软件

1.FIJI开源图像分析软件（ https://imagej.net/software/fiji/downloads ）

程序

A.实时成像

1.实时成像如前所述完成（Yap 等人， 2018）。程序简述：
a.Lasiecka和Winckler ，2016 年所述）。也可以使用其他培养的神经元。
b.涂有聚 L-赖氨酸的35 mm 玻璃底微孔板中。 4 小时后，去除铺板培养基并替换为补充有 B27 的无血清培养基，神经元在体外 (DIV) 培养 7-10 天以供实验使用。
c.根据制造商的说明，使用 Lipofectamine 2000 进行转染。
d.所有实时成像均在倒置 LSM880 共聚焦显微镜上使用 40× 水物镜 (LD-C Apochromat 1.2W) 在5% CO 2腔室中的 37 °C 加热台上进行。转盘共聚焦显微镜也非常适合对培养的神经元进行活体成像。根据研究问题，也可以使用更高放大倍率的物镜。
e.使用双向扫描帧模式从单通道或双通道收集图像，激光功率最低，可以使感兴趣的物体可视化。旋转圆盘共聚焦显微镜也非常适合对培养的神经元中的活体细胞器运动进行成像。图像以每秒1 – 2 帧的速度捕获，但移动速度更快的细胞器可能需要更频繁的图像采集。在光漂白变得实质之前，我们通常会捕获 400 – 500 帧（大约 8 分钟）。如果需要更长的成像时间，帧捕获率可以降低（每 3 秒一个，每 10 秒一个），但需要注意的是，非常快速移动的事件将会被遗漏。选择一个单一的焦点位置进行成像，以便大多数细胞器都在焦点上。大多数活动细胞器的速度妨碍了在常用显微镜的实时成像过程中进行 z 堆栈采集。
f.图像保存为 TIFF 文件并在 FIJI 中打开。
注意：我们总是在同一天对同一文化和同一天的图像进行任何实验的所有控制和实验条件。这确保了运动性的任何差异不是由于文化到文化的差异，而是由于实验操作。我们发现这是实验设计和严谨性的一个重要方面。

B.单通道kymograph生产

1.在 FIJI 中打开实时成像图像文件并显示实时成像文件的第一帧。由于树突的位置在实时成像过程中不会改变，因此第一帧可用于跟踪。
2.打开 ROI 管理器（分析 > 工具 > ROI 管理器）。
3.使用 FIJI 中的分段线工具，跟踪从 soma 开始的树突或轴突并延伸到所需的终点，并将此线添加到 ROI 管理器。继续绘图，跟踪其余的树突，并将它们添加到 ROI 管理器（图 1）。具有大量交叉或捆绑的树突被省略。单击 Show All 和 Labels 框以查看所有轨迹。
4.在 ROI 管理器中突出显示跟踪并在 FIJI 中运行多个 Kymograph 插件，该插件包含在其更新版本中。当提示输入线宽时，输入您希望从中制作 kymograph 的树突的像素宽度。在我们的成像条件下，线宽的典型值为轴突 3 个像素和树突 5 个像素。输入线宽后，将生成 kymograph。
5.将此树突的 kymograph 保存为 TIFF 文件。继续从同一细胞的剩余树突中制作 kymographs（如步骤 B3 和 B4）。在我们的成像条件（40× 物镜）中，一个神经元的所有树突在同一个实时成像中同时捕获（参见图 1 中的示例），并且可以从一个实时成像会话中获得多个 kymographs。

图 1。跟踪树突并添加到 ROI 管理器。显示了用 GFP-RILP（Rab 相互作用溶酶体蛋白）转染的神经元的第一个延时帧的单平面图像。使用分段线工具跟踪树突并将其添加到 ROI 管理器中。由于纵横交错的树突，省略了一条痕迹。

6.完成从单元格制作 kymographs 后，将带有跟踪 ROI 的图像保存在它的顶部。为此，请单击图像 > 叠加 > 从 ROI 管理器，然后另存为 TIFF 文件以供参考。这将允许您在未来的任何时候返回到每个细胞，并查看每个 kymograph 来自哪个树突。
注意：潜在问题——如果在成像过程中出现漂白，请使用 FIJI 的漂白校正插件（Miura，2020；https: //imagej.net/plugins/bleach-correction ）。如果在成像过程中遇到显微镜载物台漂移，则FIJI 中存在漂移校正插件 ( https://imagej.net/plugins/manual-drift-correction ) 。

