材料和试剂

1. 无水乙醇，USP（Greenfield Global 的商业酒精，目录号：P016EAAN）
2. 双蒸水
3. 离心管，50 mL（VWR，目录号：89039-656）
4. 无菌 100 mm 组织培养皿，标准（Sarstedt，目录号：83.3902）
5. 细胞过滤器，70 μm 尼龙网（Sarstedt，目录号：83.3945.070）
6. 结核菌素注射器，1 mL，带 luer 滑动头（BD Biosciences，目录号：BD309659）
7. Luer 锁紧注射器，3 mL（BD Biosciences，目录号：BD309657）
8. Falcon 血清移液器，10 mL（VWR，目录号：CA53300-523）
9. 移液器吸头：10 μL 用于 Gilson PIPETMAN Classic P2（Sarstedt，目录号：袋子目录号 70.3010 和架装吸头 70.3010.200），200 μL 用于 Gilson PIPETMAN Classic P20 和 P200（Gilson，袋子目录号 70.3030 和 70.3050.200移液器吸头）和 1 , 000 μL，用于 Gilson PIPETMAN Classic P1000（Gilson，袋子目录号 70.3050，移液器吸头目录号 70.3050.200）； 250 μL 移液器吸头 RC LTS 用于 Rainin 多通道移液器（梅特勒-托利多，目录号：袋装 17001118 和架装吸头 30389243）
10. Falcon 5 mL 聚苯乙烯圆底管（VWR，目录号：352058）
11. 带架子的迷你管，1.1 mL（VWR，目录号：89005-572）
12. Microtubes，1.5 mL，带锥形底座和连接的平盖（Sarstedt，目录号：72.690.300）
13. Microtubes，5 mL，带锥形底座和连接的平盖（Sarstedt，目录号：72.701.400）
14. 无菌 Falcon 24 孔组织培养板，平底带盖（VWR，目录号：353047）
15. Nunc 96 孔聚苯乙烯锥形底微孔板（ Thermo Fisher Scientific ，目录号：249570）
16. 异氟醚（CDMV，目录号：55868225）
17. 氧气 (O 2 )
18. 用于小动物手术的手术缝合线，不可吸收的丝线 7-0（Braintree Scientific，目录号：SUT-S 103）
19. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) pH 7.4，不含Ca 2+和 Mg 2+ ，500 mL（ Thermo Fisher Scientific，目录号：10010023）
20. Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI)，含 L-谷氨酰胺和酚红，不含 HEPES（ Thermo Fisher Scientific ，目录号：11875093）
21. 来自溶组织梭菌的胶原酶 A ，冻干，≥ 0.15 U/mg 蛋白质（Roche，目录号：10103586001）
22. 2 型胶原酶，冻干，> 125 U/mg 蛋白质（Worthington Biochemical，目录号：LS004176）
23. 弹性蛋白酶，冻干，≥ 3 U/mg 蛋白质（Worthington Biochemical，目录号：LS002292）
24. 透明质酸酶，冻干，≥ 300 U/mg 蛋白质（Sigma-Aldrich，目录号：H2126-500MG）
25. 胰蛋白酶抑制剂，大豆，纯化的（Worthington Biochemical，目录号：LS003570）
26. Phorbol 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯（PMA）（Sigma-Aldrich，目录号：P1585-1MG）
27. 离子霉素（Sigma-Aldrich，目录号：I0634-1MG）
28. 莫能菌素 1,000 ×溶液（BioLegend，目录号：420701）。莫能菌素溶液由 BioLegend 提供，浓度为 1,000 × 70%乙醇的工作溶液。浓度为 2 mM。储存莫能菌素 1,000 × 溶液在 4 °C 直至使用
29. LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain 试剂盒（405 nm 激发，200 次测定）（Thermo Fisher Scientific，目录号：L34957）。该试剂盒包含五瓶染色剂（A 组份）和一瓶无水二甲基亚砜（DMSO，B 组份）
30. 胎牛血清 (FBS)，合格，加拿大产，500 mL（Thermo Fisher Scientific，目录号：12483020）
31. 小鼠 Fc 阻断剂：纯化的大鼠抗小鼠 CD16/CD32 Fc 阻断剂（BD Biosciences，目录号：553142，克隆 2.4G2，0.5 mg，0.5 mg/mL）
32. 用于胞外和胞内染色的抗体见表 1

表 1. 用于细胞外和细胞内染色的抗体
抗原抗体克隆，公司（目录号）
CD45 BV786 偶联大鼠抗小鼠 CD45 抗体 30-F11，BD 生物科学 (564225)
CD3 BUV395 偶联大鼠抗小鼠 CD3 抗体 17A2，BD 生物科学 (740268)
CD4 PerCP-eFluor710 偶联大鼠抗小鼠 CD4 抗体 RM4-5，eBioscience (46-0042-82)
CD8a AF700 偶联大鼠抗小鼠 CD8a 抗体 53-6.7, 生物传奇 (100730)
TCRγδ _ PE-CF594 标记的仓鼠抗小鼠 TCR δ抗体 GL3，BD 生物科学 (563532)
IL-17A APC 偶联大鼠抗小鼠 IL-17A 抗体 eBio17B7，eBioscience (17-7177-81)
干扰素γ AF488 偶联大鼠抗小鼠 IFN γ抗体 XMG1.2，eBioscience (53-7311-82)
AF488 和 AF700：Alexa-Fluor 488 和 700； APC：别藻蓝蛋白； BUV395：亮紫外 395； BV786：艳紫 786； CD：分化簇； CF594：基于花青的荧光染料 594； IL-17A：白细胞介素-17A； IFNγ ：干扰素γ ； PE：藻红蛋白； PerCP：peridinin-chlorophyll-protein。

33. 多聚甲醛 10% 水溶液 (PFA)，10 × 10 mL（Electron Microscopy Sciences，目录号：15712）
34. Probumin®牛血清白蛋白 (BSA)，100 g，生命科学级（Sigma-Aldrich，目录号：810683 ）
35. 皂苷，100 g（Calbiochem，目录号：558255）
36. Invitrogen TM UltraComp eBeads TM （Thermo Fisher Scientific，目录号：01-2222-42）
37. Arc TM胺反应补偿珠套件（Thermo Fisher Scientific，目录号：A10346）。该试剂盒包含 ArC 反应性珠子（组分 A），可结合任何胺反应性染料并提供阳性信号，以及 ArC 阴性珠子（组分 B），其没有反应性并提供阴性补偿对照）

