材料和试剂
1. 150 毫米培养皿（康宁，目录号： 430599）
2. 100 毫米培养皿（康宁，目录号： 430167）
3. 6孔平底塑料板（Corning，目录号：CLS3335 ）
4. 微米粉食物（斑马鱼幼虫食物）（Sera）
5. 27 G 针尖（Terumo，目录号：NN-2719S）
6. 塑料滤茶器（从当地超市购买）
7. 转基因斑马鱼系Tg ( fabp10a:mCherry-T2A-Twist1a-ER T2 )
8. 转基因斑马鱼系Tg ( fabp10a:TA; TRE:xmrk ; krt4:GFP ) 称为xmrk
注： Tg ( fabp10a:mCherry-T2A-Twist1a-ER T2 ) 和Tg ( fabp10a:TA; TRE:xmrk ; krt4:GFP ) 可应新加坡国立大学生物科学系龚志远教授的要求提供，新加坡。
9. 强力霉素（Sigma-Aldrich，目录号：D9891）
10. 4-羟基三苯氧胺（4-OHT）（Sigma-Aldrich，目录号：H6278）
11. 甲基纤维素（Sigma-Aldrich，目录号：M7027）
12. 苯氧乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：77699）
13. NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
14. KCl （Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
15. MgSO 4 ·7H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：M2773）
16. CaCl 2 （Sigma-Aldrich，目录号：C4901）
17. 多西环素原液（参见食谱）
18. 4-羟基他莫昔芬原液（见食谱）
19. E3 培养基（见食谱）
20. 30% 甲基纤维素（w/v %）（见食谱）
21. 苯氧乙醇 (v/v %)（见配方）

设备

1. 循环水养殖系统（水产栖息地）
2. 荧光显微镜（Olympus，目录号： MVX10）
3. Leica TCS SP5X 共聚焦显微镜系统（徕卡）
4. 斑马鱼胚胎培养箱（AQUALYTIC，目录号：2418210）
5. 外罐，斑马鱼养殖罐的一个组成部分（ Tecniplast ，目录号：ZB10BTE）
6. 穿孔内罐，斑马鱼养殖罐的一个组成部分（ Tecniplast ，目录号：ZB10BTI）
7. 聚碳酸酯隔板，斑马鱼养殖箱的一个组件（ Tecniplast ，目录号：ZB10BTD）
8. 聚碳酸酯盖（ Tecniplast ，目录号：ZB10BTL）

软件

1. 图像分析软件Imaris 8 ( Bitplane )

程序

A. 斑马鱼产卵（第 0 天）

1. 在收集胚胎的前一天晚上，将成对的雄性xmrk鱼和雌性Twist1a-ER T2鱼安排在带分隔器的斑马鱼繁殖罐中。
2. 清晨，取下隔板让鱼产卵。
3. 用塑料滤茶器舀出胚胎。
4. 将胚胎转移到含有 E3 培养基的 150 毫米塑料盘中。
5. 用吸管取出死胚胎。
6. 在 27°C 的培养箱中将胚胎保持六天。
7. 每天更换 E3 培养基并用移液器去除死胚胎。
笔记：
a. 成年Twist1a-ER T2和xmrk转基因斑马鱼系在新加坡的环境水温约为 28°C 的循环水产养殖系统中维持。 6–8 对雌性杂合子 Twist1a-ER T2转基因鱼和雄性杂合子xmrk转基因鱼在繁殖缸中杂交（每个缸一对）。年轻的成年斑马鱼（3-9 个月大）优先用于杂交。设施内的电灯从 07:00 到 19:00 打开。每天在 08:30、10:30、12:30、14:30 和 16:30 将丰年虾喂给两种斑马鱼系五次。
b. 新加坡国立大学的 Fish 设施与室外相连。因此，该设施没有空调，设施内的室温在 25 °C 和 30 °C 之间波动。胚胎和幼虫保存在 27°C 的培养箱中。因此，所有幼虫斑马鱼都保持在 27°C，以确保斑马鱼发育的一致性。
c. 如果需要特定的发育阶段，胚胎应在 28.5 °C 的最佳条件下生长，以允许胚胎和幼虫的标准发育（韦斯特菲尔德，2007 年）。
d. dpf开始喂养斑马鱼幼虫。在 1 mL E3 培养基中稀释一小撮微米粉，每天早上添加到斑马鱼幼虫中。在 8 到 11 dpf之间的时间点将斑马鱼幼虫转移到 6 孔板的每个孔中，每天早上向每个孔中加入几滴 E3 培养基。

