材料和试剂

我们在这里描述了我们使用的确切材料和试剂。任何等效的材料和试剂也可能适用于该程序。

材料

1. 过滤器吸头 PIPETMAN® DIAMOND 0.1–10 μL 、2–30 μL 、20–200 μL 、200–1,000 μL （Gilson，目录号：F171203、F171303、F171503、F171703）
2. 无菌血清移液器； 2、5、10、25 和 50 mL（Greiner，目录号：710160、606180、607107、760180、768160）
3. 发泡聚苯乙烯冰桶
4. 带螺旋盖的实验室瓶； 100 和 500 mL 以及 1 和 2 L（VWR，目录号： 215-1592， 215-1594、215-1595、215-1596 ） _
5. 培养皿，聚苯乙烯，100 × 15 mm（Corning-Falcon，目录号：351029）
6. 1.5 mL安全锁 Eppendorf 微管（Eppendorf，目录号： 0030121872）
7. Greiner 培养管，14 mL 圆底，带按扣式排气盖（Merck，目录号： Z617954）
8. 1.5 (ø 11 mm)、15 (ø 17 mm) 和 50 mL 试管 (ø 30 mm) 的试管架
9. L 形细胞扩散器（ Thermo Fisher Scientific，目录号： SPCS01）
10. 圆锥底管； 15 和 50 mL （ Corning-Falcon，目录号：352096、352070）
11. Minisart高流量注射器过滤器 0.2 μm孔径（ Sartorius，目录号：16532）
12. 一次性使用无菌注射器； 1、5、10 和 60 mL（ Fisherbrand TM ， Thermo Fisher Scientific，目录号： 17161936、15809152、15819152、15839152）
13. 冷冻管 1.8 mL 圆底（Nunc，目录号：368632）
14. 铝箔
15. PES 0.2 μm过滤单元（Nalgene，目录号：564-0020）
16. 高分辨率凝胶过滤Superdex® 200 增加 10/300 GL 柱（ Cytiva ，目录号：28990944 ）

试剂

1. 双蒸水 (ddH 2 O)
2. 冰
3. 具有分解代谢物抑制 (SOC) 培养基的超级最佳肉汤（ Thermo Fisher Scientific，目录号：15544034）。或者，可以根据配方部分提供的配方制备 SOC 培养基
4. SHuffle ® T7 表达感受态大肠杆菌（New England BioLabs ，目录号：C3029J）
5. NucleoSpin质粒QuickPure TM试剂盒（ Macherey -Nagel，目录号： 740615）
6. YPD（YEPD）琼脂粉（MP Biomedicals，目录号：114001222）
7. 溶原肉汤（LB）粉末（MP Biomedicals，目录号：113002022）
8. 卡那霉素硫酸盐粉末（ Thermo Fisher Scientific，目录号：15160054）
9. 咪唑（默克，目录号： I2399）
10. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) pH 7.2（Merck，目录号： D8537）。或者，可以根据配方部分提供的配方制备 PBS
11. 异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（默克公司，目录号： I5502）
12. 氯化钠（NaCl）（默克，目录号： S7653）
13. Trizma ®盐酸盐（Tris-HCl）（默克公司，目录号： 93363）
14. 来自鸡蛋清的溶菌酶（默克，目录号： L6876）
15. 蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（ cOmplete TM ）（默克，目录号： 11697498001）
16. HisTrap FF 1 mL（预装了预充电的 Ni Sepharose® 6 fast flow）（ Cytiva ，目录号： 17531901）
17. Laemmli样品缓冲液 4 × （Bio - Rad，目录号： 161-0747）
18. XT 还原剂（Bio - Rad，目录号： 161-0792）
19. 4% – 15% 10 孔 mini-protean TGX 免染色凝胶（Bio - Rad，目录号： 4568084）
20. 10 × Tris/甘氨酸/SDS（TGS）缓冲液（Bio - Rad，目录号： 161-0772）
21. 硝酸纤维素膜 0.2 μm （Trans-Blot Turbo Transfer Pack）（Bio - Rad，目录号：1704158）
22. 蛋白质印迹检测试剂（ECL TM Prime）（ Cytiva ，目录号：RPN2232）
23. 胰蛋白胨（默克公司，目录号： T2559）
24. 酵母提取物（默克，目录号： Y1625）
25. 氯化钾（默克，目录号： P9333）
26. MgCl 2 （默克，目录号： M2670）
27. MgSO 4 （默克，目录号： 63138）
28. 葡萄糖（默克，目录号： G7528）
29. 离心浓缩器Amicon Ultra-4（10 kDa MWCO）（Merck，目录号：UFC8010）
30. 甘油≥99%（默克，目录号：G6279）
31. LB 培养基 (1 × )（见食谱）
32. SOC 培养基 (1 × )（参见食谱）
33. 卡那霉素原液 (50 mg/mL)（见配方）
34. 50% 甘油溶液（见配方）
35. 细菌重悬溶液/IMAC 电泳缓冲液（见配方）
36. IMAC 洗脱缓冲液（参见配方）
37. Tris 缓冲盐水 (TBS)（参见配方）
38. Tris 缓冲盐水 (TBST)（参见食谱）
39. 蛋白质印迹封闭液（TBS-5% 牛奶）（见食谱）
40. 蛋白质印迹抗体稀释液（TBST-5% 牛奶）（见配方）
41. 磷酸盐缓冲液 (PBS)（参见食谱）