在开始协议之前需要准备以下试剂和设备
详细说明可在食谱下找到。

提前准备的试剂和设备（见食谱）
1. 70% 乙醇
2. 无菌移液器吸头
3. 无菌解剖工具
4. 消化原液 (8 × )
5. 透明质酸酶原液 (8 × )
6. PMA 1 毫克/毫升储备溶液
7. 离子霉素原液 (1 mg/mL)
8. LIVE/DEAD 染色原液
9. FBS 等分试样
10. 通透缓冲液

实验后三天内准备的试剂（见食谱）
1. 预稀释抗体混合物

实验当天准备的试剂（见食谱）
1. 用于收集组织的 24 孔组织培养板
2. 带标签的 50 mL 离心管，用于收集肠道和肠系膜床
3. T 细胞活化混合物（1 mL/样品）
4. PFA 1% 溶液
5. LIVE/DEAD 染色液

设备

1. 小型动物异氟烷麻醉机，配备足够的气体清除系统或过滤器、由透明材料（玻璃、聚碳酸酯等）构成的感应室和一只小鼠麻醉鼻锥或面罩 (Dispomed)
2. 尸检工具
a. 1 ×手术剪刀，锋利钝头，14.5 厘米（Fine Science Tools，目录号：14001-14）
b. 1 ×锋利的细剪刀，9 厘米（Fine Science Tools，目录号：14061-09）
c. 1 ×精细缝合钳，9 厘米，尖端：45° 角且光滑（Fine Science Tools，目录号：11063-07）
d. 2 × Graefe 镊子，10 厘米，尖端：弯曲和锯齿状（Fine Science Tools，目录号：11051-10）
3. 解剖工具
a. 2 ×分裂钳（镊子），5 号长点，11 厘米（Almedic，目录号：A10-704）
b. 1 ×学生 Vannas 弹簧剪刀，尖端：锋利，尖端：5 毫米，尖端直径：0.35 毫米，长度：9 厘米（Fine Science Tools，目录号：91500-09）
4. 生物安全柜，II 类（Thermo Fischer Scientific）
5. Drummond Portable Pipet Aid XP (Cole-Parmer)
6. 单刃手术碳钢刀片（Thermo Fisher Scientific，目录号：S17302）
7. 冰袋储存在 -20 °C 的冰箱中
8. 双目解剖显微镜 Leica MS 5，具有可变放大倍率（Leica Microsystems）
9. VWR Boekel 杂交培养箱 37 °C，配备摇杆平台 (VWR)
10. 细胞培养箱（5% CO 2 , 37 °C, Thermo Fischer Scientific）
11. 4 °C 冰箱（Thermo Fisher Scientific）
12. 解剖培养皿：100 × 10 mm Pyrex 培养皿（Cole-Parmer，目录号：UZ-34551-02），带蜡底衬（Thermo Fisher Scientific，目录号：S80769），用于固定样品
13. BD PrecisionGlide 针头 26 G × 5/8 Sub-1（BD，目录号：305115），用于固定解剖培养皿中的肠系膜床
14. 离心机 5810 R，带吊桶式转子 A-4-81 和适用于 96 孔板以及 5 和 50 mL Eppendorf 管的适配器 (Eppendorf)
15. P2、P20、P200 和 P1000 Gilson PIPETMAN Classic 单道移液器 (Thermo Fisher)
16. Rainin Pipet-Lite L200 8 通道多通道 20–200 μL LTS 移液器（梅特勒-托利多，见注释 1）
17. 多色流式细胞仪：BD LSR Fortessa (BD Biosciences)，配备 355、405、488、561 和 640 nm 激发激光器和适当的带通滤波器

软件

1. FlowJo V10（FlowJo LLC，BD， https://www.flowjo.com ）

程序

A. 组织采集（见注释 2）

1. 2的 3% 异氟醚麻醉小鼠按照您所在机构的标准操作程序以 1 升/分钟的速度进行，并通过不存在对后脚挤压的踏板撤回反射来验证麻醉深度。
2. 进行剖腹手术以暴露肠道。
3. 将脾脏解剖并转移到带有冷 RPMI 标记的 24 孔组织培养板的脾脏中。储存在冰上（图 2A）。
4. 在十二指肠 (图 2B) 和结肠末端 (图 2C) 的开始处使用手术缝合线将肠道末端系起来, 以防止肠道内容物过多泄漏。使用剪刀用肠系膜床切除肠道，使结附着在肠道上，然后转移到含有 PBS 的 50 mL 离心管中。储存在冰上。
5. 解剖肾脏（图 2D）并将两个肾脏转移到含有 RPMI 的标记的 24 孔组织培养板的肾井中。储存在冰上。
6. 通过横向切割胸骨两侧的肋骨打开胸腔，并立即取出心脏以对动物实施安乐死（图 2E）。然后，用镊子将肺部放在支气管旁，用剪刀剪开气管取出双肺（图 2F）。将肺部转移到带有 RPMI 标记的 24 孔组织培养板的肺部。储存在冰上。
7. 对其余小鼠重复上述操作。

图 2。组织的集合。进行剖腹手术以暴露肠道并去除脾脏 ( A )。使用手术缝合线将十二指肠 ( B ) 的起点和结肠 ( C ) 的末端绑起来，并切除肠道。然后，解剖出肾脏。通过横向切割胸骨两侧的肋骨打开胸腔并取出心脏 ( E )。最后，用镊子夹住肺部的支气管，用剪刀 ( F ) 剪开气管取出双肺。

B. 从肺、肾和细胞中制备单细胞悬液 MV/PVAT

通过用消化酶混合物消化这些组织，从肺、肾和 MV/PVAT 获得单细胞悬浮液。首先消化肺部，然后是肾脏和 MV/PVAT，因为肺部消化时间最长。消化将在 37°C 下在配备摇杆平台的杂交孵化器烤箱中进行，该摇杆平台设置为每分钟 30 次循环，位移幅度为 3 厘米。消化通过将含有消化混合物的试管置于冰上来结束，因为酶在低温下是无功能的。

