sveltesse）
25. NP-40（IGEPAL CA-630）（Sigma-Aldrich，目录号：I3021，CAS 号：9002-93-1）
26. 苯甲磺酰氟 (PMSF)（CalbioChem，目录号：52332，CAS 号：329-98-6）
27. 叠氮化钠（MERK，目录号：1066880100，CAS 号：26628-22-8）
28. 氯化钠 (NaCl)（Sigma-Aldrich，目录号：71383-5KG，CAS 号：7647-14-5）
29. 十二烷基硫酸钠（SDS）（Bio-Rad，目录号：1610302，CAS 号：151-21-3）
30. 氟化钠 (NaF)（Sigma-Aldrich，目录号：S7920-100G，CAS 号：7681-49-4）
31. 原钒酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S6508，CAS 号：13721-39-6）
32. Trizma 碱（Tris）（Sigma-Aldrich，目录号：T1503-1KG，CAS 号：77-86-1）
33. Tween-20（Sigma-Aldrich，目录号：P5927，CAS 号：9005-64-5）
34. WesternBright TM ECL HRP 底物（Advansta，目录号：K-12045-D50）
35. 裂解缓冲液（见配方）

36. 5 × Laemmli 缓冲液（参见食谱）
37. 聚丙烯酰胺凝胶（见配方）
38. 转移缓冲液（见配方）
39. TBST 洗涤缓冲液（见配方）
40. 一抗封闭液（见配方）
41. 二抗封闭液（参见食谱）

设备

1. Mini-PROTEAN® Tetra Vertical Electrophoresis Cell, 4-gel, for 1.0 mm thick handcast gels (Bio-Rad Laboratories Inc., catalog number: 1658001FC)
a. Mini-PROTEAN Tetra Companion Running Module（Bio-Rad Laboratories Inc.，目录号：1658038）
b. 铸造框架（Bio-Rad Laboratories Inc.，目录号：1653304）
c. 铸造台垫圈（Bio-Rad Laboratories Inc.，目录号：1653305）
d. 玻璃板（Bio-Rad Laboratories Inc.，目录号：1653311）
e. 短板（Bio-Rad Laboratories Inc.，目录号：1653308）
f. 梳子，15 孔，1.0 mm（Bio-Rad Laboratories Inc.，目录号：1653360）
g. 缓冲罐和带电源线的盖子（Bio-Rad Laboratories Inc.，目录号：1658040）
h. 凝胶释放剂（Bio-Rad Laboratories Inc.，目录号：1653320）
i. 印迹滚筒（Bio-Rad Laboratories Inc.）
2. 电源（VWR，目录号：HITAK622113）
3. MicroChemi 系统（生物成像系统）

软件

1. ImageJ 和 R 软件

程序

使用的溶液和缓冲液的组成显示在下面的“配方”部分下。

A. 免疫印迹

由于该协议旨在量化来自膜的信号，因此我们在此提供了一个通用的蛋白质印迹指南，每个用户都应根据该指南应用符合他或她兴趣的最佳条件。简而言之，蛋白质根据其大小在丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，然后转移到膜上，用能够识别目标蛋白质所显示的特异性抗原性表位的抗体进行探测。

