材料与试剂

1.1 .5 mL 离心管（诚林，目录号： CL22091809 ）
2.显微镜载玻片（CITOTEST，目录号：10127101P-G）
3.显微镜盖玻片（CITOTEST，目录号：10212222C）
4.定性滤纸（贝木，目录号：10 1 ）
5.60 毫米圆形培养皿（金典，目录号： 16021-1 ）
6.实验用铝箔（ Z aowufang ，目录号： 615 ）
7.1 mL s注射器（ Zhi Yu，目录号：V500111）
8.单刃刀片（ P ersonna ，目录号： 84-0701 ）
9.次氯酸钠溶液（阿拉丁，目录号：S101636）
10.Murashige和S koog 基础培养基（ Sigma，目录号： M5519 ）
11.蔗糖（ Hushi ，目录号：100 21418 ）
12.氢氧化钾（ Hushi ，目录号：100 17008 ）
13.甲醇（阿拉丁，目录号：M116115）
14.醋酸盐（阿拉丁，目录号：A116172）
15.乙醇（阿拉丁，目录号：E130059）
16.盐酸（阿拉丁，目录号：H399657）
17.亚硫酸氢钠（胡适，目录号：10019018）
18.Phytagel （Sigma，目录号：P 8169 ）
19.高碘酸（Sigma，目录号：P0430）
20.碘化丙啶（ Sigma-Aldrich，目录号： P4170 ）
21.氯醛水合物C-IVN （ Sigma-Aldrich，目录号： 15307 ）
22.甘油（ Sigma-Aldrich，目录号： G7893 ）
23.胶来自金合欢树的阿拉伯语（ Sigma，目录号： G9752 ）
24.固体 MS 介质（参见配方）
25.固定液（见配方）
26.1% 高碘酸溶液（见配方）
27.伪席夫碘化丙啶溶液（见食谱）
28.氯醛水合物溶液（见食谱）
29.霍耶溶液（参见食谱）
30.乙醇溶液（见食谱）

设备

1.镊子（维纳斯， # 5 ）
2.解剖显微镜（蔡司，型号： Axio Zoom V16）
3.激光扫描共聚焦显微镜（蔡司，型号： 780 ）
4.生长室（ Percival ，型号： CU36L5 ）
5.通风柜
6.干净的长椅

程序

A.拟南芥幼苗生长

1.用 1 mL 的 ddH 2 O 将拟南芥种子浸泡在 1.5 mL 离心管中，并将管置于室温下 1 小时。
2.倒出所有液体，用 15%的次氯酸钠溶液对拟南芥种子进行消毒。摇_ 用手将管子彻底浸泡 10 分钟。
3.在在无菌洁净工作台上，从试管中倒出次氯酸钠溶液，并用1 mL无菌ddH 2 O清洗种子 3-5 次。然后，将种子在 4°C 下放置三天以打破休眠。
4.在无菌洁净工作台上，将种子放在装有固体 MS 培养基（见食谱）的圆形培养皿上，并用微孔胶带密封板。建议为后续实验准备每种条件的 50 株幼苗。
5.将固体 MS 培养基板置于 16 小时/22°C 光照和 8 小时/18°C 黑暗条件下的生长室中 9 天（或任何所需的生长条件）。使用 9 天大的幼苗进行后续实验。

B.SAM 解剖

1.使用单刃刀片，切割子叶和根，将其他组织与芽分开，并使下胚轴与芽尖相连（图 1A 和 1B）。
2.将 30 个芽尖添加到含有新鲜制备的固定液（参见食谱）的离心管中，并在4°C 下放置过夜（图 1C）。
3.倒出固定液并用ddH 2 O两次清洗芽尖。
4.倒掉水，加入 30% 乙醇溶液15 分钟。使用 50% 、70%、80%、90%、95% 和 100% 乙醇系列重复此步骤（见食谱）。
注意：在此脱水阶段，芽尖会因乙醇处理而变白（图 1D）。

图 1.拍摄技巧的准备。 A. 9 日龄植物的解剖显微镜图像。比例尺： 1,000微米。 B. 解剖带有下胚轴的芽尖的显微镜图像。比例尺：1,000微米。白色虚线标记叶柄的基部。使用单刃刀片沿虚线切割子叶和根。 C.在固定液中含有芽尖（绿色）的离心管。 D. C离心管，含有100% 乙醇中的芽尖（白色）。

5.在室温下将拍摄技巧转移到新的 100% 乙醇中过夜。
注意：在此阶段，您可以将拍摄技巧在-20 °C 的乙醇中保存数周。
6.用 100% 乙醇将芽尖转移到 60 mm 圆形培养皿中，并将培养皿置于解剖显微镜下（图 2A）。然后，用镊子抓住下胚轴（图 2B），并在解剖显微镜下使用注射器针头从茎尖取出微小的真叶（图 2C - 2E）。随后，用 100% 乙醇将芽尖转移到 1.5 mL 离心管中。
笔记：这个样品很小，很容易破碎；一定要轻轻用溶液清洗样品在随后的实验中。