C.Kymograph 分析

存在多个软件包。我们使用了手动分析（ Lasiecka等人， 2010 年和 2014 年）以及 Kymograph Clear/Kymograph Direct 软件（Barford 等人，2018 年）。这些在下面的注释中进行了简要描述。其他程序存在并且也将起作用。
最近，我们使用了KymoButler （Yap 等人，2022 年），这是一种基于网络的软件（ Jakobs等人，2019 年），可通过机器学习进行收费定制。提供免费版本，可输出速度、轨道持续时间和距离。 https://www.wolframcloud.com/objects/deepmirror/Projects/KymoButler/KymoButlerForm 。 KymoButler也可以通过 FIJI 的插件获得https://github.com/fabricecordelieres/IJ-Plugin_KymoButler_for_ImageJ 。
分析： KymoButler输出可以定制，以符合感兴趣问题的所需标准。出于我们的目的， KymoButler被定制为识别单个事件并计算每个事件的数据，包括速度、移动或暂停的持续时间、移动的距离或移动的方向。 KymoButler还创建由多个单独事件组成的囊泡轨迹。除了单个事件之外，还可以为轨迹编译数据。对于整个延时成像的所有囊泡，通常无法从单个事件创建轨迹，但通常可以识别更短的明确轨迹。根据我们的经验，人类用户手动创建的轨迹几乎与KymoButler创建的轨迹相同，因为两者的轨迹分配存在相同的限制（图 2）。

图 2。用于 kymograph 分析的软件输出。原始 kymographs (A) 是根据用户偏好分配的事件（例如，将活动事件定义为≥ 2 µm 运动）(B) 或轨迹 (C)。软件识别的所有事件或轨迹都可以通过多种方式量化，包括速度、方向性、运行长度或暂停时间。

我们发现使用轨迹数据来确定单个囊泡在整个实时成像实验的较长时间内的净运动性而不是单个事件很有用。可以从这些测量中获得净逆行/顺行/静止数据。出于我们的目的，我们将固定轨迹（零净运动）与短（<2 µm）和长（> 2 µm）净运动区分开来。用户可以根据自己的问题选择这些截止值。原始数据包括行进距离的完整读数，并且可以根据用户的意愿分为静止与运动。由于树突中的核内体经常暂停和反向，我们对囊泡的净行为更感兴趣，对单个事件测量不太感兴趣。对于其他问题，用户可能对单个事件数据感兴趣。我们从任何成像细胞上的所有树突创建 kymographs 进行分析（参见图 1），并且不排除树突，除非它们不在焦点或交叉或捆绑中。我们通常将来自一个细胞的所有树突的数据组合成一个运动数据点。因此，用于统计目的的样本数 (n) 通常是一个细胞，而不是一个树突或一个囊泡。我们发现 ~20 个细胞（80-100 个树突）的成像为树突中的核内体运动提供了良好的统计能力。我们建议对来自 3-4 个独立培养物的至少 4-5 个细胞进行成像，并从所有树突中制作 kymographs 以进行统计分析。
KymoButler的机器学习功能，这些 kymographs 是手动建立的。一旦KymoButler的输出与人类用户建立的手动基本事实非常匹配，所有分析都会使用相同的设置。可能需要对不同类型的荧光标记重复这种初始训练，因为背景雾度可能不同，并且相同的设置可能不会产生令人满意的结果。在KymoButler完成以确保准确性后，可以直观地验证每个 kymograph 的事件和轨迹分配。

注意事项：
1. 手动分析：使用 FIJI 中的线工具，手动跟踪 kymograph 上的所有轨迹并将它们保存到 ROI 管理器，如上。使用根据所使用的物镜和相机确定的已知像素大小，可以确定平均速度、逆行和顺行事件以及暂停事件/时间。这既费力又费时，但用户可以最大程度地控制输出。我们通常通过将它们的输出与手动建立的10-20 个 kymographs 的地面真实测量值进行比较来验证软件自动化。
2. Kymograph Clear/Kymograph Direct：开源程序（ Mangeol等人，2016 年）可在线下载并与 FIJI 一起使用。这些是连续的 kymograph 生产和分析程序，可为用户提供有关粒子速度、强度、方向性和运行长度的信息。 http://sites.google.com/site/kymographanalysis 。
D.双通道 kymograph：准备和分析

为了生成双通道 kymographs，我们为 ImageJ FIJI 创建了一个插件，称为KymoMerge （目前仅在使用 Mac 时可用；McMahon 等人，2021）。
1.安装KymoMerge ：从https://github.com/alduston/kymomerge下载。要开始使用合并工具，请打开 FIJI 并在 FIJI 控制台中打开 KymoMerge.py 脚本。该程序可以作为插件安装或从控制台运行。
2.从每个通道输入 kymographs 的目录文件夹（图 3A）。

