材料和试剂

1. 显微镜载玻片（VWR，目录号： 631-1554）
2. 盖玻片 24 × 50 毫米（VWR，目录号： 631-1574）
3. 试管，钠玻璃 40 × 8 毫米（VWR，目录号： 212-0011）
4. Versilic过氧化物固化硅胶塞（Lab Pure，目录号： 263006-50）
5. CryoPure管 1.2 mL（ Sarstedt ，目录号： 72.377）
6. 硅胶，SiO 2 （VWR，目录号： 83001.260）
7. Milli-Q超纯水
8. 丙酮（C 3 H 6 O）（Fisher Scientific，目录号： 1000220500）
9. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 片剂（Fisher Scientific，目录号： 10388739）
10. Triton TM X-100（Sigma-Aldrich，目录号： T8787）
11. 正常山羊血清 (NGS) 10%（ Thermo Fisher Scientific，目录号： 50062Z），储存在 4 °C
12. 小鼠抗肌球蛋白重链亚型 I（DSHB，目录号： BA-F8-c），储存在 4 °C
13. 小鼠抗肌球蛋白重链同种型 II（DSHB，目录号： SC-71-c），储存在 4 °C
14. Alexa Fluor 山羊抗小鼠 IgG2b 488（ Thermo Fisher Scientific，目录号： A-21141），在黑暗中储存在 4 °C
15. Alexa Fluor 山羊抗小鼠 IgG1 647（ Thermo Fisher Scientific，目录号： A-21240），储存在 4 °C 和黑暗中
16. Prolong TM Gold 抗淬灭封固剂（ Thermo Scientific，目录号： P36934）
17. Triton 10% 原液（见配方）
18. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 溶液（参见食谱）
19. 一抗溶液（见配方）
20. 二抗溶液（见食谱）

设备

1. 冷冻干燥机系统（ Heto FD 1.0 冷却装置、Edwards Vacuum TM nXDS6i 真空泵和Vacuubrand VAP5 真空计）
2. 气候控制室（< 40% 湿度）
3. VisiScope®立体显微镜（VWR，目录号： 630-3073）
4. Dumont 镊子（FST，目录号： 11252-00）
5. 针（粘在木柄上的锋利的缝纫针）
6. 手术刀（ Swamm -Morton，碳钢手术刀，目录号： 11）
7. Hamilton TM注射器 10 μL （Fisher Scientific，目录号： 203560）
8. 黑色A4纸（常用办公用品）
9. 一套微量移液器（ Tacta® ，机械移液器 0.5–1,000 μL ，Sartorius）
10. 移液器吸头（ Safetyspace® ，过滤移液器吸头 0.5–1,000 μL ， Sartorius）
11. Vortex-Genie ® （VWR，目录号： 444-5900）
12. 磁力搅拌器（ Heidolph Instruments，目录号： 503-02000-00）
13. 聚丙烯载玻片邮寄器（ Histolab ，目录号： 05309）
14. Celena S 荧光显微镜（Logos Biosystems）
15. Celena S LED 滤光立方体（EYFP Ex500/20、Em535/30；Logos Biosystems，目录号： I10106）
16. Celena S LED 滤光片立方体（Cy5 Long Pass Ex620/60，Em665 lp ；Logos Biosystems，目录号： I10112）
17. 笔和纸

软件

1. Celena S数字成像软件（Logos Biosystem）

程序

A. 在黑白 A4 纸上准备显微镜载玻片和网格系统

1. 使用任何具有玻璃器皿打印功能的市售打印服务，使用耐溶剂墨水在显微镜载玻片上打印网格（图 1A）。
2. 使用普通铅笔和尺子，在黑色 A4 纸上绘制与打印的显微镜幻灯片相对应的网格系统（网格纸可重复使用；图 1B）。
3. 使用文字处理软件（例如，Microsoft Word），创建与上一步类似的网格系统，并打印在白色 A4 办公纸上，供以后在步骤 F6 中使用（图 1C）。

