材料和试剂

1. 8 孔腔室显微镜载玻片（ Thermo Scientific，Nunc，目录号：177402）
2. 塑料盖玻片（Electron Microscopy Sciences，目录号：72261-50）
3. 玻璃盖玻片（Fisher Scientific，目录号：12-548-5M）
4. Kimwipes（Fisher Scientific，目录号：NC9855580）
5. 铝箔（Fisher Scientific，目录号：01-213-105）
6. 纸巾（Envision，目录号：23304）
7. 0.22微米瓶顶过滤器（康宁，目录号：430758）
8. 兔抗生物素抗体（Cell Signaling，目录号：5597S）
9. 小鼠抗生物素抗体（Sigma-Aldrich，目录号：B7653）
10. 5'-乙烯-2'-脱氧尿苷（ EdU ）（Invitrogen，目录号：A10044）
11. 多聚甲醛 32% 溶液，EM 级 (PFA)（EMS，目录号：15714）
12. Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
13. 生物素叠氮化物（Invitrogen，目录号：B10184）
14. Alexa Fluor 488叠氮化物（Invitrogen，目录号：A10266）
15. 硫酸铜溶液（ Fluka Analytical，目录号：35185）
16. 抗坏血酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：11140）
17. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（Sigma-Aldrich，目录号：P4417）
18. Duolink®鼠标加PLA探针（Sigma-Aldrich，目录号：DUO92001-100RXN ）
19. Duolink®兔减去 PLA 探针（Sigma-Aldrich，目录号：DUO92005-100RXN）
20. Duolink®阻断溶液（ Sigma-Aldrich，目录号： DUO82007-8ML ）
21. Duolink®抗体稀释剂（ Sigma-Aldrich，目录号： DUO82008-8ML ）
22. Duolink® PLA 检测试剂红（Sigma-Aldrich，目录号：DUO92008-100RXN ）
23. Duolink®原位洗涤缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：DUO82049-20L ）
24. 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Life Technologies，目录号：62248）
25. Prolong Gold 抗淬灭试剂（Invitrogen，目录号：P36934）
26. 细胞特异性培养基
27. 双脱氧胞苷（ddC，20 μM ）（Sigma - Aldrich，目录号：D5782）
28. MitoPQ （10 μM ）（Abcam，目录号：1821370-28-8）
29. mtOX （ Wisnovsky等人， 2016 年）
30. 氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：7647-14-5）
31. 吐温 20（Sigma-Aldrich，目录号：P7949）
32. 盐酸（HCl）（Fisher Scientific，目录号：7647-01-0）
33. Trizma盐酸盐（Tris-HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：T5941）
34. Tris 碱基（Fisher Scientific，目录号：BP152-1）
35. 二甲基亚砜（DMSO）（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-358801）
36. 固定液（见食谱）
37. 透化解决方案（参见配方）
38. 洗涤缓冲液 A （参见配方）
39. 洗涤缓冲液 B （参见配方）
40. EdU原液（见配方）
41. 生物素叠氮化物原液（见配方）
42. Alexa488-叠氮化物原液（见食谱）

设备

1. Autoflow IR 水套式 CO2培养箱（NUAIRE，型号：NU-4750）
2. Nikon eclipse Ti -U 倒置显微镜（Nikon，型号： Ti -U）
3. 科林罐 ( Thermo 科学TM E94）
4. 细弯钳（Fine Science Tools，Dumont #7，目录号：11271-30）
5. 滑动盒（VWR，目录号：82003-414）
6. Vortexer （VWR 模拟涡旋混合器，目录号：10153-838）
7. 4 °C 冰箱（BSI，型号：SCGP21OW1AREF）
8. -20 °C 冰箱（BSI，型号：ABT-2020MB）

软件

1. NIS 元素（尼康， https://www.nikoninstruments.com/Products/Software ）
2. ImageJ（ImageJ， https://imagej.net/Welcome ）
3. 微软 Excel（微软， https://products.office.com/en-us/excel ）
4. GraphPad 棱镜（GraphPad， https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ）