图 3.KymoMerge工作流程。 (A) 输入目录窗口。此窗口将用于从每个通道中选择包含 kymographs 的文件夹。 (B) 图像阈值窗口。该窗口将用于输入用户为来自每个通道的所有图像单独确定的阈值。阈值取决于背景荧光的水平和信号的亮度。每个用户都需要直观地确定其特定图像的最佳阈值。

来自每个输入目录的文件（单独的 kymograph 文件）应该具有相同的命名。输入目录应该是包含一系列命名的目录。 tif文件，使用命名约定“文件名”-“我”。 tif ，其中i是给定的。 tif文件夹中的“索引”文件。例如，给定“ groupA ”目录中的三个文件，使用“ kymo ”作为文件名，. tif文件将被赋予“kymo-1.tif、kymo-2.tif、kymo-3.tif”。
输入目录 2 应该是包含一系列命名的目录。 tif文件，使用命名约定“文件名”-“我”。 tif ，其中i是给定的。 tif文件夹中的“索引”文件。此索引和文件名应与输入目录 1 的索引相对应。算法会将文件与相应的索引进行比较。例如，给定“ groupB ”目录中的三个文件，像以前一样使用“ kymo ”作为文件名，. tif文件将被赋予“kymo-1.tif、kymo-2.tif、kymo-3.tif”。

3.Kymograph 图像阈值
左侧的对话框和图像出现并显示原始 kymograph 以及用于设置阈值的输入（图 3B）。原始图像的对比度会自动增加，因此数据清晰可见。当用户为阈值选择一个值时（通常为 10-100，具体取决于背景荧光和信号亮度），二值化图像出现并且可以与原始图像进行比较，如右侧的对话框和图像所示。此时，用户可以通过键入“是”或选择“确定”来接受该值，或者通过键入“否”或选择“取消”来尝试新值。接受一个值后，将打开下一张图像。一旦输入文件夹中的所有图像都被阈值化，它们将被处理，输出（单个二进制图像和合并图像）将可用于如上所述的进一步分析。如果用户想在任何时候退出分析，只需在对话框中输入 Quit 即可。
一旦设置了阈值，就会应用它，并将图像从原始图像的位深度转换为八位。然后将其转换为二进制文件并保存。两个通道中的每个像素现在都设置为 0 或 254 的值。
注意：此时使用 8 位图像，因为 16 – 32 位格式在本地插值以实现更大的颜色深度并使直接操作单个像素值更加困难。
然后程序在两个 kymographs 之间逐个像素地比较值并创建一个新图像。如果两个值都为零，或者一个为零另一个为 254，则新图像在该像素处设置为零。如果它们都是 254（两个通道中的正信号），则该值设置为 254。结果是图像仅由两个通道中均有正信号的那些像素组成。这会产生一个包含轨道的 kymograph，其中两个感兴趣的蛋白质位于同一位置，现在可以分析共定位轨道的动态。位于同一位置的 kymographs 文件夹保存在包含原始 kymographs 文件夹的文件夹中的新“输出文件夹”中。输出文件夹包含来自输入文件夹的二值化 kymograph 和新的位于同一位置的 kymograph。该程序将从 kymograph 文件的 A 组目录（通道 1）中打开一个文件，供用户打开阈值，然后是 B 组目录（通道 2）中的相应文件。这将一直持续到所有图像都经过阈值处理。

笔记

1.KymoMerge与手动 kymograph 分析
使用两个样本数据集来测试和验证程序的可靠性和效率。一种由神经元膜蛋白 NSG1-cherry 和 NSG2-GFP 组成。 NSG1 和 NSG2 是神经元特异性蛋白质基因家族的成员。这两种蛋白质都在神经元中高度表达，并定位于树突中的各种内体区室（Yap 等人，2017 年）。我们之前的实时成像数据表明，这两种蛋白质在神经元中共同运输，因此可以作为分析具有低背景噪声信号的两种高度共定位的膜货物动力学的一个很好的例子（图 4A）。第二个数据集包含 NSG1-cherry 和 GFP-RAB7，一种晚期内体标记。 RAB7 是一种小 GTP 酶，参与调节向晚期内吞区室的运输。我们之前已经表明，RAB7 共同运输并调节神经元中 NSG1 的内吞转运（Yap 等人，2017）。与其他 Rabs 一样，RAB7 在被募集到膜时和水解后的失活形式（GDP 结合）和胞质中时不断地在激活形式（GTP 结合）之间循环。此功能使我们能够测试我们的程序从胞质高背景信号中提取膜结合信号的能力（图 4C）。
2.可视化共同定位的轨迹
KymoMerge的典型输出示例。图 4A 显示了来自 NSG1 和 NSG2 数据集的 kymographs，其中 NSG1 为红色，NSG2 为绿色，而图 4C 显示了来自 GFP-RAB7 和 NSG1-mcherry 数据集的示例 kymographs。顶行显示原始 32 位单通道图像，后跟两个通道的叠加。以下是KymoMerge的二进制输出。仔细比较图 4A 中的原始图像，C 与KymoMerge的二进制输出（图 4B 和 4D）显示两者之间的轨迹非常相似。由于KymoMerge输出的二进制性质，它不会显示原始文件中的强度差异，但这不是 kymograph 分析中通常感兴趣的参数。强度差异最初仅用于在创建二进制输出之前的阈值阶段确定背景水平和真实信号。叠加和合并文件的比较也显示出相似的特征。

