材料和试剂

1. 超细31G胰岛素注射器0.5 m L （Becton Dickinson，目录号：32281）
2. 英赛特 Autoguard TM有翼，24G × 0.75”（Becton Dickinson，目录号：381212）
3. Microlance TM皮下注射针头30G × 0.5（Becton Dickinson，目录号： 304000）
4. 10 µL 气密注射器，胶合针头， 26s 规格，2 英寸，尖型 2（Hamilton，目录号： 1701）
5. C57BL/6J 小鼠
6. 大肠杆菌O127:B8的脂多糖 (LPS) ；通过苯酚萃取纯化（Sigma，目录号：L3129）
7. 氯化钠静脉输注BP（注射用水）（Pfizer，目录号：AUST R 49280）
8. 氧气
9. 异氟醚（AbbVie，Forthane ® ，目录号：AUST R 29656，30°C 以下储存）
10. 多聚甲醛（PFA）粉末，95%（Sigma-Aldrich，目录号：158127）
11. PBS（ ThermoFisher Scientific， Gibco TM ，目录号： 14190250）
12. 棉尖涂抹器（BSN Medical，目录号： 7505-0）
13. 纱布
14. 液氮（ N 2 ）
15. 湿冰
16. 聚酯线（缝合线）（桦木，目录号：004601）
17. 1.7 mL微管（Axygen，目录号：MCT-175-C）

设备

1. 定制有机玻璃毒气室【大约尺寸：40 × 125 × 30（长×宽×高）cm】
2. Bear cub BP2001 婴儿呼吸机（Bear Medical Systems，#240 型）
3. 便携式氧气分析仪（Teledyne，型号：AX300-I）
4. 氧传感器（ Maxtec ，型号：R109P09）
5. Power lab/16SP（ ADinstruments ，型号：ML795）
6. 加热式呼吸加湿器（Fisher and Paykel，型号：MR730）
7. 自动填充腐殖化室（Fisher and Paykel，型号：MR290）
8. 温度吊舱（ ADinstruments ，型号：ML312）
9. 吊舱扩展器（ ADinstruments ，型号：ML305）
10. 紧凑型秤，510 g × 0.1 g（A&D 称重，型号：HT-500）
11. 重力灌注仪
12. 镊子，尖端宽度 0.5 mm，长度 10 cm（Fine Science Tools，目录号：11150-10）
13. 剪刀（精密医学专业，型号：E25-500）
14. 泡沫解剖托盘
15. 液氮容器（Nalgene ® ，目录号：4150-2000）
16. -86 °C 冷冻箱 690 L（Froilabo，型号： BMEVO69086G ）

软件

1. 图表 5 Pro v5.5.1 (ADInstruments, www.ADInstruments.com)

程序

小鼠心肺疾病双重打击模型
A. 实验条件（图2 ）

图 2。设置实验室。
定制的有机玻璃室连接到加湿器和通风机。吸入氧气分数 (FiO 2 ) 为 0.65的加湿氧气以10 L/min 的流速通过高氧室（空气室的 FiO 2为 0.21）。电力实验室记录系统记录房间内的温度、湿度和氧气水平。湿度和温度分别保持恒定在 50%–60% 和22 °C。光以 12 小时昼/夜的节奏循环。示意图下方包含真实设置以供比较。

B. 时间交配
1. 使用 C57BL/6J 小鼠。
2. 育种者被安置在增强的无特定病原体 2 条件下。
3. 雌性饲养员的准备：
a. 选择 6-14 周大的女性进行考虑。
i. 年轻的女性可能没有性成熟。
ii. 年长的雌性交配不太可靠。
b. 在定时交配前一到两周，将雌性聚集在一起。
将雌性分组以同步它们的发情周期。这种现象被称为“Lee-Boot 效应” （Van Der Lee and Boot，1955）。
c. 在定时交配前三天，将螺柱公笼中的材料放入母笼中。
将饲养的雌性小鼠暴露于雄性小鼠的尿液中会增加暴露后第三天晚上排卵的机会。这种现象被称为“惠顿效应” （Whitten，1956）。
4. 雄性种鸡的准备：
a. 选择 6-14 周大的男性。
偏好证明种马男性，因为性经验提高男性生殖能力（斯瓦尼等。 , 2012) 。
b. 在定时交配前一到两周，将雄性雄性分开。
这使得精子数量增加，性欲从之前的任何交配中恢复。
5. 定时交配：
a. 将 1 – 2 只雌性和一只雄性雄性一起放在笼子里。
b. 早上检查粘性阴道塞。
i. 男性射精的成分凝结形成硬塞，阻塞阴道开口，是交配的指标。然而，37.1% 的塞子女性没有怀孕（Heyne 等。 , 2015) 。
ii. 如果怀孕，阳性插头被认为是胚胎年龄 (E)0.5。
c. 在一起 48 小时后，分开繁殖对。