设备

1. 移液管 PIPETMAN® 0.1–10 μL 、 2–20 μL 、20–200 μL 、100–1,000 μL （Gilson，目录号：FA10002M、FA10003M、FA10005M、FA10006M）
2. Macroman®移液器（ Gilson，目录号：F110120 ）
3. 硼硅酸盐玻璃窄颈锥形瓶，50 和 500 mL 以及 3 L（ Fisherbrand TM ， Thermo Fisher Scientific，目录号：15499093、15439103、15469103）
4. 玻璃量筒， 100 和 500 mL 以及 1 和 2 L（VWR，目录号：612-3836、612-3838、612-3839；612-3840）
5. 垂直凝胶电泳系统（PROTEAN Tetra cell）（Bio - Rad，目录号：1658004）
6. 高压灭菌器（在 120 °C 下运行 20 分钟，饱和蒸汽≥ 15 psi）
7. 可精确调节温度的水浴锅（范围：37–42 °C）
8. 可精确调节温度（范围：20–37 °C）的振荡培养箱，例如Multitron Standard 培养箱（ Infors HT）
9. 培养箱允许精确的温度调节（范围：30–37 °C）
10. 进行OD 监测的分光光度计，例如BioSpectrometer® Basic (Eppendorf)
11. 标准冰箱和冰柜 (- 20 °C)
12. 超低温冷冻机（ -80℃）
13. 冷冻离心机，如多功能 5810 系列离心机 (Eppendorf)
14. 酸度计
15. 带磁力搅拌棒的磁力搅拌器（VWR，目录号：442-1271）
16. 带气源的EmulsiFlex-C5 均质器 ( Avestin )（推荐输入压力 120 psi/8 bar）
17. 真空泵
18. 电源（Power PAC 300）（Bio - Rad，目录号：164-5050）
19. ChemiDoc TM MP 成像系统（Bio - Rad）
20. 摇摆平台
21. Trans-Blot Turbo 转移系统（Bio - Rad）
22. 自动液相色谱系统，如ÄKTA purifier 10 ( Cytiva )
23. 色谱冰箱，比如Mediline LKPv 6522（利勃海尔）