1. 对于四只小鼠，每个组织准备四个消化管，如下所示。对于每个肺消化管，将 600 μL 的 RPMI、100 μL 的 8 × 消化原液和 100 μL 8 ×透明质酸酶原液置于 1.5 mL 微量管中。对于每个 MV/PVAT 消化管，将 700 μL 的 RPMI 添加到 8 ×的 100 μL 等分试样中消化原液。对于肾脏，保留四个未稀释的 100 μL 等分试样，每份 8 × 消化原液。将所有酶消化管放在冰上直至使用。
2. 将肺部从冷 RPMI 转移到一个 100 毫米的组织培养皿中，该培养皿位于一个冰袋上，该冰袋之前已从 -20 °C 冰箱中取出。用剪刀彻底切碎肺部，直到形成糊状物。然后，使用镊子和/或刀片将切碎的组织转移到肺酶消化管中。将管子存放在冰上，直到所有肺样本都按上述方法处理。
3. 如上所述，在 37°C 的杂交培养箱中开始搅拌肺样本。消化应在大约 2 小时内完成。每 30 分钟检查一次消化的进展，方法是从烤箱中取出管子并将它们放在光源下。看解决方案的平滑度。如果可以看到大块的组织，用手剧烈摇动管子或以中高速涡旋管子进行几次短 5 秒的爆发，然后将管子放回烤箱继续消化 30 分钟。根据需要重复，直到组织/消化溶液看起来光滑。 2 h 消化结束时，如果溶液几乎光滑，用手剧烈摇动管子或中高速涡旋管子几次 5 s 短脉冲，将管子放回杂交炉中，再次检查5 分钟后当肺部完全消化后，从培养箱中取出管子并放在冰上以停止消化。
4. μL 冷 RPMI 的24 孔组织培养板的肾脏处理井中。使用剃刀刀片切出 70 μm 细胞滤网的尼龙网，并使用镊子将网状物放在 24 孔板孔中的肾脏顶部（图 3）。使用无菌 3 mL 注射器柱塞的背面，轻轻压碎尼龙网下的肾脏。使用 P1000 移液器将 RPMI 和肾脏溶液与使用镊子的尼龙网一起转移到未稀释 (100 μL) 8 ×消化原液的等分试样中。每个肾管现在应该包含 100 μL 的消化原液、500 μL 的 RPMI 和压碎的肾脏。将管子存放在冰上，直到所有肾脏样本都按上述方法处理。

图 3. 压碎脾脏、肾脏和肠系膜淋巴结 (mLN)。通过用注射器柱塞的背面轻轻按压位于组织上的尼龙网来压碎组织。

5. 在 37°C 下开始消化肾脏样本，并在杂交孵化器烤箱中搅拌，并如上所述每 15 分钟检查一次消化的进展。肾脏消化应在大约 30 分钟内完成。如果可以看到大块的组织，用手剧烈摇动管子或以中高速涡旋管子进行几次短 5 秒的爆发，然后将管子放回烤箱继续消化 15 分钟。消化 30 分钟后，如果溶液几乎光滑，用手剧烈摇动管子或中高速涡旋管子几次短 5 秒，将管子放回杂交炉，5 分钟后再次检查。当肾脏完全消化后，从培养箱中取出管子并放在冰上以结束消化。
6. 当肺部和肾脏被消化时，将冰冷的 PBS 倒入解剖盘中，并将盘子放在冰袋上，该冰袋已经从 -20 °C 冰箱中取出，如上所述。将肠系膜床从 50 mL 离心管转移到含有冷 PBS 的解剖盘中。将坐在冷冰袋上的盘子放在低放大倍数的解剖显微镜的直视下。找到靠近盲肠的 mLN 簇，并用剪刀切除整个簇。此外，检查可能位于肠系膜床脂肪组织内的小淋巴结。淋巴结比脂肪组织更不透明，具有白色色调和明确的包膜。它们可以用小剪刀从组织上剪下来。将 mLN 放入包含 1 mL 冷 RPMI 的 24 孔板的标记孔中，并将板放在冰上以备后用。
7. 将 100 毫米组织培养皿放在另一个冰袋上，该冰袋刚从 -20 °C 冰箱中取出。
8. 拉伸肠系膜血管床，并在解剖盘中使用 26 G 针将其固定，以暴露 MV/PVAT（图 4）。使用剪刀剪下所有 MV/PVAT，然后转移到冰袋上的 100 mm 组织培养皿中。在显微镜下再次检查组织是否存在任何淋巴结，并清除所有发现的淋巴结。用剪刀彻底切碎组织，然后使用小钳子将切碎的组织转移到 MV/PVAT 消化管中。将管子存放在冰上，直到所有 MV/PVAT 样品都按上述方法处理。

图 4. 肠系膜血管和血管周围脂肪组织 (MV/PVAT) 和淋巴结 (mLN) 的可视化

9. 在 37°C 下开始消化 MV/PVAT 样品，并在杂交孵化器烤箱中搅拌，并在 15 分钟后和消化结束时检查消化的进展情况，如上所述。消化应在大约 25 分钟内完成。如果可以看到大块的组织，用手用力摇动管子或以中高速涡旋管子几次短 5 秒的爆发，然后将管子放回烤箱继续消化。消化 25 分钟后，如果溶液几乎光滑，用手剧烈摇动管子或中高速涡旋管子几次短 5 秒，将管子放回杂交炉，5 分钟后再次检查。当 MV/PVAT 完全消化后，从培养箱中取出管子并放在冰上以停止消化。
10. 当所有组织都被消化后，将每个悬浮液通过 70 μm 细胞过滤器过滤到标记为 50 mL Falcon 管（用于肾脏和肺）和 1.5 mL 微管（用于 MV/PVAT）中。用少量 RPMI 清洗过滤器，以帮助从过滤器中释放细胞（1 mL 的 RPMI 用于肾脏和肺部，200 μL 的 RPMI 用于 MV/PVAT，以考虑较小的管尺寸）。使用 RPMI 过滤悬浮液和清洗细胞过滤器时，建议在按下柱塞的同时，将移液器尖端在尼龙网上方的小圆圈中缓慢移动。这将有助于分离任何剩余的细胞团并防止它们粘附在网格上，从而最大限度地减少样品损失。由于该组织中存在少量 T 细胞，较小的 1.5 mL 微管用于最大限度地减少细胞损失。微管还允许在免疫细胞较少的组织中形成更坚固的细胞沉淀（在以下步骤中离心后倒出上清液时，小沉淀将更不易丢失）。将过滤后的悬浮液保持在冰上，直到体外 T 细胞激活步骤。

C. 从脾脏和 mLN 中制备单细胞悬浮液

1. 使用剃刀刀片切出 70 μm 细胞滤网的尼龙网，并将网状物放在脾脏顶部，放在含有 1 mL RPMI 的 24 孔组织培养板的井中（图 3）。
2. 使用 3 mL 注射器柱塞的背面，压碎尼龙网下方的脾脏，直到分离。对每个脾脏样本重复。
3. 通过放置在 50 mL 离心管顶部的 70 μm 细胞过滤器过滤每个脾细胞悬浮液。用 1 mL 的 RPMI 清洗细胞过滤器，将细胞从过滤器中释放出来。将 50 mL 管存放在冰上，直到体外 T 细胞激活步骤。
4. 如上所述处理所有剩余的脾脏样本。
5. 对每个 mLN 样本重复步骤 C1 - C3 并进行一些修改。使用 1 mL 注射器柱塞的背面更精确地粉碎 mLN。用轻微的压力将 mLN 压碎大约七次，以避免损坏免疫细胞； mLNs 对这个过程比脾脏敏感得多。
6. 通过 70 μm 细胞过滤器将 mLN 样品过滤到 1.5 mL 微管中，以最大限度地减少免疫细胞的损失，并允许形成更强大的细胞颗粒。
7. 将过滤后的悬浮液保持在冰上，直到体外 T 细胞激活步骤。
8. 按照步骤 C5–C7 处理所有剩余的 mLN 样本。