C. 早孕检测
1. 监测女性的体重增加。
怀孕小鼠从 E0 到 E7平均增加 3.49 g – 10 （海恩等。 , 2015) 。
或者
2. 在 E12 处用拇指和食指触诊怀孕大坝的腹部。
积极的怀孕感觉就像一串珠子。

D. E14产前炎症命中1
1. 向母畜腹腔注射脂多糖 (LPS)：
a. 确定大坝的体重。
b. 准备 LPS 注射。
i. 在注射用水中重构 LPS 粉末。
ii. 注入的最终浓度为 150 µg/ kg。
iii. 注入的最终体积为 1 µL/g。
c. LPS 注入大坝的右下象限（图 3 ）。
与 ip 注入相关的不良事件与注入位置的错误有关。确保针头穿过腹部的皮肤、肌肉和腹膜，而不会穿透任何腹部器官。
d. 密切监测大坝以确保动物的福利。
如果发生流产，人道地对大坝实施安乐死并进行尸检。

图 3。妊娠第 14 天 LPS 腹腔注射部位

E. 产后炎症2
1. 大坝在 E19 - 21 在肺发育的囊状阶段自然分娩幼崽（Backstrom 等人， 2011）。
2. 囊状阶段最容易受到小鼠肺损伤（Backstrom 等。 , 2011) ，与妊娠 24-38 周的早产人类婴儿相当(Swaney 等。 , 2012) 。
3. 在出生后 24 小时内，将幼崽和大坝随机分配给以下任一者：
a. 高氧（FiO 2为 0.65）
发展心肺疾病
b. 正常室内空气（FiO 2 of 0.21）
对照动物
4. 设置寄养对以避免大坝中的氧气中毒；将一只大坝与高氧笼中的幼崽与另一只大坝和空气笼中的幼崽配对。
如果交货数量为奇数：
a. 将额外的水坝分配给一个航空组。
或者
b. 将额外垃圾中的幼崽分配到实验下的其他垃圾中。
5. 选择实验端点以确定不同的读数。
a. 三天 65% 高氧
肺免疫：
幼崽出生后暴露于高氧会立即引起 IL-1 和 2 型细胞因子肺免疫反应，这在出生后的前三天最为明显。因此，我们看到肺 IL-1 β （20 倍）、IL-1 受体拮抗剂（2 倍）增加（Nold 等。 , 2013;鲁德洛夫 et al., 2017) 2 型细胞因子（IL-4、IL-5、IL-13）（4 至 53 倍）和 2 型趋化因子（CCL1、CCL17）（11 至 31 倍）（老挝等。 , 2022) 。
b. 五天 65% 高氧
i. 肺免疫
调节所有先天淋巴细胞 (ILC) (Plzf 和 Id2) 和 ILC2 (Tcf7 和 Bcl11b) 发育的转录因子在高氧(Lao 等人， 2022）。高氧后 T H 2 细胞增加 2 倍（老挝等人， 2022）。
ii. 肺血管生成
高氧使小鼠肺中的血管内皮生长因子升高 1.4 倍，内皮素 1 升高 1.4 倍（Bui 等人， 2019）。
c. 14 天 65% 高氧
i. 肺泡
肺泡结构的早期变化(Nold et al. , 2013) 。
d. 28 天 65% 高氧
i. 结构变化
1）。肺泡
28天标志着小鼠肺发育的肺泡阶段结束，类似于人类 2-3 岁（ Backstrom 等人， 2011）。高氧减少肺泡数量 (25 % – 4 4%), 增加肺泡大小 (40% – 230%), 并降低表面/体积比 (18% – 35%) (图 4 ) (Nold 等。 , 2013;罗伊斯等。 , 2016;鲁德洛夫等人， 2017）。肺泡中的这些肺气肿变化通过降低肺的弥散能力而损害肺功能（Pellegrino 等。 , 2005)

图 4。与 C57BL/6J 小鼠的空气对照相比，产前 LPS 和出生后暴露于 65% 高氧后 28 天肺形态的肺气肿变化（H&E 染色）（来自Rudloff 等。 , 2017)。比例尺 100 µm， × 200 放大倍数。