程序

A. scFv 2H7 -P18F3的表达

抗体片段如scFv或 VHH（也称为纳米抗体）具有对其功能所必需的结构化二硫键。在细菌中，二硫键结合的形成需要通过 N 末端信号肽将蛋白质转移到细胞的周质区室（Denoncin 和 Collet，2013）。因此，在基于标准大肠杆菌的系统中表达二硫键重组蛋白通常会导致产量低。技术进步现在可以通过使用突变大肠杆菌菌株（例如SHuffle ® ）来克服这一限制，这些菌株能够促进细胞质中二硫键的形成，从而导致重组蛋白更有效的折叠、活性提高和产量增加（Lobstein 等等人，2012 年）。

第 1 天。制备含有 LB 和琼脂并辅以卡那霉素（LB –琼脂 K + ）和 LB K +表达培养基的选择板
1. 对于 10 个盘子，称重 2.25 克琼脂粉（15 克/升）和 3.75 克 LB 粉（25 克/升）。溶解在250 mL 可高压灭菌玻璃瓶中的150 mL ddH 2 O 中。将盖子放回瓶子上，不要完全拧紧，以便在高压灭菌过程中释放压力。
2. ≥ 15 psi下，在 120 °C 下高压灭菌 20 分钟。
3. 在冰上解冻一管卡那霉素（库存溶液为 50 mg/mL）。
4. 高压灭菌循环完成后，让瓶子冷却至大约 50 °C（在此温度下，您应该能够将手放在玻璃瓶上几秒钟）。
5. 加入卡那霉素150 μL ，混匀得LB-琼脂K + （终浓度：50 μg /mL）。
6. 将 15 mL 的 LB –琼脂 K +分配到 10 个培养皿中（100 × 15 毫米）（图 2A）。
7. 稍微打开盖子让盘子冷却，直到 LB –琼脂 K +完全凝固和干燥（图 2B）。
8. 4 °C下储存（LB -琼脂 K +层面向顶部）长达两周（图 2C）。

图 2. 铸造 LB –琼脂 K + 。 A. 使用血清移液器将 15 mL 温 LB –琼脂 K +倒入培养皿中。 B. 的然后让板干燥。 C. 完全干燥后，将板倒置并可在 4°C 下储存长达两周。

。使用 pET-28a-NC-(scFv 2H7 -P18F3)转化SHuffle ® T7 表达感受态大肠杆菌
1. 在冰上解冻 pET-28a-NC-(scFv 2H7 -P18F3) DNA。
2. 解冻一管SHuffle ® T7 表达感受态大肠杆菌(50 μL )。
3. 将 50 ng pET-28a-NC-(scFv 2H7 -P18F3) DNA（5 μL来自 10 ng/ μL原液）添加到细菌悬浮液中并轻轻混合（无需涡旋）。
4. 将管子放在冰上 30 分钟。同时，在 42°C 下平衡水浴。
5. 从冰上取下管子，在水浴中浸泡 30 秒（42 °C 热冲击）。
6. 将管子放回冰上 5 分钟。
7. 将 950 μL的室温 SOC 介质添加到管中，并将整个体积（1 mL）转移到新的 Greiner 培养管中。将盖子放回管子上，不要夹住它让空气进入。
8. 将管子放在合适的架子上，并在 30°C 下剧烈摇晃 1 小时。在这里，我们使用Multitron Standard 培养箱并将托盘转速设置为 250 rpm。同时，在 30°C 的培养箱中平衡五个 LB -琼脂 K +选择板。
9. 停止转化混合物的孵化，并使用 SOC 培养基在 1.5 mL 安全锁 Eppendorf 管中进行五次 10 倍连续稀释（图 3）。
10. 使用 L 形细胞分布器将 100 μL的每种稀释液分布到 LB K +选择板上。
11. 在 30 °C 的培养箱中孵育平板 [平板应倒置（图 2C）] 过夜（18–20 小时），以实现SHuffle ®最佳生长。

图 3 。用 pET-28a-NC-(scFv 2H7 -P18F3)转化的感受态大肠杆菌的铺板程序。转化混合物在 1.5 mL 管中进行系列稀释。然后使用100 μL的每种稀释液接种五个不同的 LB K +选择板。