图 4. 原始图像与KymoMerge生成图像的比较。对两种跨膜蛋白 NSG1-mCh 和 NSG2-GFP（A 和 B）以及具有细胞溶质调节剂 GFP-RAB7（C 和 D）的 NSG1-mCh 进行双重实时成像。每个通道的原始 kymograph 和合并的 kymograph 显示在 (A) 和 (C) 中。由KymoMerge创建的二值化单通道 kymographs显示在 (B)和 (D)中，连同共定位输出 kymograph。共定位像素的最终输出可用于进一步的定量分析。

我们方法的主要优势之一是在合并的二进制数据中看到的任何轨道都是位于同一位置的轨道。相比之下，可能很难辨别原始数据中的重合轨道。
3.KymoMerge的健壮性
只有当程序产生稳健可靠的结果时，我们的方法才有用。我们发现KymoMerge产生的结果与手工仔细计数的结果相当，这通常是分析 kymograph 数据的方式。为此，我们采用了图 4A、B 和 4C、D 中引用的两个数据集，并独立计算了顺行和逆行事件（ ≥ 2 μ m ）手动引用原始数据和叠加数据（如图 4A 和 4C 所示）或使用KymoMerge的合并二进制输出（如图 4B 和 4D 所示）。图 5A 和 5B 中的结果表明，两种方法（Mann-Whitney 检验）之间没有统计差异。

使用原始 32 位图像和KymoMerge创建的 kymographs对顺行和逆行事件 ( ≥ 2 m) 的手动计数之间的比较。 (A) n = 26 个树突，来自 NSG1-mCherry/NSG2-GFP 数据集中的七个神经元。 (B) n = 36 个树突，来自 NSG1-mCherry/GFP-RAB7 数据集中的七个神经元。顺行或逆行对之间 Mann-Whitney 检验的统计结果。

4.关于二进制阈值的注意事项
在图像分析中通常需要对图像进行阈值处理，但它也可能有些主观，因此可能存在问题。使用KymoMerge ，阈值化需要特别注意创建二进制图像的过程。创建二值图像的过程存在一个固有的困难：如果一个区域比另一个区域更嘈杂，则噪声可能与其他地方的信号具有相同的幅度。结果是，如果设置的阈值处于适合噪声区域的水平，则设置的阈值将消除实际信号，或者可能会留下背景，从而产生错误的共定位轨迹。使用KymoMerge进行仔细的阈值处理可以生成准确且可解释的合并 kymograph。对于具有高背景区域的 kymographs，在分析之前可能需要裁剪过度嘈杂的区域。由于这些区域通常即使通过人工分析也无法解释，因此可分析的数据不会丢失，图像的其余部分将产生准确的结果。重要的是要了解任何数据集都只是所研究系统的一个样本。最好在排除误报共定位轨迹的一侧犯错，并仅分析真正共定位的结果轨迹。由于KymoMerge允许在创建合并图像之前对各个通道进行单独筛选和阈值处理，因此用户可以识别任何有问题的 kymographs 并进行适当处理。 McMahon 等人显示了更多示例。 (2021)，包括对同一数据集上使用的两个不同阈值的直接比较。

致谢

这项研究得到了 NIH R01NS083378 的支持。发布此方法的初始出版物：Yap 等人。 (2022)。

利益争夺

本研究没有相互竞争的经济利益。

伦理

用于活体成像的神经元培养物由弗吉尼亚大学动物护理和使用委员会批准的 E18 大鼠胚胎制备。所有实验均按照相关指南和法规 (ACUC #3422) 进行。

参考

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