程序

A. 细胞标记

1. 实验前一天，将 1 × 10 4 – 2 × 10 4细胞在8 孔腔室显微镜载玻片的每个孔中的 300 μL 适当生长培养基中以对数期生长。细胞应在实验当天达到 50% – 60% 的汇合度。
注意：我们仅将此程序用于贴壁细胞。然而，应该可以使用悬浮细胞，因为它们可以在溶液中用EdU处理，使用细胞离心涂片器沉积在显微镜载玻片上，然后固定以进行测定。
2. 第二天，从腔室井中吸出生长培养基，并添加 200 μL 的预热生长培养基，其中含有 20 μM 教育。在组织培养箱中在 37°C 下孵育幻灯片 1 小时。请注意，可能需要针对细胞系/类型优化孵育时间。这个条件， E only ，允许检测未受干扰的新复制的mtDNA 。
在处理过程中细胞复制中断。出于同样的原因，洗涤和处理要简洁，以限制暴露在室温(RT) 下，这可能会破坏复制。
3. （可选）为了测定mtDNA叉保护，1 小时后吸出含有EdU 的介质，在 RT 下用 PBS (pH 7.4)快速但轻轻地清洗腔室孔，吸出，并添加含有mtDNA复制停滞剂的生长培养基，用于各自的选择多少时间。
注意：典型的mtDNA特异性复制停滞剂是 ddC（20 μM ）、 MitoPQ （10 μM ）或mtOX （4 μM ），在固定前在 37 °C 下添加 1-3 小时。为了测定复制重启，这是在复制停滞后恢复mtDNA复制的能力，首先用mtDNA停滞剂处理，然后快速 PBS 洗涤和EdU媒体的孵化。
4. 始终包括一个没有EdU处理的孔作为阴性对照——无EdU 。

B. 细胞固定

1. 吸出生长培养基并在室温下用 PBS 轻轻清洗水井两次。小心地将 200 μL新制备的固定溶液（在 PBS 中稀释的 2% PFA）添加到每个孔中。在 RT 孵育 15 分钟而不干扰幻灯片。
注意：固定时间可能因细胞类型而异。在化学安全柜内小心处理 PFA 。根据机构生物安全指南丢弃 PFA 废物。其他固定方法可能是可行的，但需要进行测试。
2. 固定后，丢弃 PFA 并在 RT 下用 PBS 清洗两次，每次 5 分钟。从幻灯片上拆卸腔室并使用细弯钳取出硅胶垫圈（图 1）。根据需要将水井小心地放入含有 PBS 的Coplin罐中，确保水井不会变干。
注意：固定载玻片可在 4°C 下保存在 PBS 中长达一周。

图 1. 硅胶垫圈拆卸。使用细弯钳去除硅胶垫圈。小心避免用钳子刮伤幻灯片。

C. 细胞透化

1. 在含有 60 mL 渗透溶液（PBS 中的 0.25% Triton X-100）的Coplin罐中来渗透细胞，足以在 RT 完全覆盖幻灯片 15 分钟。
Coplin罐中在 RT 下清洗载玻片5 分钟 3 次。

D. 点击反应

1. 通过将湿纸巾或 Kimwipes 放在 RT 的滑动盒内来准备加湿室（图 2）。关闭时让腔室平衡 5 分钟。

图 2. 加湿载玻片室。 A. 通过将折叠的纸巾或用蒸馏水或 PBS 润湿的 Kimwipes 放在空的滑动盒中来准备加湿室。 B. 载玻片平放，在孵育过程中朝上，并小心地盖上塑料盖玻片。一次在一端盖上盖玻片可以避免气泡。

2. 准备新鲜的 Click-IT 反应鸡尾酒。按照以下顺序，将 2 mM 硫酸铜添加到 PBS、10 μM生物素叠氮化物和 100 mM 抗坏血酸钠中。添加每个组件后通过涡旋混合均匀。
笔记：
a. 每次使用前新鲜制备 1 M 抗坏血酸钠。
b. 保护生物素叠氮化物免受光照。
c. 叠氮化物和生物素叠氮化物（1:10，总计 10 μM ）的混合物，而不是单独使用生物素叠氮化物，以便确定细胞周期阶段（图 3）。处理Alexa 488叠氮化物时要避光。

图 3. 用于区分细胞周期和对照各个阶段的 MIRA 信号的代表性图像。 A.用 20 μM处理的 UWB1.289 细胞中的 MIRA 示例教育1 小时。请注意，Alexa 488叠氮化物共同点击的绿色核信号可以区分 S 期和非 S 期细胞 [无绿色核信号，仅 DAPI 信号（蓝色）]。 PLA 信号（红色）在 S 期的细胞核内检测到，在所有细胞周期阶段在线粒体的细胞核外检测到。比例尺 = 20微米。 B. Rho 零 SH2038 细胞中 MIRA 测定（红色）的代表性图像，如PicoGreen DNA 染色（绿色）所示， mtDNA已耗尽，有和没有EdU作为阴性对照。比例尺 = 10微米。

3. 将幻灯片面朝上放置在加湿室中（图 2）。添加 40 – 50 μL /孔的 Click-IT 反应混合物。用干净的塑料盖玻片小心地盖住每张幻灯片，避免形成气泡。
注意：在协议期间的任何时候都不允许孔干燥。
4. 关闭腔室盖以保持腔室中的湿润条件，并在 RT 下孵育 1 小时。