步骤如下：
1. 从接种的 HEK293FT 细胞（80% 汇合度）中提取蛋白质在 6 cm 板中加入500 µL 含蛋白酶抑制剂的冷裂解缓冲液，4 ℃孵育 30 分钟 °C轻轻摇动。将含有细胞的溶液收集在冷 Eppendor f 管中并以 16,000 ×离心 g在 4 下保持 10 分钟摄氏度。
注意：为避免蛋白质降解，加入蛋白酶抑制剂并在寒冷条件下工作，在 4 摄氏度。如果要进行免疫沉淀，可以使用包括 RIPA 在内的不同裂解缓冲液进行裂解。
2. 量化蛋白质浓度。
注意：需要根据使用的裂解缓冲液，即 BCA 蛋白质测定（用于含有 SDS 的裂解缓冲液）和蛋白质测定染料浓缩试剂（不含 SDS 的裂解缓冲液），使用适当的方法对蛋白质进行定量。
3. 在新的 Eppendorf 中收集所需数量的裂解物 (15–50 µg)，将 Laemmli 缓冲液添加到最终 2倍浓度至 25 µL 体积，并充分混合。然后，将样品在 100 °C下煮沸6 分钟，让它们在室温下冷却并在 16,000 × g下离心30 秒。
如果不立即使用，样品可以储存在 -20 °C 。
4. 在相应的丙烯酰胺凝胶中加载所需数量的蛋白质裂解物以执行 SDS-PAGE。将凝胶放入装有 MES-SDS 运行缓冲液的槽中，并施加电流以分离蛋白质，直到前染料到达凝胶底部（图 1）。
注意：根据要检测的大小和蛋白质，要使用的丙烯酰胺凝胶的百分比和种类会有所不同。例如，要检测高分子量（80 kDa 以上）的蛋白质，首选6% – 8% 的丙烯酰胺凝胶。如果需要在同一凝胶中检测低（低于 30 kDa）和高分子量蛋白质，建议使用丙烯酰胺百分比为 4% 至 12% 的梯度凝胶。根据丙烯酰胺凝胶是 Bis-Tris 还是 Tris-甘氨酸，分辨率范围和运行样品所需的时间会有所不同（ Bis-Tris 凝胶在 200 V 下需要30 – 40 分钟，在 Tris- 下需要 75 – 120 分钟）甘氨酸凝胶在 90 V）。

图 1. SDS-PAGE 凝胶电泳；在加载（左图）和运行 30 分钟（中图）和 90 分钟（右图）后。注意样品运行后出现在左右边缘的分子量t 标准（蓝色）。箭头指向前面的染料，箭头指向 75 kDa 分子量标记。

5. 将蛋白质从凝胶转移到 PVDF 膜上。在获得凝胶之前，通过将 PVDF 膜浸泡在甲醇中几秒钟来标记和激活它，用 ddH 2 O 冲洗两次3 – 4 分钟，并与转移缓冲液一起孵育直至使用。前染料到达凝胶底部后停止电流。如视频 1 所示，将转移盒组装到带有转移缓冲液的容器中。
注意：通过用转移缓冲液覆盖海绵、Whatman 纸和凝胶来设置盒式磁带时，避免气泡至关重要。未能去除组装盒中的气泡将危及蛋白质的检测。放置每个组件后，请记住轻轻地运行印迹滚筒，以避免在转移过程中出现气泡。注意凝胶的方向，以免弄乱样品上样的顺序；可以在第一个和最后一个泳道中添加不同体积的分子量标记以帮助实现此目的。