第 3 天。从单个菌落培养液体细菌
1. 从培养箱中取出盘子（盘子 1–5 ）并将它们储存在 4°C。
2. 在一天结束时，在冰上解冻一管卡那霉素（库存溶液为 50 mg/mL）。
3. 将 1 mL 的卡那霉素库存溶液添加到 1 L 的 LB 介质中。
4. 准备一个含有 1 mL LB 培养基的 Greiner 培养管，辅以 50 μg /mL（LB K + ）的卡那霉素，并将剩余的 LB K +培养基储存在 4°C。
5. μL清洁吸头（图 4A）从其中一个盘子（盘子 1–5）中拾取一个孤立的菌落。
6. 将尖端放入含有 1 mL LB K +的管内，将盖子放回管上而不夹住它，并在 30 °C 下剧烈摇动孵育过夜（图 4B）。

图 4. 拾取单个细菌菌落接种过夜液体培养物。 A. 用 200 μL移液器吸头接触单个细菌菌落。 B. 然后将尖端放入装有 1 mL LB K +的试管中。可以在旋转几秒钟后取出吸头，也可以在 30 °C 过夜孵育期间将吸头留在试管中。

第 4 天。细菌培养扩大，重组蛋白表达的诱导，甘油储备

细菌培养放大，重组蛋白表达的诱导
1. 在 30°C 的培养箱中平衡 1 L LB K +介质。
2. +培养基的 50 mL Erlenmeyer 培养瓶中。用铝箔盖住烧瓶的颈部（图 5A）。
3. 在 30°C 下剧烈摇动培养瓶 3 小时。
4. 将 10 mL 培养物转移到含有 90 mL LB K +培养基的 500 mL Erlenmeyer 培养瓶中。用铝箔盖住烧瓶的颈部（图 5B）。
5. 在 30°C 下剧烈摇动培养瓶 3 小时。
6. 将 100 mL 培养物转移到含有 900 mL LB K +培养基的 3 L Erlenmeyer 培养瓶中。用铝箔盖住烧瓶的颈部（图 5C）。
7. 在 30 °C 下剧烈摇动培养瓶，并使用分光光度计经常（每 30 分钟）检查培养物的光密度（OD 600nm ）。
8. 在冰上以 1 M 解冻一管 IPTG 库存溶液。
9. 当 OD 达到 0.8 时，在 15 mL Falcon 管（预诱导样品）中收集 10 mL 的培养物，并将其保持在室温下直至处理（参见图 6 中的程序）。
10. 将 200 μL的 IPTG 从库存溶液添加到烧瓶中（最终 IPTG 浓度为 0.2 mM）（图 5D）。
11. 在 20°C 下用剧烈摇动（250 rpm）孵育烧瓶过夜（14-16 小时）。

图 5。 scFv 2H7 -P18F3 表达的放大和诱导培养。 A – C. 在 LB K +培养基中连续三个 1:10 稀释后，过夜培养物被消耗。 D. 在引入 IPTG 之前对第一份培养物进行取样（预诱导培养）。在 20°C 下孵育 16 小时后，对第二份培养物（IPTG 诱导培养物）进行取样。