D. 体外 T 细胞活化

1. 准备一个 24 孔组织培养板，用于体外激活来自肺、肾脏、MV/PVAT、脾脏和 mLN 的 T 细胞，如图 5 所示。用组织名称和动物编号标记每只动物的五口井。

图 5。用于体外 T 细胞活化的 24 孔组织培养板的制备。 T 细胞活化混合物中单细胞悬浮液的体积（以毫升为单位）针对肺、肾脏、具有血管周围脂肪组织 (MV/PVAT) 的肠系膜血管、脾脏和肠系膜淋巴结 (mLN)。

2. ×离心所有样品 g在4 °C 下保持 5 分钟。
3. 离心后，从每个管中倒出上清液，并通过上下移液几次，用 1 mL 的冰冷 T 细胞活化鸡尾酒重新悬浮每个细胞颗粒。将每个细胞悬浮液转移到 24 孔组织培养板的适当孔中。
4. 2 的细胞培养箱中孵育4 小时。
5. ，以在体外 T 细胞激活后收集肺、肾、MV/PVAT、脾脏和 mLN 的样本。用组织名称和动物编号标记每只动物五个微管。此外，标记一个 V 形底 96 孔板的 44 孔，用于细胞外和细胞内染色，如图 6 所示。

图 6。用于细胞外和细胞内染色的 V 形底 96 孔板的制备。显示了每个未染色对照、荧光减一 (FMO) 对照和样品孔添加的细胞悬浮液体积（以微升计）。未染色和 FMO 对照是使用合并的脾脏、肺和肾脏样本制备的。没有为具有血管周围脂肪组织（MV/PVAT）和肠系膜淋巴结（mLN）的肠系膜血管准备未染色和 FMO 控制，因为这些组织不含足够的 T 细胞。脾脏用于这些组织的未染色和 FMO 控制。

6. 从培养箱中取出 24 孔板，并将每个样品转移到单独的、标记为 1.5 mL 的微管中。
7. ×离心所有样品 g在4 °C 下保持 5 分钟。

E. 将活化的细胞样品分配到 V 形底 96 孔板中进行细胞外和细胞内染色

1. 离心后，从每个管中倒出上清液，并用下面列出的 PBS 数量（特定于每个组织）重悬每个细胞沉淀。根据下面和图 6 中列出的体积，将细胞悬浮液的等分试样转移到 V 形底 96 孔板的未染色、荧光减一 (FMO) 和样品标记的孔中。
a. 脾脏：将每个脾脏样本重新悬浮在 500 μL 的 PBS 中，并将 200 μL（每个样本的脾脏的 40%）转移到 V 形底部 96 孔板的脾脏样本孔中。将剩余的脾脏样本集中在一个微管中，并将 50 μL 的合并脾细胞转移到每个未染色的脾脏和 FMO 井中（相当于脾脏的 10%）。
b. 肺：在 500 μL 的 PBS 中重新悬浮每个肺样本，并将 200 μL（40% 的肺）转移到 V 形底 96 孔板的肺样本孔中。将剩余的肺样本汇集在一个微管中，并将 50 μL 的汇集肺细胞悬浮液转移到每个未染色的肺和 FMO 井中（相当于肺的 10%）。
c. 肾脏：在 500 μL 的 PBS 中重新悬浮每个肾脏样本，并将 150 μL（合并肾脏的 30%）转移到 V 形底 96 孔板的肾脏样本孔中。汇集剩余的肾脏样本，并将 50 μL 的汇集肾细胞悬浮液转移到每个未染色的肾脏和 FMO 井中（相当于两个肾脏的 10%）。
d. MV/PVAT 和 mLN：在 100 μL 的冷 PBS 中重新悬浮每个 MV/PVAT 和 mLN 样品，并将整个样品转移到 V 形底 96 孔板的每个相应样品孔中。这些组织没有足够的 T 细胞来制备未染色的、FMO 和样品孔。脾脏用于这些组织的未染色和 FMO 控制。
注意：如果只处理一只动物，未染色和 FMO 孔的脾脏、肺和肾细胞悬浮液的体积可以减少到 25 μL (5%)。
2. ×离心 V 形底 96 孔板 g在4 °C 下保持 5 分钟。

F. 活/死细胞活力染色

在避免阳光直射的情况下执行此步骤，以防止荧光染料漂白。
1. 将 V 形底 96 孔板中的上清液倒入水槽中。
2. 用 100 μL 准备好的活/死染色溶液在 FMO 控制和样品井中重新悬浮细胞颗粒。用 100 μL 的 PBS 将细胞颗粒重新悬浮在未染色的控制井中。
3. 用铝箔覆盖 V 形底 96 孔板（避光），并在冰箱中 4°C 下孵育 20 分钟。
4. ×离心 V 形底 96 孔板 g在4 °C 下保持 5 分钟。

G. 细胞外染色

在避免阳光直射的情况下执行此步骤，以防止荧光染料漂白。
注意：如果使用一抗和二抗来确定标记表达，请在此步骤执行该染色/结合方案。
1. 将 96 孔板中的上清液倒入水槽中。
2. 用 100 μL 适当的未染色对照、FMO 对照或用于细胞外染色的样品预稀释抗体混合物，将细胞颗粒重新悬浮在未染色对照、FMO 对照和样品孔中。有关未染色控制、FMO 控制和样品井的分布，请参阅图 6。
3. 用铝箔盖住盘子，在冰箱中 4°C 下孵育 15 分钟。
注意：这足以结合大多数单克隆抗体，但可以修改孵育时间和温度以适应结合亲和力差的抗体（即，使用更高的温度和/或更长的孵育时间）。
4. ×离心 V 形底 96 孔板 g在4 °C 下保持 5 分钟。