视频 1. 转学准备

6. 将盒式磁带以正确的方向放置在装满转移缓冲液和冰包的腔室中的框架中。包括一个磁力搅拌器并在冷室中应用 200-400 mA 电流至少 1.5 小时进行搅拌，以避免过热。之后，取出附着有蛋白质的 PVDF 膜并开始检测它们的程序。
注意：蛋白质从凝胶转移到膜可以用不同的设备完成，包括半干转移。以错误的方向插入盒会使凝胶中的蛋白质向 PVDF 膜的相反方向迁移；因此，蛋白质会丢失。
7. 在室温下用封闭溶液封闭膜并搅拌至少 30 分钟。
注意：封闭溶液将取决于要使用的一抗。检查制造商数据表以获取该信息。
8. 将膜与一抗在封闭溶液中孵育，在室温下搅拌 2-3 小时或在 4 ° C下过夜。
注意：信号质量和背景量在很大程度上取决于抗体的质量/亲和力。如果可能，请使用您或其他实验室之前测试过的抗体。
9. 用TBST溶液轻柔搅动至少3次，每次至少15分钟，用TBST+5%脱脂牛奶搅动封闭膜10分钟，加入相应的HRP偶联二抗，孵育至少45分钟.
注意：要使用的二抗可以与不同的荧光团而不是 HRP 偶联，但必须格外小心，以免信号漂白。
10. 用 TBST 重复洗涤并将膜留在该溶液中直至显影。
11. 使用不同的曝光时间在 MicroChemi 设备中设置图像采集设置。
注意：可以使用其他设备获取图像。暴露时间将取决于蛋白质的数量和/或一抗的选择性。通常，我们将 Chemidoc 程序中的曝光时间差设置为 1、3、5、15、30、60、180、300、600 和 900 秒。每个图像的信号对应于从开始的累积时间，即图像 3 和 4 将分别曝光 9 秒和 24 秒。
12. 将膜与 WesternBright TM ECL HRP 底物孵育 1 分钟。
13. 将膜放入 MicroChemi 室并获取图像（图 2）。
注意：在实验结束时，用强光拍照以保存膜中分子量标记位置的图像。这将有助于识别感兴趣的波段。
14. 复制图像并传输到带有 ImageJ 程序的计算机上进行处理。

图 2.使用 MicroChemi 设备和 GelCapture 软件获得的图像。不同曝光时间（从 1 到 4,128 秒）的 HEK293FT 细胞裂解物中肌动蛋白的蛋白质印迹显示原始图像（两个左图，第一个是倒置的）、饱和度图像轮廓（左起第三个图）和伪彩色图像（左起第四个面板）。请注意，信号在 37.5 µg 样品中变得饱和（红色信号），曝光时间为 828 秒。

B. 图像处理和波段量化

目的是使用 ImageJ 程序的分析工具（视频 2）获得膜曝光期间捕获的每个图像中每个波段强度的数值。

视频 2. 条带量化
1. 使用 ImageJ 使用以下命令打开所有图像：文件 > 导入 > 图像序列...选择图像所在的文件夹目录、第一个开始的图像以及要导入的照片数量。
化学发光获得的那些。
2. 选择要记录的感兴趣参数。为此，请选择“分析”>“设置测量值……”单击 ImageJ 应记录以进行分析的测量值。
注意：在我们的例子中，我们选择了面积、平均灰度值、集成密度和显示标签。将使用集成密度值执行分析，但可以记录所需数量的参数。
3. 具有可见波段但不饱和的图像（图 2，过度曝光图像），并使用“矩形”工具划定适合其中一个波段的矩形。然后，将矩形移动到靠近波段但没有信号的膜区域上，以捕获背景。使用以下命令记录测量结果：Image > Stacks > Measure Stack…
注意：矩形的面积越小适合波段，由于背景引入偏差的可能性就越大(Gassmann et al., 2009)。不应修改矩形的大小，以便始终为所有波段量化相同的区域。如果凝胶中有游离孔，则可以包括具有相同裂解缓冲液和 Laemmli 缓冲液的泳道，这将用于量化背景。
4. 在每个波段上移动矩形并重复相同的命令以获得测量值。结果，将出现一个表格，其中包含为每个序列图像中的每个波段收集的所有值。
注意：考虑条带被量化的顺序，以了解该值对应于哪个样本。
5. 使用命令文件 > 另存为...以 .csv 格式保存数据

C. 线性模型优化

分析的目的是获得蛋白质印迹中每个条带的代表值。该值将是所选频段线性范围内信号增量的斜率。
1. 加载 R 软件运行所需的包。
注意：如果未安装包，则需要在加载它们之前使用命令 install.packages()。

my_packages <- c( "dplyr" , "ggplot2" , "openxlsx" )
lapply(my_packages, require, character.only = TRUE)

2. 设置工作目录、数据文件所在的文件夹以及分析结果将要导出的位置。
注意：请记住应该使用引号。

工作目录<- "/Users/xxxxx/Desktop/Folder1/Folder2/Actin"
setwd(WorkingDirectory)