图 1. 在整个 THRIFTY 协议中使用的坐标网格系统。 A. 带有用耐溶剂墨水打印的自定义坐标网格系统的显微镜载玻片。每平方 1.05 × 1.05 mm，线宽为 0.5 mm。整个显微镜载玻片尺寸为 76 × 26 毫米。 B. 一张普通的 A4 大小的黑纸，带有相应的网格系统，用于跟踪每条肌肉纤维的剩余部分。 C. 在 Microsoft Word 中创建并打印在普通 A4 办公纸上的匹配网格系统。当显微镜载玻片在显微镜下可视化时，本文用于记录每个纤维段的纤维类型标识。 I 型和 II 型纤维段分别用红色 (I) 和蓝色 (II) 标记。

B. 分离单个肌肉纤维

1. 冷冻干燥肌肉活检样本过夜并储存在-80°C。在冷冻干燥之前，启动连接到真空泵的冷却系统，并将肌肉样品放入盖子上有小孔的冷冻管中，以便蒸发。将样品放入塑料容器（冷冻干燥机专用）中，然后放入-80 °C 冰箱中。一旦塑料容器达到-80 °C，迅速将其从冰箱中取出并将其连接到冷冻干燥机上。然后将样品在低于 0.03 毫巴的压力下干燥过夜。
2. 解剖前，将活检样本在硅胶上解冻至室温 30 分钟。
3. 在气候控制室（ <40% 湿度），在立体显微镜下使用针和钳子手动分离单个肌肉纤维（图 2）。为此，首先定位适当长度的纤维束，然后将纤维束分成包含 2 – 10 根纤维的较小部分。此后，用钳子固定束，并使用针头小心地取出单根纤维，不要弄断它们。
4. 将解剖的纤维储存在-80°C 用硅胶塞密封的玻璃管中（重要的是不要将纤维储存在塑料管中，因为由于静电，在纤维类型识别之前从试管中检索它们可能具有挑战性）。

图 2. 手动分离单个冻干肌肉纤维。隔离是在立体显微镜下使用 Dumont 镊子和由附在手柄上的锋利缝纫针制成的定制针进行的。

C. 将光纤段安装到显微镜载玻片上

1. 将带有纤维的玻璃管放在硅胶上 30 分钟，以便在室温下解冻。
2. 在立体显微镜下，使用针和手术刀，切割单个纤维的一小段（< 1 毫米）（图 3A和 3 B）。
3. 将光纤段放在显微镜幻灯片的第一个正方形中（图 3C）。
4. 将一滴蒸馏水 (dH 2 O) 添加到纤维段上（当液滴缓慢干燥时会发生附着；图 3D和 3 E）。
5. 将剩余的（大）一块肌肉纤维直接放入网格黑色 A4 纸的相应正方形中（图 3F）。
6. 重复步骤 C2 –C 5，直到显微镜载玻片的所有方块都充满纤维段。
7. 在染色前安装一到五个带有纤维段的显微镜载玻片。

图 3。安装光纤段并利用协调网格系统进行光纤跟踪。 A. 在显微镜下分离一根纤维。 B. 用手术刀将纤维切成一大段和一小段。 C. 将较小的纤维段放在网格化显微镜载玻片的正方形上。 D 和 E. 通过使用 Hamilton 注射器在其上添加一小滴蒸馏水并使其干燥，将小纤维端安装到显微镜载玻片上。 F. 将较大的纤维端放在网格化的黑色 A4 纸的相应正方形上，以便于跟踪哪个纤维端代表每个剩余的纤维块。所有需要移动纤维的步骤都是使用针完成的，因为肌肉纤维通常会因静电而粘在针上。