2）。航空公司
高氧增加气道上皮厚度 (25%)、上皮下胶原蛋白沉积 (200%)、α-平滑肌肌动蛋白 (50%) 和增殖标志物 cyclin D1 mRNA (260%) 的表达(Royce 等。 , 2016) 。然而，高氧不会改变气道杯状细胞粘液的产生（Royce等人，2016 年）。
3）。肺血管床
高氧减少了小血管（直径 4 – 5 µm）的数量（84%）（Bui 等人，2019；Lao 等人，2022）。高氧后 α-平滑肌肌动蛋白和 A 型内皮素受体的表达没有差异（Bui 等，2019）。
4）。心
高氧会增加心脏纤维化（2.2 倍）和纤维化/炎症标志物 galectin-3 和 CCL2（CC 基序）（Bui 等。 , 2019) 。
5）。脑
高氧不会导致 C57Bl/6J 小鼠的细胞凋亡、皮质神经元分层、颞叶皮质宽度（在海马）、白质髓鞘形成、出血、神经元丢失、神经胶质增生、炎症或任何其他显着的形态学异常（Rudloff 等。 , 2017) 。
ii. 功能变化
1）。体内
通过超声心动图测量，与峰值速度/右心室射血时间成反比的替代标记时间在高氧幼崽中增加（0.27 与空气对照中的 0.32 相比）（Bui 等人， 2019；老挝等。 , 2022) 。
2）。离体
与精确切割的肺切片中的空气 (44%) 相比，高氧会增加气道对毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂乙酰胆碱 (10 – 3,000 nM) (89%) 的管腔收缩 (Royce et al., 2016)。精确切割的肺切片中的高氧不会改变血管收缩剂内皮素 1 和 U46619的肺动脉收缩（Bui 等人，2019 年）。
iii. 肺细胞免疫
高氧后，免疫细胞（中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞、自然杀伤细胞和树突细胞）的总数大约降低了 3.1 倍。然而，巨噬细胞和树突状细胞的活化增加，以及 IL-1 β 升高，在肺中仍然很明显（ Nold 等人， 2013 年）。
e. 60 天（28 天高氧，32 天室内空气）
高氧减少了鼠肺中每一代分支的血管数量（第 2 代为-18%，第 3 代为-21%）（Bui 等人， 2019）。

F. 保持全面的实验记录
1. 使用功率实验室仪器和 Chart 5 Pro 软件记录氧气应用、温度和湿度。
2. 记录动物福利评估。

G. 崽的培育（图 5 和视频 1 ）
成年小鼠比新生小鼠更容易受到高氧诱导的氧毒性（Frank 等。 , 1978) 。因此，大坝需要以三天的周期在室内空气和高氧组之间轮换，以限制高氧引起的毒性。重要的是要及时进行此程序，以便动物尽可能长时间地处于实验条件下。在此步骤中补充食物和水，以尽量减少不必要的高氧室打开。
1. 从空气和高氧室中取出笼子。
2. 一次拿一对一个高氧和一个空气笼。
a. 在成对的笼子之间交换幼崽
i. 空气幼犬将被移入先前处于高氧状态三天的笼子中。
ii. 高氧幼崽将被转移到之前在空气中三天的笼子中。
b. 用新笼子里的垫料覆盖幼崽
i. 这个过程掩盖了另一个大坝的气味。
ii. 这减少了被寄养坝拒绝的可能性。
c. 重复所有配对的笼子
3. 将笼子送回空气和高氧室。
a. 幼犬处于相同的条件下。
b. 以前在高氧室中的水坝现在被安置在气室中；然而，幼崽仍处于分配的实验条件下。
c. 以前在气室中的水坝现在被安置在高氧室中；然而，幼崽仍处于分配的实验条件下。

图 5. 幼崽的培育。
高氧动物（红色），空气动物（蓝色）。气坝每三天旋转一次进入高氧室。高氧坝每三天旋转一次进入气室。幼崽每三天在水坝之间进行交叉培育，因此，从第 1 天起，它们就被连续安置在相同的实验条件下。