甘油备料
可以建立含有 pET-28a-NC-(scFv 2H7 -P18F3)的细菌甘油储备，以避免每次进行蛋白质表达过程时进行细胞转化/电镀步骤。此程序应在预诱导培养等分试样取样后立即执行。
1. 将 1 mL 预诱导培养样品（来自第 4 天，第 9 步）转移到 1.5 mL 安全锁 Eppendorf 管中，以 500 ×离心 g 20 分钟，去除上清液，并将细胞颗粒冷冻在 -20 °C 直至进一步分析（图 6A）。
2. 将 4 mL 的培养物从预诱导培养样品转移到新的 15 mL Falcon 管（图 6B）。
3. 将 4 mL 的 50% 甘油溶液（参见食谱）加入试管中，颠倒最多 10 次以充分混合。
4. 将培养物/甘油混合物分配到八个冷冻管（每管 1 mL），并在 -80 °C 下冷冻。
强烈建议在此阶段对质粒进行测序。
5. ×离心剩余的 5 mL 培养样品（来自第 4 天，第 9 步） g 10 分钟，丢弃上清液，并按照制造商的说明使用NucleoSpin质粒试剂盒从沉淀的细胞中分离质粒 DNA（图 6C）。
6. 然后可以对分离的质粒 DNA 进行测序，以确保细菌甘油原液适用于新的蛋白质表达过程（甘油原液验证）。

图 6. 甘油储备液的制备和验证。在第 4 天第 9 步收集 10 毫升预诱导样品。 A. 第一个等分试样冷冻在 -20 °C，用作十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质表达分析期间的非诱导培养样品（ SDS 页）。 B. 预诱导细菌培养物与 50% 甘油 (v/v) 混合并分配到冷冻管中。然后将冷冻管冷冻在 -80 °C 以构成细菌的甘油储备。 C. 预诱导样品的剩余部分用于分离质粒 DNA 并确保其正确序列。

附录：从甘油原液中进行蛋白质表达
可以从经过验证的甘油原液中进行新的蛋白质表达过程。
1. 准备一个含有 1 mL 辅以卡那霉素 (LB K + ) 的 LB 培养基的 Greiner 培养管。
2. 从 -80 °C 中取出甘油库存冷冻管（不要让它完全解冻）。
3. μL干净的吸头刮掉冷冻培养物/甘油混合物的顶部。
4. 将吸头放入含有 1 mL LB K +的试管中，将盖子放回试管上，不要夹住它，剧烈摇动孵育过夜。
5. 将甘油库存冷冻管放回-80°C。
6. 第二天，如前所述（第 4 天的步骤 1-11），继续进行细菌培养放大和重组蛋白表达的诱导。

第 5 天。收获 IPTG 诱导的细菌培养物和蛋白质表达评估

文化收获
1. 将 1 mL IPTG 诱导的培养样品转移到 1.5 mL 安全锁 Eppendorf 管中，500 ×离心 g 20 分钟，去除上清液，并将细胞沉淀冷冻在 -20 °C，直到通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 进一步分析。
2. 将诱导的细菌培养物从 3 L 烧瓶转移到四个 500 mL 离心管中。
3. ×离心管 g室温 20 分钟。
4. 丢弃上清液并将四种细菌颗粒中的每一种重悬于 10 mL 细菌重悬溶液中（参见食谱）。
5. 将细菌悬浮液 (4 x 10 mL) 放入 50 mL Falcon 管中，并在 -80 °C 下冷冻，直至进一步使用。