H. 固定在 1% PFA 中

在阳光直射下执行此步骤，因为 PFA 对光敏感。
1. 将 V 形底 96 孔板中的上清液倒入水槽中。
2. 用 100 μL 的 1% PFA 轻轻重新悬浮细胞颗粒。不要产生气泡。使用 P200 单通道或多通道移液器上下移液 7-10 次，尽可能轻柔地重悬细胞以避免剪切细胞。
3. 用铝箔盖住 V 形底 96 孔板，在冰箱中 4°C 孵育 10 分钟。
4. 从冰箱中取出 V 形底 96 孔板然后将 100 μL 冷 PBS 轻轻滴入每个孔中，以帮助清洗细胞。
5. ×离心 V 形底 96 孔板 g在4 °C 下保持 5 分钟。

I. 透化/细胞内细胞因子染色

在避免阳光直射的情况下执行此步骤，以防止荧光染料漂白。透化和细胞内细胞因子染色同时进行。
1. 将 96 孔板中的上清液倒入水槽中。
2. 用 100 μL 适当的未染色对照、FMO 对照或用于细胞内染色的样品预稀释抗体混合物，将细胞颗粒重新悬浮在未染色对照、FMO 对照和样品孔中。不要产生气泡。尽可能轻柔地重悬以避免剪切细胞。有关未染色控制、FMO 控制和样品井的分布，请参阅图 6。
3. 用铝箔盖住 V 形底 96 孔板，在冰箱中 4°C 孵育 30 分钟。
4. 从冰箱中取出 V 形底 96 孔板，然后将 100 μL 的冷 PBS 轻轻滴入每个孔中，以帮助清洗细胞。
5. ×离心 V 形底 96 孔板 g在4 °C 下保持 5 分钟。

J. 将未染色的对照、FMO 对照和样品转移到流式细胞仪管中

1. 将 V 形底 96 孔板中的上清液倒入水槽中。
2. 如下用冰冷的 PBS 重悬细胞沉淀。对于脾脏、肾脏和肺部样品井，用 150 μL 的 PBS 重新悬浮细胞颗粒。对于 mLN 和 MV/PVAT 样品井以及所有未染色和 FMO 控制井，用 100 μL 的冷 PBS重新悬浮细胞颗粒。有关未染色控制、FMO 控制和样品井的分布，请参阅图 6。
3. 将所有细胞悬浮液转移到标记为 Axygen 1.1 mL 聚丙烯簇管中，并在冰箱中在 4°C 下最多储存三天，直到在流式细胞仪上运行样品。

K. 用于流式细胞术补偿的补偿珠的制备（可以在流式细胞术采集前几天准备）

1. 准备用于染色补偿珠的 V 形底 96 孔板和用于流式细胞术采集的 Axygen 1.1 mL 聚丙烯簇管，通过标记一个井和一个管用于活/死染色，以及每个荧光染料结合单克隆抗体的一个井和一个管用于细胞外和细胞内染色。
2. 添加一滴 Invitrogen TM UltraComp eBeads TM 到 V 形底 96 孔板的每个荧光染料偶联的单克隆抗体孔。
3. 在 V 形底 96 孔板的 LIVE/DEAD 染色孔中加入一滴 Arc Amine 反应性补偿珠。
4. 将 1 μL 的每种荧光染料偶联的单克隆抗体添加到含有 UltraComp eBeads 的 V 形底 96 孔板的适当孔中。如果在执行流式细胞术采集时信号太高（即，如果阳性珠出现在轴的边缘或偏离轴），则可能需要滴定用于制备补偿珠的染色量。
5. 将 0.2 μL 的活/死染色库存溶液添加到 V 形底 96 孔板的活/死染色孔中。
6. 用铝箔盖住V型底96孔板，室温孵育10分钟；然后，向每个井中添加 100 μL 的 PBS。
7. 将 96 孔板以 410 ×离心 g在4 °C 下保持 5 分钟。
8. 将盘子轻弹到废物容器或水槽上以去除上清液，并用 200 μL/孔的 PBS 重新悬浮每个珠粒。
9. 在 V 形底 96 孔板的活/死染色孔中加入一滴弧负补偿珠。
10. 转移到 Axygen 1.1 mL 聚丙烯簇管中并将管子存放在 4°C 的冰箱中，直到在流式细胞仪上运行样品。

L. 使用运行 FACSDiva 的 BD LSR Fortessa 流式细胞仪进行流式细胞术样本采集

本节简要介绍了使用运行 FACSDiva 的 BD LSR Fortessa 流式细胞仪设置实验和采集样本的步骤。更多详细信息和培训可从您的流式细胞术核心设施获得。加载每个样本并按下运行后，等待几秒钟让事件率稳定下来，然后再获取和保存数据。
1. 验证细胞仪光学配置并确保细胞仪设置和跟踪 (CST) 性能设置是最新的。
2. 在 FACSDiva 中打开一个新实验并从参数下拉菜单中选择每个荧光参数。
3. 加载未染色的样品，开始采集，并调整光电倍增管 (PMT) 电压，使淋巴细胞群的荧光值达到大约 10 5 前向散射区 ( FSC-A) 和 10 5 FSC-A 和 SSC-A 点图中的侧向散射区域 ( SSC-A)。
4. 定义淋巴细胞群门，然后调整每个荧光参数的 PMT 电压，使负（未染色）种群的自发荧光至少比每个荧光通道的仪器噪声高出三个标准差。 FACSDiva 会自动在绘图上放置一个灰色框，以指导调整各个 PMT 电压。应调整电压，直到未染色的细胞出现在该框内，但不要超出右边界和上边界（即，未染色的细胞不应比灰色框更阳性）。
5. 将完全染色的细胞样本短暂加载到仪器中，以验证所有种群在图上和范围内都可见。如果人口超出范围，则增加比例和/或降低 PMT 电压。
6. 在计算补偿之前将实验另存为模板，以便以后根据需要轻松设置。
7. 运行每个单染色补偿珠控制以校正荧光溢出并手动门控正负种群。为每个控件获取 10,000 个事件并选择自动补偿。
8. 运行每个 FMO 控制管。 FMO 用作控制每个细胞群的门控。获取足够的事件以清楚地看到阴性群体的自发荧光或获取整个样本。
9. 获取每个样本，直到事件率开始下降，表明管子几乎是空的。快速结束采集并取下管子，以防止空气进入流动池。
10. 如果稍后将在 FACSDiva 上重新打开实验，则导出 FCS 文件以在 FlowJo 上进行分析并导出 EXP 文件。