D. 准备库存解决方案和主要抗体解决方案

1. 准备 Triton 10% 原液（参见食谱）。
2. 准备 PBS溶液（参见食谱）。
3. 准备一抗溶液（参见食谱）。

E. 染色方案

1. 小心地将已安装的显微镜载玻片浸入装有室温丙酮的聚丙烯载玻片邮寄器中，孵育 3 分钟。
2. 让显微镜载玻片干燥约 3 分钟。
3. 小心地将显微镜载玻片浸入一抗溶液中，并在室温下孵育 45 分钟。
4. 在与一抗孵育期间，制备二抗溶液（参见食谱；不建议重复使用）。
5. 清洗显微镜载玻片 3 次在冷 PBS (4 °C)溶液中 5 分钟，小心地将它们浸入充满 PBS 溶液的邮件滑块中。清洗载玻片时不要有任何晃动动作，以避免可能的脱落风险。
6. 在黑暗中室温下在二次抗体溶液中孵育显微镜载玻片。
7. 在黑暗中的冷 PBS (4 °C)溶液中再次清洗显微镜载玻片 5 分钟 3 次。
8. 小心地擦干显微镜载玻片上多余的 PBS 溶液，并在纤维上滴 2-3滴防褪色封固剂，然后封固在盖玻片上。
9. 让防褪色安装剂在黑暗中干燥 15 分钟。

F. Celena S 显微镜中的纤维类型识别

1. 使用光学显微镜设置（4倍放大倍数）定位第一个光纤段。
2. 调整焦点以清楚地可视化光纤段。
3. 将显微镜设置为以下图像设置： EYFP 和 Cy5 长通通道分别为光 100%、增益（18 dB）和 40 毫秒和 10毫秒。使用伪彩色功能可以更轻松地检测不同的光纤类型。在这里，我们使用绿色作为 EYFP 通道的伪色，使用红色作为 Cy5 长通通道的伪色。为简单起见，通道将在下文中称为绿色 (EYFP) 和红色 (Cy5 长通)。
4. 控制绿色和红色通道中的光纤端。
5. 使用以下方案识别纤维类型：I 型纤维被染成绿色，II 型纤维被染成红色，I/II 型混合纤维被染成黄色，正方形中超过一个不同颜色的纤维段表示污染，或者因为两个相邻的纤维没有正确分离，或者因为在解剖过程中残留的纤维段附着在主纤维上。有关示例，请参见图 4。
6. 记下安装在网格化白 A4 纸上显微镜载玻片上的每根纤维的已识别纤维类型。

图 4. 使用 THRIFTY 协议的光纤类型分类示例。纤维段可以分类为 I 型、II 型、混合型、两个纤维段或污染。图片修改自浩华等。 (2022) 。
7. 在网格化显微镜载玻片上找到下一根纤维。
8. 对安装在显微镜载玻片上的其余光纤段重复步骤 F4 - F7。

G. 根据纤维类型单独收集纤维或混合纤维

1. 现在使用上一步中的注释提供放置在黑色网格 A4 纸上的每根纤维的纤维类型标识。
2. 该信息现在可用于收集纤维，可以单独收集，也可以根据纤维类型标识集中收集。
3. 根据下游分析的要求进行。

笔记

印刷服务：
1. 为了创建包含白色网格系统的定制载玻片，我们联系了一家商业印刷公司 ( Creative Reklam i Sverige AB, Ludvika , Sweden) , 它打印了 10 × 20白格系统，使用线宽0.5mm的耐溶剂墨水。网格中的每个方格测量 1.05 × 1.05 毫米。但是，如果要使用Celena S以外的显微镜系统，则可以相应地调整这些尺寸以优化可用性。
2. 为了尽量减少染色过程中纤维段从显微镜载玻片上脱落的风险，抗体溶液和 PBS 溶液在放入载玻片邮寄器时不应倒在显微镜载玻片上。相反，应将显微镜载玻片小心地浸入预先装满的邮筒中。这包括所有孵育和洗涤步骤。
3. 出于与上述相同的原因，塑料载玻片邮寄器优于普通Coplin罐，以最大限度地减少微振动的可能性，微振动可能导致纤维段在染色过程中分离。
4. 作者强烈建议用户根据在绿色和红色通道中获得的信号（即绿色通道中有强信号而红色通道中没有信号）来确定光纤类型标识，而不是根据只有一个通道的基础（即绿色通道中的强信号）。这是因为使用这种方法对混合光纤、双光纤段或污染光纤进行错误分类的风险很大。
5. 如果染色过程的速度至关重要，则初级和二级抗体的孵育时间可以分别减少到 10 分钟（在37 °C下孵育），并且 PBS 溶液洗涤可以进行一次，每次 5 分钟，而不是三次，每次 5 分钟。这允许大约 30 分钟的染色协议，染色质量接近原始协议。
6. 此处描述的方案适用于冻干肌肉；然而，THRIFTY 方法也适用于新鲜的、未冻干的肌肉组织。