B. 收集Twist1a-ER T2 / xmrk双转基因斑马鱼（第 6 天）

1. 将斑马鱼幼虫转移到 50 mL 管中。
2. 要麻醉鱼，请将 2%（v/v）苯氧乙醇添加到 E3 介质中，并使用含有鱼的微米粉末。因此，苯氧乙醇的最终浓度为 0.02%。
3. 将鱼排列在 150 毫米塑料盘的盖子上。
4. 在荧光显微镜下可视化并使用移液器收集在皮肤中表达绿色荧光蛋白 (GFP) 的鱼(图 2)。

图 2. Twist1a-ER T2 / xmrk双转基因斑马鱼以皮肤特异性方式 (A)表达绿色荧光蛋白 ( GFP) ，以肝脏特异性方式 (B) 表达mCherry 。受精后 6 天 ( d pf ) Twist1a-ER T2 / xmrk双转基因斑马鱼中GFP 和mCherry信号的代表性图像。比例尺，200 μ m 。

5. 在 GFP 阳性鱼中，在荧光显微镜下可视化并使用移液器收集表达mCherry的鱼在肝脏（图2）。
6. 将收集到的鱼转移到含有 E3 培养基的 150 毫米塑料盘中。
7. 在 27°C 的孵化器中将鱼保持两天。
笔记：
a. 在 6 dpf时， Tg (fabp10a:mCherry-T2A-Twist1a-ER T2 ) 开始以肝脏特异性方式表达编码 mCherry-T2A-Twist1a-ER T2的基因。 Tg (fabp10a:TA; TRE:xmrk ; krt4:GFP)以皮肤特异性方式表达GFP 。因此， Twist1a-ER T2 / xmrk双转基因斑马鱼在肝脏和皮肤中分别显示为mCherry和 GFP 阳性。
b. 筛选过程分为两个步骤。首先，拥有xmrk转基因的斑马鱼在 3-5 dpf进行筛选，然后在 6 dpf筛选具有 Twist1a-ER T2转基因的xmrk转基因斑马鱼。
c. 斑马鱼幼虫不应在 150 毫米板中过度拥挤，因为过度拥挤会对它们的生存能力产生负面影响。到 6 dpf时， 150 毫米板中可以维持100 – 300 条斑马鱼幼虫。 6 dpf后，150 mm 板中最多应保留 100 只斑马鱼幼虫。

C. 原发性肿瘤诱导（第 8 天）

1. 将最多10 0 只斑马鱼幼虫与 100 mL 的 E3 培养基一起放入 150 mm 的盘子中。
2. 在 8 dpf时，在 E3 培养基中用 30 μ g /mL 强力霉素处理鱼三天。
3. 每两天更换一次含有多西环素的 E3 培养基。
注： 100μL 将多西环素原液 (30 mg/mL) 添加到 100 mL E3 培养基中。

D. 化学处理（第 11 天）

1. 8和 11 dpf之间的时间点，将大约 20 只斑马鱼幼虫放入 6 孔板的每个孔中，其中含有 8 mL 的 E3 培养基，其中含有多西环素（30 μ g /mL）。
2. 将每种测试化学品以 5 μ mol /L的最终浓度添加到板的每个孔中。
注意事项：
a. 所有测试化学品都溶解在 DMSO 中，浓度为 10 mmol/L（储备溶液）。
b. 4微升_ 每个库存解决方案 (10 mmol/L) 用 100 μ L E3 培养基稀释，并添加到含有 8 mL E3 培养基的板的每个孔中。