3. 以 .csv 格式从图像分析中加载数据，将文件名复制到相应的车道中。
注意：应使用引号。

文件名<- “Results.csv”
结果<- read.table( file = File_Name, sep = "," ,标题 = T)

4. 定义实验条件：背景和已加载到凝胶上的样品。该脚本将在名为“条件”的新列中将每个名称分配给每组测量值。
注意：请注意按照从图像进行量化的相同顺序编写它们，并使用引号，以便 R 将它们解释为文本。

条件<- c（ “背景” 、 “6μg” 、 “9μg” 、 “15μg” 、 “18μg” 、 “22.5μg” 、 “30μg” 、 “37.5μg” ）
结果$条件<-因子（ x = rep（条件，每个 = max(Results$Slice)), levels = conditions)

5. 介绍已量化的每个图像的曝光时间。该脚本会将每个值分配给名为“Exposure”的新列中的相应图像。
注意：切记，不是Chemidoc软件中已经引入的数值，而是从一开始就累计的时间。要使用的单位可以是秒或分钟；如果使用分钟，将值转换为十进制并使用“.”对于小数。

曝光<- c( 1 , 3 , 8 , 18 , 33 , 63 , 108 , 168 , 228 , 288 , 408 , 588 , 828 , 1128 , 1428 , 1728 , 2028 , 2628 , 3228 , 4128 )
结果$曝光<-代表（曝光，时间=长度（条件））

6. 执行背景校正。该代码将从所有分析波段中的每个图像的背景中减去信号。结果将写入名为“BckgCorrect”的新列中。

结果$BckgCorrect <- rep( 0 , dim(Results)[ 1 ])
for (i in 1 :dim(Results)[ 1 ]) {
Bkgnd <- Results$Conditions == "Background" & Results$Exposure == Results[i, "Exposure" ]
Results$BckgCorrect[i] <- Results[i, "IntDen" } " ] - 结果 [Bkgnd, "IntDen" ]
}

7. 在散点图中表示数据，曝光时间作为自变量，背景校正信号作为相关变量（图 3）。该图的目的是直观地确定信号增量的线性范围。

ggplot（结果，aes（ x = Exposure， y = BckgCorrect， color = Conditions））+
geom_point（）+ geom_line（）+ theme_classic（）

图 3. 带量化的表示。显示了每个波段（y 轴）相对于曝光时间（x 轴）的信号。请注意，在蛋白质含量较高（22.5、30 和 37.5 µg）的样品中，曝光时间和信号之间的线性在特定曝光时间会丢失。

8. 通过手动选择要考虑的第一个和最后一个曝光时间来优化模型，这些曝光时间在所有感兴趣的条件下都保持在线性范围内。该脚本将定义一个新的数据框，其中包含这两点之间的过滤数据，名为“Results_filtered”。

首次曝光= 63
最后曝光= 828
结果 %>% filter(between(Exposure, First_Expossure, Last_Expossure)) -> Results_filtered

9. 使用简单线性回归构建线性模型，将曝光时间作为预测变量，将校正信号作为响应变量。该脚本将为实验的每个条件计算回归参数，获得一个新的数据框，其中包含回归线的斜率值、用于评估拟合优度的 R 平方决定系数以及用于评估拟合优度的 p 值评估其统计显着性（表 1）。它还将使用过滤后的数据生成一个新的散点图（图 4）。

结果模型<- data.frame(t(mapply(unlist, by(Results_filtered, Results_filtered$Conditions, function (x) summary(lm(BckgCorrect~Exposure, x))))) %>%
select( slope = coefficients2, adj .r.squared, p.value =系数8)
ggplot(Results_filtered, aes( x = Exposure, y = BckgCorrect, color = Conditions))+
geom_point() + geom_line() + theme_classic()
knitr::kable(Results_model)