E. 阻断和一抗孵育

1. Coplin罐中清洗载玻片5 分钟 3 次。
2. 将载玻片放回加湿室中。添加 50 μL /孔的Duolink封闭溶液。用干净的塑料盖玻片小心地盖住每张幻灯片，避免气泡。
3. 关闭加湿室并在 RT 孵育 1 小时。
4. Duolink抗体稀释剂中稀释一抗 [小鼠抗生物素 (1:100) 和兔抗生物素 (1:100)] 。
注意：对于mitoSIRF ，将兔抗生物素或小鼠抗生物素替换为针对感兴趣蛋白质的一抗。可以调整一抗浓度和孵育时间以进行优化。
5. 1 小时后，轻轻取下塑料盖玻片并轻敲幻灯片以去除阻塞溶液。
6. 将载玻片置于加湿室中，直接加入 35 μL /孔的稀释一抗溶液。应用新的塑料盖玻片，避免气泡的形成。
7. 关闭加湿室并在 4°C 下孵育过夜。

F. 邻近连接分析 (PLA)

1. 含有 60 mL Duolink洗涤缓冲液 A（10 mM Tris-HCl pH 7.5、150 mM NaCl 和 0.05% Tween 20）的Coplin罐中清洗幻灯片，每次 RT 5 分钟，以去除初级抗体。
2. 在洗涤过程中将加湿室放置在 37 °C 的培养箱中，预热加湿室。
3. 使用Duolink PLA 检测试剂盒，在抗体稀释剂中按 1:5 稀释Duolink原位 PLA 探针（抗小鼠加和抗兔减）。
4. 去除多余的Duolink洗涤缓冲液 A，并将载玻片放入预热的加湿室中。添加 30 μL /孔的 PLA 探针。
5. 在每张幻灯片上涂上新的塑料盖玻片，并在加湿室中在 37°C 下孵育 1 小时。
6. 含有Duolink洗涤缓冲液 A 的Coplin罐中，在 RT 处清洗载玻片 3 次，每次 5 分钟，以去除 PLA 探针。
7. 使用Duolink PLA 检测试剂盒，通过稀释 5 × 高压灭菌水中的Duolink连接缓冲液 (1:5) 和Duolink 1 ×连接酶 (1:40)。
注意：在解冻期间和解冻后涡旋连接缓冲液，确保溶解任何沉淀物。将连接酶保存在-20°C 的冷冻块中，并添加到连接缓冲液中。
8. 轻敲多余的洗涤缓冲液并将载玻片放回加湿室中。添加 30 μL /孔的结扎混合物。
9. 在每张幻灯片上放一个新的塑料盖玻片，并在 37°C 的加湿室中孵育 30 分钟。
10. 使用Duolink洗涤缓冲液 A 在Coplin罐中清洗载玻片两次，每次 RT 5 分钟。
11. 通过稀释 5 × Duolink扩增缓冲液 (1:5) 和Duolink 1 ×聚合酶 (1:80) 的高压灭菌水。
注意：限制扩增缓冲液的曝光，例如，通过在琥珀色避光管中或在覆盖有铝箔的管中制备溶液。将聚合酶保存在-20°C 的冷冻块中。
12. 轻敲多余的洗涤缓冲液并将载玻片放回加湿室中。添加 30 μL /孔的扩增混合物。
13. 用新的塑料盖玻片覆盖每张幻灯片，并在 37°C 的加湿室中孵育整整 100 分钟。
14. 含有Duolink洗涤缓冲液 B（200 mM Tris-HCl pH 7.5 和 100 mM NaCl）的Coplin罐中清洗载玻片三次，每次 RT 和黑暗中 10 分钟。
15. 含有 0.01倍稀释的Duolink洗涤缓冲液 B 的Coplin罐中，在黑暗中洗涤载玻片 1 分钟，以去除多余的盐分。

G. DAPI 染色和封片

1. 制备 DAPI 溶液（1：1，000、1微克/mL 最终浓度）。
注意：避光。
2. 轻敲多余的洗涤缓冲液 B，然后将载玻片放回加湿室中。添加 30 μL /well 的 DAPI 溶液。
3. 盖上新的塑料盖玻片，并在 RT 的加湿室中孵育 5 分钟。
4. Coplin罐中清洗载玻片两次，每次 RT 5 分钟。
5. 从幻灯片中取出多余的 PBS，并将它们放在纸巾上进行安装。
6. 将 ~ 20 μL的 Prolong Gold 抗褪色试剂添加到幻灯片的每个孔中，并安装玻璃盖玻片（1.5 毫米）。安装时避免气泡，并从盖玻片边缘擦去多余的安装试剂。将幻灯片放在 RT 的干燥幻灯片盒中过夜，以固化并避免暴露在光线下。
注意：应在两天内成像。如果不可行，请将幻灯片存储在 -20 °C，允许幻灯片在成像前进入 RT，并且不要反复冻结幻灯片。