视频 1. 幼崽的培育

H. 新生幼崽皮下注射（图6）
1. 轻轻揉搓幼崽。
提起颈部以上的皮肤。
2. °角插入注射器。
3. 慢慢地注射幼崽。
4. 慢慢拔出针头以防止泄漏。

图6. 11 日龄 C57BL/6J 幼犬皮下注射

I. 28 日龄幼犬肺组织学和肺免疫的样品制备
1. 用异氟醚按开滴法麻醉幼犬（Risling等人，2012 年）。
2. 安乐死小狗
a. 颈椎脱位
i. 将拇指和食指放在动物的头部和颈部之间。
注意：脊柱应该是可触及的。
ii. 将拇指和食指捏在一起，同时向下推，直到颈椎完全分开。
1）。确保您不要施加太大的压力，因为气管需要完好无损，以便以后肺部充气。
2）。用镊子捏住脚，以确保在解剖前鼠标已经死亡。
3. 解剖（图7 、图 8和视频 2 )
a. 将鼠标固定在其背部的泡沫解剖板上，四肢展开。
b. 用缝线钩住老鼠的门牙；然后，拉紧并固定在泡沫板上。
该程序有助于拉直气管，以实现更好的充气。
c. 解剖鼠标
i. 从胸骨到下巴穿过鼠标的腹面。
ii. 打开胸腔，使整个肺可见。
iii. 暴露气管。
1）。气管被甲状腺包围。
2）。用镊子夹住甲状腺并拉开以取出。
3）。用浸泡在 PBS 中的纱布擦去任何多余的血液或使用棉尖涂抹器。
4）。巧妙地切掉气管周围的组织，使镊子可以到达下方。
5）。在气管下方放置两根缝合线。
d. 肺免疫样本
i. 确保左叶清晰可见。
ii. 用镊子握住缝合线，在肺左叶周围环绕一条缝合线，然后用棉尖涂抹器提起肺叶。
器官会粘在棉花上而不会被撕裂或损坏。暴露于高氧的肺很脆弱。
iii. 现在将缝合线绕在左细支气管周围并将左叶系好。
iv. 确保结紧，以便在右肺充气期间不会发生泄漏。
v. 切断左系叶，切成两半，并放置在单独标记的 1.7 mL 微管中。立即在液态 N 2中快速冷冻（遵循您机构的所有安全协议），以便以后进行 mRNA 和蛋白质分析。
储存在-80 °C ，直到准备好进行处理。
e. 右肺叶膨胀
i. 将 24G 套管插入气管。
ii. 用之前在气管下方穿过的缝合线之一将套管系在适当的位置。
iii. 将套管连接到重力灌注装置。
iv. 2 O 的静水压力下，用 4% PFA (pH 7.4) 注入右肺叶。
1）。用 PBS 重构 PFA 粉末。
2）。完全充气是由后腔静脉叶尖转折决定的。
v. 用套管前面的第二条缝合线将气管系好，以防止 PFA 回流。
vi. 将小狗放在冰上 10 分钟。
f. 组织学样品
i. 从胸腔取出右肺叶，并用 4% PFA 放入管中。
ii. 保持在 4% PFA 中至少 6 小时。
iii. 石蜡包埋和切片的过程。

图 7. 28 天大小鼠的样品制备。
解剖 mo使用并打开胸腔以暴露肺部和气管 (A)。系好左支气管并取出左肺，以便以后分析肺免疫 (B)。用 4% 的多聚甲醛为组织学 (C) 充气右肺叶。

图 8 。小鼠的肺解剖。
左叶 (E) 和右叶 [上叶 (A)、中叶 (B)、下叶 (C) 和后腔叶 (D)]。在第 28 天，左叶被移除用于肺免疫分析（RNA 的顶部三分之一，蛋白质的底部三分之二）。右叶随后用 4% 多聚甲醛膨胀，组织学切片由下叶制成。

视频 2 。 28 日龄小鼠肺组织学和肺免疫的样品制备

致谢

作者承认应用该协议的原始研究论文（Nold 等人，2013； Royce等人，2016； Rudloff 等。 , 2017; Bui 等人，2019 年；老挝等。 , 2022) 。作者感谢 Ina Rudloff、Christine Bui 和 Elizabeth Skuza 在双重打击模型方面所做的大量工作。研究人员得到了共同资助的莫纳什研究生奖学金 (SPG) 的支持；澳大利亚国家心脏基金会未来领袖奖学金 (CF14/3517)、2019 年菲尔丁奖学金和 NHMRC 调查员补助金 1173584（给 CAN-P.）；以及哈德逊研究所的明星招募奖学金、莫纳什大学的拉金斯奖学金和 2017 年菲尔丁基金会奖学金（至 MFN）。该研究还得到了澳大利亚同步加速器（EU9230、M8925 和 M9422 给 CAN-P. 和 MFN）、CSL Ltd.（给 CAN-P. 和 MFN）、杰克布罗克霍夫基金会（JBF3105 至CAN-P. 和 MFN），来自 Rebecca L. Cooper 基金会和 Perpetual 的 2016 年影响慈善计划（IPAP201600780 至 CAN-P.），以及维多利亚州政府的运营基础设施支持计划。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

双重打击模型协议得到了莫纳什大学动物审查委员会 MMCA 的批准。

参考

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