蛋白质表达的评估
建议在开始纯化过程之前评估蛋白质表达。以下协议描述了如何通过 SDS-PAGE 分析整个培养样品中的蛋白质表达，然后进行蛋白质印迹。通过检测可溶性和不溶性组分*中的重组蛋白，也可以对裂解细菌进行更精细的分析。
*注意：为制备这些组分，将整个培养样品以 500 × g 离心 20 分钟 (4 °C)，并弃去上清液。将细菌沉淀重新悬浮在 PBS 中（与弃去的上清液体积相同）。通过反复冷冻/解冻循环裂解细胞。菌管置于-80 ℃ 20 min，快速解冻 37 °C，并立即放回-80 °C 20 分钟。有效的细胞裂解可能需要四到五个冷冻/解冻循环。然后将样品以 15,000 × g 离心 20 分钟 (4 °C)，并保存代表可溶性部分的上清液。将 PBS（与保存的上清液相同体积）添加到不溶性物质中。不溶性部分的再悬浮可以通过动态移液然后剧烈涡旋来实现。
1. 在冰上解冻 1.5 mL 安全锁 Eppendorf 管，其中包含预诱导培养样本和 IPTG 诱导培养样本的细胞颗粒。
2. 在 1 mL 的细菌再悬浮溶液中重新悬浮细胞颗粒。
3. 准备两个试管，每个试管含有 5 μL的 4 × Laemmli样品缓冲液、1 μL的 XT 还原剂和 14 μL的再悬浮细菌（非诱导和 IPTG 诱导）。
4. 在 90 °C 下孵育管子 5 分钟。
5. 使用 4%–15% 10 孔微型变形 TGX 无污凝胶和 TGS 缓冲液作为运行缓冲液制备垂直电泳系统。
6. 20 μL加载到井中，并在 100 V 下运行凝胶，直到蓝色迁移前沿穿过凝胶铸件（大约 2 小时）。
7. ChemiDoc TM MP 成像系统（激活 45 秒）上使用 Stain Free 技术拆胶并评估蛋白质迁移（图 7-左图）。
8. 使用 Trans-Blot Turbo Transfer Pack 和 Trans-Blot Turbo Transfer 系统（1.3 A，25 V，7 分钟）将凝胶转移到 0.2 μm硝酸纤维素膜上。
9. 将膜在蛋白质印迹封闭溶液（TBS-5% 牛奶；参见食谱）中于室温下在摇摆平台上孵育 1 小时。
10. 在室温下在摇摆平台上用 TBST-5% 牛奶（参见食谱）稀释 1:10,000 的 HRP 偶联抗 His 抗体（Penta His）孵育膜 1 小时。
11. 丢弃抗体溶液，并在 TBST 中连续进行三次膜清洗，每次 10 分钟。
12. 在 TBS 中执行最后一次膜清洗 10 分钟。
13. μL Prime Luminol Enhancer Solution 与 500 μL Prime Peroxide Solution混合，制备 1 mL 的蛋白质印迹检测溶液（ECL TM Prime）。
14. 从膜中排出多余的洗涤缓冲液。
15. 在膜上加入 1 mL 的蛋白质印迹检测溶液，并在室温下孵育 5 分钟。
16. 从膜中排出多余的检测溶液。
17. 使用ChemiDoc TM MP 成像系统捕获化学发光信号（图 7-右面板）。

图 7。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 分析整个细菌培养物中的蛋白质表达。（左图）非诱导和 IPTG 诱导培养样品的迁移概况。当对凝胶进行 Stain Free 蛋白质检测（人工色素）时，诱导样品中没有明显的 scFv 2H7 -P18F3 (33.4 kDa )过表达。（右图）使用抗 His 抗体进行的蛋白质印迹分析表明，scFv 2H7 -P18F3 仅在 IPTG 诱导的样品中表达。 MW：分子量。 kDa ：千道尔顿。

B. scFv2H7-P18F3 的纯化

样品制备
1. 在室温下解冻细菌悬浮液。
2. 加入 40 mg溶菌酶 (1 mg/mL) ，涡旋混匀，将管子置于冰上。
3. 在 4°C 下用细菌再悬浮液填充 EmulsiFlex-C5 均质器。
4. 将 40 mL 的细菌悬浮液加载到均质器上，在 14,500 psi 的压力下进行细菌裂解，并收集裂解物。再重复两次裂解过程（总共三段）。
5. 将一片蛋白酶抑制剂溶解在 1 mL的 PBS 中。
6. 在裂解液中加入 1 mL 蛋白酶抑制剂。
7. ×离心细胞裂解物 g在 4 °C 下在合适的离心管中离心 20 分钟。
8. 将上清液收集在 50 mL 管中，并使用连接到真空泵的 50 mL 过滤装置以 0.22 过滤。
9. 让真空泵打开几分钟，直到过滤后的溶液完全脱气（液体中不再有可见气泡）。事实上，降低容器中的压力将导致液体中的气体溶解。然后可以将样品加到柱子上，而不会在柱子中形成气泡。