图 4. 带量化的调整表示。在移除具有较低和/或较高暴露（其中线性丢失）的样品后，保持不同量的线性并且将允许准确计算每个浓度的斜率。

表 1.每个实验条件的回归参数
状况坡调整。河平方 p.价值
背景 0 钠盐钠盐
6微克 1157.633 0.9988883 2.704757e-10
9微克 3156.074 0.9993988 4.277239e-11
15微克 16760.63 0.9986983 4.34215e-10
18微克 26829.65 0.9994091 4.061036e-11
22.5微克 57338.1 0.9993725 4.864208e-11
30微克 121563.9 0.9989834 2.068317e-10
37.5微克 223579.3 0.9998507 6.546559e-13

10. 如果回归系数不够接近 1 和/或散点图不符合线性范围，则返回步骤 C8，并再次调整曝光值。
11. 导出分析结果。该脚本将覆盖初始 excel 文件，将所有数据保存在名为“DATA”的工作表中，将曝光时间之间的过滤数据保存在名为“DATA_FILTERED”的工作表中，并将线性模型的系数保存在名为“MODEL”的工作表中。
注意：请记住，这些是化学发光信号值。 Western blotting 是一种半定量技术，因此解释结果的下一步应该是将这些值与管家或参考蛋白质（感兴趣的蛋白质/参考蛋白质）进行比较。

write.xlsx（列表（数据=结果， DATA_FILTERED =结果_过滤，模型=结果_模型），文件= "文件名" , row.names = T)

例子
作为此处描述的方法的示例，与 Sánchez-Sánchez 等人发表的方法相辅相成。 (2023)，我们展示了神经生长因子 (NGF) 刺激不同时间后 TrkA 激活的量化。简而言之，我们使用富含 TrkA 阳性神经元的感觉神经元原代培养物，用 NGF 选择 5-6天。然后我们剥夺神经营养蛋白培养 4 小时，并用 NGF (50 ng/mL) 刺激相应的时间。我们收集细胞裂解物并使用 pTrkA（用于激活的受体）（图 5A，左图）和 TrkA（图 5B，左图）抗体进行蛋白质印迹，以顶部 140 kDa 条带作为参考蛋白。我们按照本协议中的描述量化了来自 pTrkA 和 TrkA 波段的信号。我们测量了每个样品不同图像的信号强度（图 5A 和 5B，曝光印迹），并与曝光时间设置一起定义了每种蛋白质的组合线性范围（图 5A 和 5B，右图）。如上所述，我们建立了一个线性回归模型。我们使用斜率作为代表值来计算 pTrk 与 TrkA 的比率，并绘制独立实验的结果（图 5C）。

图 5. 信号量化示例。具有不同曝光度的图像显示 pTrkA（面板 A ）和 TrkA（面板 B ）信号在 NGF 刺激不同刺激时间后在培养的感觉神经元中被量化。两个面板中的彩色矩形代表用于量化的膜区域。没有信号的另一个区域的矩形被用作背景（图像中未显示）。请注意，在伪彩色图像（红色）中的 TrkA 印迹的较高曝光下可以检测到饱和度。在每个面板的右侧，有一个图表显示每个时间点的信号增加曲线。虚线之间的范围表示为优化线性回归模型和在线性范围内执行量化而采取的曝光。请注意，伪彩色图像中的饱和度与图中曲线的美化程度相匹配。 ( C ) TrkA 激活的量化（pTrkA/TrkA 比率）。使用 NGF 刺激的 5 分钟时间点进行标准化。每条彩色线代表在单个实验中获得的结果 (n = 3)。图 A 和 B 对应于图 C 中的实验 c。

有用的提示
1. 重要的是将控制和实验/问题样品包含在同一膜中，以便能够进行比较，因为膜之间总是存在一些可变性，即使在整个实验中并行进行的膜也是如此。
2. 要加载到凝胶中的总蛋白质（通常在 15 到 50 µg 之间）将取决于要检测的感兴趣蛋白质的丰度和要使用的抗体的亲和力。加载过量的总蛋白也会在转移过程中使膜饱和，样品之间的差异可能会产生误导。
3. 请记住，蛋白质印迹是一种半定量技术，始终需要上样对照、管家蛋白或参考蛋白来标准化数据。
4. 信号质量和背景量在很大程度上取决于抗体的质量/亲和力。如果可能，请使用您或其他实验室之前测试过的抗体。
5. 使用 R 软件时，不要忘记在应该是文本的地方使用引号。