食谱

1. Triton 10% 原液
a. 将 25 mL 的 Triton X-100 添加到 225 mL 的 dH 2 O中。
b. 使用磁力搅拌器轻轻搅拌，否则 Triton X-100 会产生一层泡沫。
c. 在室温或 4 °C 下储存。

2. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 溶液
a. 使用磁力搅拌器，将两片 PBS 片剂溶解在 1 L dH 2 O中。
b. 储存在4 °C。

3. 一抗溶液
a. 将 6 mL 的 NGS 与 4.8 mL 的 PBS 溶液混合。
b. 在溶液中加入 1.2 mL Triton 10% 原液；还没有漩涡。
c. μg溶液所需的小鼠抗肌球蛋白重链亚型 I和小鼠抗肌球蛋白重链亚型 II抗体的量。
d. 根据计算向溶液中添加抗体。
e. 涡流。
f. 存储在 4 摄氏度。
g. 4 °C（在几个月内使用超过 20 次），则初级抗体溶液可以重复使用多次。

4. 二抗溶液
a. 每次使用时都要新鲜制备这种溶液，最好是在一抗孵育期间。
b. 将 1 mL 的 Triton 10% 库存溶液和 1 mL 的 NGS 添加到 8 mL 的 PBS 溶液中。
c. 添加 10 μL的Alexa Fluor 山羊抗小鼠 IgG2b 488 和 Alexa Fluor 山羊抗小鼠 IgG1 647。
d. 涡流。
e. 将二抗溶液避光保存。如果在使用前的一抗孵育过程中制备溶液，则该溶液可在室温下储存。

致谢

该方案基于发表在《生理学杂志》 ( Horwath 等，2022 ）。该项目由项目赠款（P2020-0058、P2021-0173）和早期研究奖学金（No. D2019-0050）资助，均由瑞典国家体育科学委员会授予 WA

利益争夺

作者没有竞争利益。

伦理

开发该方法的所有实验都是在人体骨骼肌样本上进行的。用于制定该协议的肌肉样本来自瑞典伦理审查局批准的三个正在进行的研究项目（DNR 2017/2107–31/2、DNR 2017/2034–31/2 和 DNR 2019-0038 1）。所有项目都与赫尔辛基宣言一致，所有人类志愿者在参加实验之前都给出了口头和书面同意。

参考

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Horwath, O.、Edman, S.、Andersson, A.、Larsen, FJ 和 Apro, W. (2022)。 THRIFTY：一种用于快速识别分离的骨骼肌纤维的纤维类型的新型高通量方法。 J 生理学600(20)：4421-4438。
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Murgia, M.、Nogara, L.、Baraldo, M.、Reggiani, C.、Mann, M. 和 Schiaffino, S.（2021 年）。人体骨骼肌中纤维类型的蛋白质谱：单纤维蛋白质组学研究。骨骼肌11(1)：24。
Skelly, LE, Gillen, JB, Frankish, BP, MacInnis, MJ, Godkin, FE, Tarnopolsky, MA, Murphy, RM 和 Gibala, MJ (2021)。人类骨骼肌纤维类型对冲刺间隔和中等强度连续运动的特异性反应：急性和训练引起的变化。 J Appl Physiol (1985) 130(4): 1001-1014。
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