数据分析

1. 使用荧光显微镜（例如 Nikon Eclipse Ti ）放大 40 × /0.95 数值孔径 (NA) 的图像幻灯片（对于较大的细胞，20 × /0.75 NA 也可能足够）。 PLA 信号在 TXRED 通道中捕获（Ex 594 nm， Em 624 nm，如 Sigma Duolink推荐用于Duolink检测试剂红色）。当与 Alexa 488叠氮化物（Ex 495 nm， Em 519 nm）共同点击时，GFP 滤光片用于对细胞成像。 DAPI 过滤器用于可视化细胞核（Ex 358 nm， Em 461 nm）。合并后的图像文件用于后续分析（图 3）。通常，在每个条件下总共获得 50 – 150 个细胞，从而获得井不同区域的4 – 8 个图像字段。显微镜本征定量软件，如 Nikon NIS-elements 软件（亮点检测）或 ImageJ（ https://imagej.net/Welcome ），可用于确定每个细胞的MIRA PLA 或mitoSIRF信号的数量。因此，仅考虑细胞核外的信号。或者，当信号非常丰富且无法通过软件区分时， TXRED 通道的平均荧光强度是使用显微镜软件（例如 Nikon NIS-elements 软件）测量的。
2. 对含有 Alexa 488 的细胞核外的信号进行计数可以区分 S 期和非 S 期的线粒体事件。
3. 学生t检验用于确定条件和/或细胞系之间差异的显着性。如果数据遵循 D'Agostino & Pearson 正态性检验测量的非正态分布，则使用Mann-Whitney t检验来确定统计显着性（ Luzwick 等人，2021 年）。

食谱

1. 固定液
a. 在 150 mL 的 PBS pH 7.4 中加入 10 mL 的 32% PFA 溶液库存，制成 2% PFA 并混合均匀。
b. 将剩余的稀释 PFA 存放在密封瓶中，在 RT（最多一周）或 4°C 下避光最多一个月。

2. 通透液
a. 在 487.5 mL PBS（pH 7.4）中加入 12.5 mL 的 10% Triton X-100 溶液，制成 0.25% Triton X-100 溶液。
b. 混合均匀并储存在室温下。

3. 洗涤缓冲液 A
a. 在 800 mL 高压灭菌水中溶解 8.8 g NaCl、1.2 g Tris 碱和 0.5 mL Tween 20。
b. 使用 HCl 将 pH 值调整为 7.4。
c. 将高压灭菌水添加到 1，000 mL（最终浓度为 0.01 M Tris、0.15 M NaCl 和 0.05% Tween 20）。
d. 过滤溶液（0.22 μm过滤器）并储存在 4°C。使用前将解决方案带到 RT。

4. 洗涤缓冲液 B
a. 在 500 mL 高压灭菌水中溶解 5.84 克 NaCl、4.24 克 Tris 碱和 26 克 Tris-HCl。
b. 使用 HCl 将 pH 值调整为 7.5。
c. 将高压灭菌水添加到 1,000 mL（最终浓度为 0.2 M Tris 和 0.1 M NaCl）。
d. 过滤溶液（0.22 μm过滤器）并储存在 4°C。使用前将解决方案带到 RT。

5. EdU库存解决方案
EdU的小瓶中，制成 100 mM 库存。涡旋溶解粉末。将库存溶液的等分试样储存在 -20 °C 避光。

6. 生物素叠氮化物原液
叠氮化物的小瓶中，制成 1 mM 库存。涡旋溶解粉末。将库存溶液的等分试样储存在 -20 °C、干燥并避光。

7. Alexa488-叠氮化物原液
将 0.58 mL 的 DMSO 直接添加到含有 0.5 mg Alexa 488叠氮化物的小瓶中，以制成 1 mM 库存。涡旋溶解粉末。将库存溶液的等分试样储存在 -20 °C、干燥并避光。

致谢

这项工作得到了 NIEHS 的支持，获得了 1R01ES029680 奖，并得到了 CPRIT RP180463、R1312 和 RP180813 (KS) 的支持。 KS 是 Rita Allen 基金会研究员和癌症生物学 CPRIT 学者（之前的奖项 R1312）。该协议源自Luzwick等人中描述的测定系统。 ( 2021 ) 。

利益争夺

作者没有竞争利益。

参考

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