食谱

以下溶液/缓冲液是使用所示数量获得的，每个组分的最终浓度在括号中给出。

1. 裂解缓冲液
2.42 克 Trizma 碱 pH 8.0 (20 mM)
8 克氯化钠 (137 毫米)
10 毫升的 NP-40 (1%)
高达 1 L 的超纯 MilliQ 水
储存在 4 °C
在使用前，添加相应的体积，最终浓度为 1 mM PMSF、1 μ g/mL 抑肽酶、2 μ g/mL 亮肽素、1 mM 原钒酸钠、10 mM NaF 和 20 mM β-甘油磷酸盐。

2. 5 × Laemmli 缓冲液
30.29 克 Trizma 碱 pH 6.8 (250 mM)
100 克 SDS (10%)
500 mL 克甘油 (50%)
67 毫克溴酚蓝 (0.01%)
39.07 克 β-巯基乙醇 (500 mM)
高达 1 L 的超纯 MilliQ 水
储存在-20 °C

3. 聚丙烯酰胺凝胶
达到所需百分比的丙烯酰胺双溶液、350 mM Bis-Tris 缓冲液 pH 6.4、0.1% SDS、超纯 MilliQ 水、APS (0.1%) 和 TEMED (6.6 mM)。按顺序混合试剂并避免气泡以防止不规则聚合。为每个分辨率凝胶准备 4.5 mL 的最终体积，并为堆叠准备 2 mL 的丙烯酰胺百分比较低。在分离胶聚合过程中使用一层薄薄的异丙醇以避免与氧气接触也有助于避免气泡并通过堆叠进行干净的分离。自制凝胶在 4 °C的潮湿室中最多可保存 3 – 4 天。

4. 传输缓冲区
5.8 克 Trizma 碱 pH 8.3 (25 mM)
2.9 克甘氨酸 (192 mM)
100 mL 甲醇 (10%)
高达 1 L 的超纯 MilliQ 水并可调节 pH 值
储存在 4 °C并重复使用多达五次

5. TBST 洗涤缓冲液
1.21 克 Trizma 碱 pH 7.5 (10 mM)
8.8 克氯化钠 (150 毫米)
0.32 克 EDTA（1 毫米）
10 毫升 Tween-20 (0.1%)
高达 1 L 的超纯 MilliQ 水并可调节 pH 值

6. 一抗封闭液
100 mL TBST 洗涤缓冲液
3 克牛血清白蛋白 (3%)
32.5 毫克叠氮化钠 (0.05%)
储存在 4 °C

7. 二抗封闭液
100 mL TBST 洗涤缓冲液
5 克脱脂奶粉 (5%)
使用前准备，轻轻搅拌以避免起泡

致谢

我们感谢 Deogracias 和 Arevalo 的实验室对手稿的投入。这项工作得到了由 MCIN/AEI/10.13039/501100011033 资助的赠款 PID2020-113130RB-100 的支持，并由欧盟授予 JCADCG，由 Consejería de Educación Junta de Castilla y León 和欧洲社会基金授予。

利益争夺

作者声明没有竞争利益，提及特定材料、试剂和设备并不意味着资助机构的认可。

参考

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Huang, YT、van der Hoorn, D.、Ledahawsky, LM、Motyl、AAL、Jordan, CY、Gillingwater, TH 和 Groen, EJN (2019)。使用标准化定量蛋白质印迹法对跨组织和整个发育过程的蛋白质水平进行稳健比较。 J Vis Exp (146)。内政部：10.3791/59438。
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