M. 使用 FlowJo 进行数据分析

本节简要介绍使用 FlowJo 分析样本的步骤。更多详细信息和培训可从您的流式细胞术核心设施获得。图 7 中显示了一个具有代表性的门控策略。
1. 将所有 FCS 文件导入 FlowJo。
2. 单击补偿选项卡并使用单染珠样本计算新的补偿矩阵。查看补偿矩阵中的每个图，以确保补偿计算中没有错误。如果任何荧光染料明显超过或低于补偿值，请手动调整补偿值。
3. 定义门以分离细胞、单细胞、活细胞，然后是每个感兴趣的标记。
4. 使用每个 FMO 来确定负种群自发荧光的位置和大小，以正确设置正种群。 FMO 是门放置的良好起点，尤其是对于正负群体之间缺乏清晰分离的荧光染料。然而，为了解释动物和组织之间的变异性，通常需要从样本到样本进行手动调整。
5. 查看每个样品的时间参数，以确保顺利和不间断地流入流通池，作为质量控制检查。时间图上的间隙或不均匀表示凝血或气泡，这会影响数据质量。

图 7. 用于确定 CD4、CD8 和 T 细胞产生细胞因子的代表性门控策略。 A. 细胞首先在侧向散射区 (SSC-A)/前向散射区 (FSC-A) 图中设门。使用 FSC-A 在 FSC 高度 (FSC-H) 上对单线态细胞进行门控。使用 SSC-A 在 SSC 高度 (SSC-H) 上再次对单线态细胞进行门控，以进一步清理数据。活细胞在 FSC-A/活力染料图中设门。然后，在 FSC-A/CD45 图中对CD45 +细胞进行门控，然后在 FSC-A/CD3 图中对 CD3 + T 细胞进行门控。然后，T 细胞受体 (TCR) γ δ +细胞从 TCR γ δ/CD3 图选通，CD4 +和 CD8 + T 细胞从 CD8a/CD4 图选通。 B. 在上述初始门控后，确定每个组织中每个 T 细胞亚群内的IFN γ和 IL-17A 产量。 AF488 和 AF700：Alexa-Fluor 488 和 700； APC：别藻蓝蛋白； BUV395：亮紫外 395； BV786：艳紫 786； CD：分化簇； CF594：基于花青的荧光染料 594； PE：藻红蛋白； PerCP：peridinin-chlorophyll-protein。

笔记

1. 频道的数量应该无关紧要，假设多通道移液器处于良好的工作状态。选择应基于准备的样品数量，以尽量减少移液步骤所花费的时间。在这项研究中，我们使用了 8 通道多通道移液器。
2. 在没有心脏灌注的情况下收集组织；因此，从组织中回收的细胞代表组织驻留免疫细胞和组织脉管系统内的免疫细胞。为了仅评估组织中的免疫细胞，需要心脏灌注。
3. 胰蛋白酶抑制剂用于阻断包含在其他消化酶中的任何污染性胰蛋白酶活性，这些酶可以切割流式细胞术表面标记。
4. 最好滴定用于流式细胞术染色的抗体浓度以满足您的特定需求。由于抗体的非特异性结合，使用过多的抗体可能会导致背景信号增加和高估真阳性群体。使用太少的抗体会导致分离不佳和低估真正的阳性群体，因为没有足够的抗体来完全染色您的细胞群。在单独的实验中，用一系列八倍稀释的感兴趣抗体对每个组织的细胞进行染色。从高于制造商推荐量（例如两倍）的抗体浓度开始，以确保您不需要比公司推荐更多的抗体。您的流式细胞术组合可能针对从不同组织中分离出的细胞，这些组织的标记物表达量可能高于或低于制造商在其测试中使用的细胞数。使用与您在实验中使用的相同比例的分离细胞进行滴定非常重要。例如，如果您计划每次染色使用 10% 的脾脏，那么每次稀释也使用 10% 的脾脏进行滴定。或者，您可以对细胞进行计数，并在每次稀释时使用与在真实实验中使用的相同数量的细胞。这将允许更低的噪音、更清晰的分离、更有效地使用试剂，并防止高估或低估细胞群的大小。请务必使用相同体积的 PBS 进行滴定。最佳染色是在最低稀释度下发现的，可在阳性和阴性群体之间提供明显的分离。比最佳浓度更稀释的样品将开始显示阳性和阴性群体之间的分离减少。确定最佳抗体浓度的更公正的指标是分离指数 (SI)，它使用阳性和阴性群体的荧光强度找到最佳分离（Telford 等人，2009）。该指数通过将阳性信号和阴性信号之间的差异除以代表阴性群体扩散的稳健标准差来确定染色群体的分离。最佳抗体稀释度将具有最高 SI 值。图 8 中包含 AF700-CD8 滴定的代表性示例，以及计算 SI 的公式。
5. 使用高尔基体阻滞剂莫能菌素可通过将细胞因子捕获在活化细胞内来放大信号。因此，可以首先使用表面标记的组合来识别单个细胞，然后评估 IFN γ和 IL-17A 的产生。

图 8. Alexa-Fluor 700 (AF700)–CD8a 抗体滴定示例。介绍了用于计算分离指数 (SI) 的公式。脾细胞用 LIVE/DEAD Aqua 活力染料 BV605-CD3 和 AF700-CD8a 的八个连续两倍稀释液染色，以确保活淋巴细胞是滴定的焦点。最佳稀释度由最大的 SI 决定。中值阳性和中值阴性分别对应于阳性和阴性群体的中值荧光强度。 84% 阴性是指阴性群体荧光强度的第 84个百分位数。 SI 由 FlowJo 确定，如前所述（UWCCC_Flow_Lab，2016）。第四次稀释显示阳性和阴性群体之间的最大分离，同时保持最小背景信号，对应于最高 SI 值。因此，选择第四稀释度作为实验中使用的适当抗体量。
食谱

A. 提前准备的试剂

1. 70% 乙醇
该溶液通过将 350 mL 无水乙醇与 150 mL 双蒸水混合制成。
2. 无菌移液器吸头
通过在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟，然后干燥 30 分钟，对架上的吸头进行灭菌。
3. 无菌解剖工具
工具通过在 70% 乙醇中浸泡 5 分钟进行消毒。
4. 消化原液 (8 × )
1 ×消化液由0.15 U/mL的胶原酶A、500 U/mL的2型胶原酶、2 U/mL的弹性蛋白酶和0.5 U/mL的胰蛋白酶抑制剂组成（见注3）。在 RPMI 中制备 8 ×消化储备溶液，并将 100 μL 的等分试样储存在 -20 °C 的 1.5 mL 微管中，直至使用，最多六个月。可以按照表 2 中的描述制备100 份 8 ×消化原液。