图 2.拍摄技巧的解剖。 A. 在 100% 乙醇中含有芽尖的圆形培养皿。 B. 在解剖显微镜下使用注射器针头或镊子解剖芽尖。 C. 解剖前解剖芽尖的显微镜图像。箭头表示下胚轴；白色虚线标记叶柄的基部。比例尺：500微米。 D. 解剖前从顶部拍摄的拍摄技巧图像。白色虚线标记叶柄的基部。比例尺：500微米。用镊子夹住芽尖的下胚轴，并使用注射器针头或镊子沿虚线取出叶子。 E. 解剖后拍摄尖端的显微镜图像。比例尺：500微米。

C.SAM 染色

1.小心取出100% 乙醇，加入 95% 乙醇溶液15 分钟。使用 90% 、80%、70%、50%、30% 和 15% 乙醇系列和ddH 2 O重复此步骤。然后，用ddH 2 O清洗拍摄技巧一次。
2.去除水仔细加1 毫升_ 1%高碘酸溶液（见食谱） 40 分钟。然后，用ddH 2 O两次清洗芽尖。
3.去除水仔细加1 毫升_ 伪希夫碘化丙啶溶液（参见食谱） 2 小时。用铝箔包裹离心管以保护芽尖免受光照。
注意：在这个阶段，芽尖会从伪希夫碘化丙啶溶液中变成粉红色。在后续实验中保护拍摄技巧免受直射光的影响（图 3A）。
4.小心地取出伪希夫碘化丙锭溶液和用ddH 2 O两次清洗芽尖。
注意：由于碘化丙啶有毒，废弃的伪希夫碘化丙啶溶液需要特殊的废物容器。
5.转移到显微镜载玻片上，并用定性滤纸吸干样品周围的液体。然后，滴入 10 – 20 μL的氯醛水合物溶液（参见食谱）并在室温下避光放置20-30分钟（图 3C）。
注意：在此阶段，芽尖将从水合氯醛溶液处理中变得透明（图 3B）。
6.去除氯醛用定性滤纸水合溶液并滴入 100 μL霍耶氏溶液（参见食谱）以覆盖芽尖。然后，小心地放下显微镜盖玻片，避免气泡（图 3D）。
7.将幻灯片在室温下避光放置三天。您可以将载玻片在室温下保存数周。

图 3. 芽尖染色。 A. C离心管含有假希夫碘化丙啶溶液中的芽尖。芽尖是粉红色的。 B. 在水合氯醛溶液处理过程中解剖芽尖的显微镜图像。比例尺：500微米。 C. 在水合氯醛溶液中带有芽尖的显微镜载玻片。箭头表示芽尖。 D.在霍耶溶液中带有芽尖的显微镜载玻片。箭头表示芽尖。

D.SAM 成像

1.观察带有显微镜物镜（Plan-apochromat 40 × /1.3 Oil DIC M27）的蔡司 780 激光扫描共聚焦显微镜下的拍摄技巧。
2.设置通道参数为：激发波长514 nm；发射波长 566 – 658 nm；激光强度约为 20%。
3.将变焦设置为 5倍以放大图像；分辨率为 1,024 × 1,024。将扫描参数的速度设置为 7。通过调整 z 轴观察和成像整个 SAM 中的不同细胞层。如果你想要一层细胞，将扫描模式设置为xy记录；如果您想要完整 SAM 的图像，请将扫描模式设置为 z-stack 集合。在x, y, z 采集模式下，设置参数“line averaging”以获得良好的质量。在 SAM (Z10) 的中央层，您可以观察到典型的三层细胞（图 4）。

图 4.拍摄技巧的成像。使用激光扫描共聚焦显微镜获得的具有不同 z 轴的一系列SAM 图像。箭头表示 SAM； P表示叶原基； Z表示不同的z轴； Z10 中的白色虚线标记细胞层。比例尺：50微米。

食谱

1.固体质谱培养基
将 4.4 克M urashige和S koog 基础培养基和 10 克蔗糖溶解在 1 L ddH 2 O中。通过添加氢氧化钾将 pH 值调节至 5.8。然后，加入 3 克植物凝胶和高压灭菌器。

2.固定液
添加 5 mL甲醇和 1 mL醋酸盐溶于 4 mL ddH 2 O。该溶液应在使用前新鲜配制。

3.1%高碘酸溶液
将 0.1 g高碘酸溶解在 10 mL 的 ddH 2 O中。该溶液应在使用前新鲜配制。

4.伪席夫碘化丙锭溶液
将 0.1 g 亚硫酸氢钠和 100 μg碘化丙锭溶解在4.9 mL ddH 2 O中。加入62.5 μL氢氯酸。
此溶液应避光保存并在使用前新鲜准备。

5.水合氯醛溶液
溶解8克氯醛水合物在2 mL 的 ddH 2 O中加入 1 mL的甘油。
此溶液可在室温下长期保存。

6.霍耶溶液
溶解6克口香糖_ 阿拉伯 i n 10 mL ddH 2 O一天；然后，加入 5 mL甘油和 40 g 氯醛水合物。
等待 10 天后再使用；该溶液可避光长期保存。

7.乙醇溶液
所有乙醇溶液均使用 100% 乙醇和 ddH 2 O 按体积比制备。 100%乙醇是指无水乙醇。

致谢

这项工作得到了中国国家自然科学基金的资助。该协议是根据以前的出版物 (Li et al ., 2022) 修改的。作者感谢中国北京首都师范大学生命科学学院影像中心。

利益争夺

作者声明不竞争经济利益。

参考

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