E. 化学物质存在下的转移性传播诱导（第 11.5 天）

1. 添加测试化学品后 12 小时开始，在 E3 介质中用 0.1 μ mol /L 的 4-OHT处理鱼五天。
2. 改变含有多西环素的 E3 培养基， 4-OHT，每两天测试一次化学品。
笔记：
a. E3 培养基的质量对于斑马鱼幼虫的存活至关重要。鱼排泄包括尿液在内的废物。废料和剩余食物对鱼的生存能力有害。因此，应在达到高浓度废物之前更换 E3 介质。
b. dpf后每两天更换一次 E3 培养基。

数据分析

时间：第 16 天
1. 在第一次添加 4-OHT 后五天，将斑马鱼幼虫转移到 50 mL 管中。
2. 要麻醉鱼，请将 160 μ L的 2% 苯氧乙醇（v/v）添加到含有鱼的 E3 培养基中。苯氧乙醇的最终浓度为 0.02% (v/v)，总体积为 16 mL。
3. 将鱼排列在 100 毫米塑料盘的盖子上。
4. 一滴 3 0% 甲基纤维素嵌入鱼。
5. 使用 27 G 针尖将鱼手动定位到横向视图。
6. 在荧光显微镜下确定鱼体内细胞传播的模式。
7. 来自肝脏的mCherry标记细胞的每种传播模式的鱼的数量。
8. 使用 Leica TCS SP5X 共聚焦显微镜系统以 8 μ m Z 步间隔捕获鱼的连续切片。使用图像分析软件Imaris ( Bitplane )处理 Z 堆栈图像。
笔记：
a. 传播模式通常分为三类：（ i ）局部传播，其中传播的mCherry阳性细胞存在于肝脏附近； (ii) 腹部传播，其中细胞遍布整个腹部； (iii) 远距离传播，其中在从躯干到尾巴的广阔区域观察到细胞（图 1）。
b. 通过比较试验药物治疗组和媒介物治疗组中显示腹部和远距离传播模式的鱼的频率，评估试验药物的抑制作用。
c. 通过在荧光显微镜下观察鱼来对传播模式进行分类。为了避免偏见，实验者应该对治疗视而不见。

限制

Twist1a-ER T2 / xmrk双转基因斑马鱼的数量是有限的（几百条）。此限制决定了在一次筛选过程中可以测试多少化学品。要测试一种化学品，大约需要 20 条双转基因鱼。遵循孟德尔定律，当杂合子Twist1a-ER T2时，双转基因鱼的生产率为 25% 转基因斑马鱼与杂合子xmrk杂交转基因斑马鱼。如果要测试 20 种化学品，至少需要 400 条双转基因鱼。准备 400 条双转基因鱼，一对Twist1a-ER T2 和 xmrk鱼需要产生大约 2,000 个胚胎。因此，当遵循上述协议时，最多可以评估 20 种测试化学品。

食谱

1. 多西环素原液
试剂终浓度数量
强力霉素 50 毫克/毫升 500 毫克
DDH 2 O 不适用 10毫升
全部的不适用 10毫升

2. 4-羟基他莫昔芬原液
试剂终浓度数量
4-OHT 100毫米 387 毫克
乙醇不适用 1,000 毫升
全部的不适用 1,000 毫升

3. E3 介质
试剂终浓度数量
氯化钠 5.0毫米 0.292 克
氯化钾 0.17毫米 0.013克
MgSO 4 · 7H 2 O
氯化钙2
DDH 2 O
全部的 0.33毫米
0.33毫米
不适用 0.081克
0.048 克
1,000 毫升
1,000 毫升

4. 30% 甲基纤维素 (w/v %)
试剂终浓度数量
甲基纤维素 30% 30克
DDH 2 O 不适用 100 毫升
全部的不适用 100 毫升

5. 苯氧乙醇 (v/v %)
试剂终浓度数量
苯氧乙醇 0.02 % 20微升_
DDH 2 O 不适用 100 毫升
全部的不适用 100 毫升

致谢

图形摘要由 Ami Inoue（京都艺术大学）绘制。本研究由新加坡教育部 (MOE2019-T2-2-018) 资助给 Z. Gong。该协议源自Nakayama 等人。（2020）。

利益争夺

JN、HM 和 ZG 声明不存在利益冲突。

伦理

研究方案经新加坡国立大学机构动物护理和使用委员会批准（方案编号：096/12）。

参考

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