× PVAT/肾脏消化原液的 100 份等分试样的制备
消化酶粉 1 ×消化液 8 ×消化液
酵素 (单位/毫克) (单位/毫升) (毫克/毫升) (毫克/毫升) （毫克/100 等份）
胶原酶A 0.22 0.15 0.67 5.38 53.8
2 型胶原酶 225 500 2.22 17.78 177.8
弹性蛋白酶 4.67 2.0 0.43 3.43 34.3
胰蛋白酶抑制剂 1.79 0.5 0.28 2.23 22.3

制备 100 μL（10 mL）8 × PVAT/肾脏消化原液的 100 个等分试样的每种酶的数量计算如下。首先，通过将活性 (U)/mL 除以活性 (U)/mg 获得1 ×溶液的酶浓度（以 mg/mL 为单位）。请注意，酶的每个批号 (#) 的活性 (U)/mg 是特定的。此后，通过将 1 ×溶液的浓度乘以 8 来确定 8 ×溶液的酶浓度（以 mg/mL为单位）。然后，通过将等分试样的数量乘以 (100) 来计算 100 等分试样的酶量通过以毫升 (0.1 mL) 为单位的每个等分试样的体积和 8 ×消化溶液的浓度。最后，酶被称重，溶解在最终体积为 10 mL 的 RPMI 中，100 μL 的等分试样在 -20 °C 下储存在 1.5 mL 微管中直到使用。

5. 透明质酸酶原液 (8 × )
1 ×透明质酸酶溶液由 48 U/mL 透明质酸酶组成。在 RPMI 中准备 8 ×库存溶液，并将 100 μL 的等分试样储存在 -20 °C 的 1.5 mL 微管中，直到使用。可以按照表 3 中的描述制备100 份 8 ×消化储备溶液。

×肺透明质酸酶的 100 份等分试样的制备原液
消化酶粉 1 ×透明质酸酶溶液 8 ×透明质酸酶溶液
酵素 (单位/毫克) (单位/毫升) (毫克/毫升) (毫克/毫升) （毫克/100 等份）
透明质酸酶 300 48岁 0.16 1.28 12.8

制备 100 μL（10 mL）8 ×透明质酸酶原液的 100 份等分试样所需的透明质酸酶量计算如下。首先，通过将活性 (U)/mL 除以活性 (U)/mg 获得1 ×溶液的透明质酸酶浓度（以mg/mL 为单位）。请注意，活性 (U)/mg 对于透明质酸酶的每个批号 (#) 都是特定的。此后，通过将 1 ×溶液的浓度乘以 8 来确定 8 ×溶液的透明质酸酶浓度（以 mg/mL 为单位）。然后，通过将等份数 (100) 乘以每个等份的体积（以毫升 (0.1 mL) 为单位）和 8 ×消化溶液的浓度来计算 100 个等份的透明质酸酶的量。最后，透明质酸酶被称重，溶解在最终体积为 10 mL 的 RPMI 中，100 μL 的等分试样在 -20 °C 下储存在 1.5 mL 微管中直到使用。

6. PMA 1 毫克/毫升储备溶液
通过在 DMSO 的 1 mL 中溶解 1 mg PMA 制备 1 mg/mL 库存溶液，并将 20 μL 的等分试样储存在 -80 °C 直至使用。
7. 离子霉素原液 (1 mg/mL)
通过将 1 毫克离子霉素溶解在 1 mL DMSO 中制备离子霉素库存溶液，并将 20 μL 的等分试样储存在 -80 °C 直至使用。
8. LIVE/DEAD 染色原液
将一小瓶染色剂和一瓶 DMSO 置于室温。确保用纸巾擦去小瓶中的任何水迹，因为 DMSO/染料溶液在受潮时不稳定。将 50 μL 的 DMSO 添加到染色小瓶中，充分混合以溶解染色，并将 2.5 μL 的等分试样储存在-20 °C 的微管中，直到需要或最多两个月。
9. FBS 等分试样
在冰箱中过夜解冻一瓶胎牛血清，平衡至室温，然后按如下方式进行热灭活。在 56°C 的水浴中加热 FBS 瓶 30 分钟，每 10 分钟左右旋转一次瓶子。为了准确起见，使用第二个大小相似的瓶子作为对照，并向对照瓶中加入等量的水。将温度计放入控制瓶中，以检查水何时达到 56 °C。此时将计时器设置为 30 分钟。制作 50 和 1 mL 的等分试样，并将它们储存在 -20 °C 直至使用。
10. 通透缓冲液
该缓冲液由添加了 0.1% 皂苷和 0.1% BSA 的无菌 PBS 组成。通过在 100 mL 的无菌 PBS 中溶解 100 毫克的皂苷和 100 毫克的 BSA 来制作渗透缓冲液。该溶液可在 4°C 下储存数月。

B. 试剂需在实验后三天内配制

1. 预稀释抗体混合物
准备未染色控制、FMO 控制和预稀释抗体混合物管，用于样品的细胞外和细胞内染色，分别如表 4 和表 5 中所述。将它们储存在 4°C 的黑暗中，直到使用。

表 4. 用于细胞外染色的预稀释抗体混合物
试剂未染色对照 FMO控制全污渍
CD45 CD3 CD4 CD8a TCRδ _ 20个样本和
表 5 的 FMO 控制
Fc 块 (μL) - 4个 4个 4个 4个 4个 27
BV786-抗CD45抗体（μL） - - 4个 4个 4个 4个 27
BUV395-抗CD3抗体（μL） - 4个 - 4个 4个 4个 27
PerCP-eF710-抗 CD4 抗体 (μL) - 4个 4个 - 4个 4个 27
AF700-抗CD8抗体（μL） - 4个 4个 4个 - 4个 27
PE-CF594-抗 TCR γδ (μL) - 4个 4个 4个 4个 - 27
胎牛血清（微升） 24 24 24 24 24 24 162
PBS (微升) 376 356 356 356 356 356 2,376人

该表显示了每管未染色对照、荧光减一 (FMO) 对照和全染色预稀释抗体混合物的 FBS、PBS 和抗体的体积，用于 20 个样本（四只小鼠和五个组织）和两个 FMO表 5 的控制加上 5%（或至少 100 μL）的过量体积，以确保 V 形底 96 孔板的每孔正确输送 100 μL 的预稀释抗体混合物。请注意，未染色对照和 FMO 对照预稀释抗体混合物仅针对三种组织制备，包括来自四只小鼠的汇集细胞的脾脏、肺和肾脏。具有血管周围脂肪组织和肠系膜淋巴结的肠系膜血管的 T 细胞太少，无法准备未染色和 FMO 控制。脾脏用于这些组织的未染色和 FMO 控制。本协议中的所有抗体均使用 1/100 的稀释度。尽管效果很好，但应在之前的实验中针对每种组织类型确定抗体的最佳稀释度（见注释 4）。在 1.5 mL 微管中制备未染色控制和 FMO 控制预稀释抗体混合物，在 5 mL 微管中制备全染色预稀释抗体混合物，并将它们储存在 4°C 的黑暗中直至使用。有关抗体的详细信息，请参见表 1。

表 5. 用于细胞内染色的抗体混合物
试剂未染色对照 FMO控制全污渍
IL-17A 干扰素γ 20个样本和
表 4 的 FMO 控制
APC 抗 IL-17A ( μ L) - - 4个 37
AF488-抗干扰素γ （μL） - 4个 - 37
通透缓冲液 400 396 396 3,626人

该表显示了每管未染色对照、荧光减一 (FMO) 对照和全染色预稀释抗体混合物的透化缓冲液和抗体的体积，用于 20 个样本（4 只小鼠和 5 个组织）和 5 个 FMO 对照表 4 加上 5%（或至少 100 μL）的过量体积，以确保在 V 型底 96 孔板的每个孔中正确输送 100 μL 的预稀释抗体混合物。请注意，未染色对照和 FMO 对照预稀释抗体混合物仅针对三种组织（包括脾脏、肺和肾脏）制备。具有血管周围脂肪组织和肠系膜淋巴结的肠系膜血管的 T 细胞太少，无法准备未染色和 FMO 控制。脾脏用于这些组织的未染色和 FMO 控制。透化缓冲液由补充有 0.1% 皂苷和 0.1% BSA 的 PBS 组成。本协议中的所有抗体均使用 1/100 的稀释度。尽管效果很好，但应在之前的实验中针对每种组织类型确定抗体的最佳稀释度（见注释 4）。在 1.5 mL 微管中制备未染色控制和 FMO 控制预稀释抗体混合物，在 5 mL 微管中制备全染色预稀释抗体混合物，并将它们储存在 4°C 的黑暗中直至使用。有关抗体的详细信息，请参见表 1。

C. 实验当天准备的试剂

1. 用于收集组织的 24 孔组织培养板：
准备一个 24 孔组织培养板，用于收集脾脏、肾脏、肺、mLNs 和肾脏处理，如图 9 所示。用要收集的组织名称和动物编号标记每只动物的五口井。每口井添加 1 mL 的冷 RPMI 用于组织收集，每口井添加 0.5 mL 用于处理肾脏并保持在冰上。

图 9。准备 24 孔组织培养板，用于收集脾脏、肾脏、肺和肠系膜淋巴结 (mLN)，以及处理四只小鼠的肾脏。 RPMI 的体积以每孔毫升表示。
2. 每只动物标记一个 50 mL 离心管，用于收集肠道和肠系膜床，并添加 30 mL 的冷 PBS。将管子放在冰上直到使用。
3. T 细胞活化混合物（1 mL/样品）
这种混合物由两种激活剂组成，PMA (0.05 μg/mL) 和钙离子载体离子霉素 (1 μg/mL)。该混合物还含有蛋白质转运抑制剂莫能菌素 (1 × , 2 μM)，它会导致蛋白质在高尔基复合体/内质网中积累，增强细胞内 IL-17A 和 IFN γ染色信号（见注释 5）。准备足够的鸡尾酒来激活四只小鼠（1 mL/组织/小鼠）的所有五个组织中的 T 细胞。对于四只小鼠和五只组织/小鼠，准备 22 mL 的 T 细胞激活鸡尾酒，如表 6 所示，如下所示。首先，将 180 μL 的 PBS 添加到 1 mg/mL PMA 库存溶液的 20 μL 等分试样中，制成 200 μL 的 0.1 mg/mL PMA 溶液。然后，将 11 μL 的 PMA 0.1 mg/mL、22 μL 的离子霉素 1 mg/mL 库存溶液、22 μL 的 monensin 2 mM 和 21.945 mL 的 RPMI 结合在 50 mL 离心管中，并将管子放在冰上直到使用。

表 6. T 细胞活化混合物的制备
试剂鸡尾酒
对于 1 毫升对于 22 毫升
PMA 0.1 毫克/毫升 (μL) 0.5 11
离子霉素 1 mg/mL (μL) 1个 22
莫能菌素 2 mM (μL) 1个 22
每分钟转数 (μL) 998 21,945
每个样本需要 1 毫升的 T 细胞活化。该表显示了为 1 和 20 个样本制作 T 细胞活化混合物所需的试剂体积。对于 20 个样品，添加 10% 的过量体积以确保每个样品正确输送 1 mL。对于四只小鼠和五只组织/小鼠，在 50 mL 微管中制备 22 mL 的 T 细胞激活鸡尾酒，并将管保持在 4°C 直至使用。

4. PFA 1% 溶液
准备足够的 PFA 1% 以修复所有未染色的控件、FMO 控件和细胞外染色后的样本（100 μL/细胞孔）。对于四只小鼠，需要固定 44 个细胞孔（图 6）。这是通过在 90 mL 无菌 PBS 中稀释一小瓶 10 mL PFA 10% 溶液来完成的。将此溶液储存在 4°C 的黑暗中直至使用。未使用的溶液可在 4 °C 下储存长达 1 个月，或在 -20 °C 下储存更长时间。
5. LIVE/DEAD 染色液
准备足够的 LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain 溶液来染色所有 FMO 对照和样品（100 μL/孔细胞），未染色的对照除外。对于四只小鼠，需要对 41 个细胞孔进行染色（图 6）。为此，通过每 2.5 μL 等份的活/死染色库存溶液添加 1 mL 的 PBS 来准备五管活/死染色，并保留一份等份的活/死染色库存溶液准备补偿珠。将管子存放在 4°C 的黑暗中，直到使用。

提前数周到数月准备 A 部分的所有试剂，提前几天准备 B 部分的所有试剂，并在实验当天准备 C 部分的所有试剂。

致谢

我们感谢 Veronique Michaud 提供的出色技术支持。
资金来源：作者的工作得到了加拿大卫生研究院 (CIHR) 第一试点基金会拨款 143348 的支持，这是加拿大 CRC 加拿大政府/CIHR 计划的加拿大高血压和血管研究主席 (CRC)，一位杰出的詹姆斯麦吉尔教授奖，并由加拿大创新基金授予 ELS，并由麦吉尔医学系戈登菲利普斯奖学金授予 KC。

利益争夺

作者声明不存在利益冲突、财务冲突或其他冲突。

伦理

该研究得到了戴维斯夫人研究所和麦吉尔大学的动物护理委员会的批准，并遵循了加拿大动物护理委员会的建议。

参考

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