通过固定化金属亲和层析 (IMAC) 进行纯化
以下纯化程序（IMAC 和尺寸排阻层析）使用 ÄKTA 净化器 10（ Cytiva ）。该过程可以很容易地适应其他液相色谱系统。强烈建议在≤ 15 °C的温度下工作，以最大限度地减少蛋白水解。
1. 入口A1）和泵 B（入口 B1）与ddH 2 O。
2. 在不连接任何色谱柱的情况下运行系统（流量：1 mL/min），直到压力、电导率、OD 280nm和 OD 215nm值稳定。
3. 暂停系统并将HisTrap FF (1 mL) 柱连接到系统 [在总系统压力 (~0.1 MPa) + 柱压力限制 (0.5 MPa) 处设置压力警报]。
4. 的 ddH 2 O清洗色谱柱（流量：1 mL/min）。
5. 暂停系统并将入口 A1 放入装有 250 mL IMAC 运行缓冲液（参见配方）的瓶子中，将入口 B1 放入装有 250 mL IMAC 洗脱缓冲液（参见配方）的瓶子中。
6. 用 5 mL 的 IMAC 运行缓冲区（流量：1 mL/min；梯度：0% B）。
7. 暂停系统并将入口 A1 放入装有待处理样品的 50 mL 试管中。
此处，泵 A 用作采样泵。建议在较新的系统上使用独立的专用采样泵。
8. 通过 IMAC 运行缓冲区中的列运行示例，10 mM 咪唑（流量：1 mL/min；梯度：2% B）（图 8）。
9. 使用分数收集器保存流通。
10. 暂停系统并将入口 A1 放入装有 IMAC 运行缓冲液的瓶子中（事先用ddH 2 O清洁入口）。
11. 用 15 mL 的 IMAC 运行缓冲液、40 mM 咪唑（流量：1 mL/min；梯度：8% B）清洗柱子（图 8）。在纯化新型 BMFP 时，我们建议在大规模纯化之前进行筛选运行，以确定在洗涤步骤中使用的 B 的最佳百分比（感兴趣的蛋白质不应从柱中洗脱）。
12. 使用收集器保存洗涤分数。
13. 使用 5–7 mL 的 IMAC 运行缓冲液、250 mM 咪唑（流量：1 mL/min；梯度：50% B）洗脱柱结合材料（图 8）。
14. 收集洗脱的分数。
柱子可以按照制造商的说明进行清洁/储存，并至少重复三次用于纯化相同的重组蛋白。
15. 使用离心浓缩器（截止值：10 kDa ）将洗脱分数浓缩至 500 μL 。
16. 通过轻轻上下移液将浓缩样品均质化，并将其转移到预冷的 1.5 mL 安全锁 Eppendorf 管中。现在可以通过尺寸排阻色谱进一步纯化样品。强烈建议立即进行体积排阻层析，以尽量减少蛋白质在咪唑缓冲液中的停留时间。

图 8。固定化金属亲和层析 (IMAC) 产生的洗脱曲线。运行缓冲液中咪唑浓度的调整是通过混合泵 A 和 B 的溶液进行的。OD：光密度； AU：任意单位； E：洗脱。

通过尺寸排阻色谱法（凝胶过滤）纯化
1. PBS (pH 7.2)灌注泵 A（入口 A1）。
2. 在不连接任何色谱柱的情况下运行系统（流量：0.7 mL/min），直到压力、电导率、OD 280nm和 OD 215nm值稳定。
3. 暂停系统并将Superdex 200 增加 10/300 GL 柱连接到系统 [在总系统压力 (~0.1 MPa) + 柱压力限制 (3 MPa) 处设置压力警报]。
4. 用 PBS 平衡柱子（流量：0.7 mL/min）。
5. μL的待处理样品加载样品环。不要暂停系统。
6. 280nm处监测蛋白质洗脱并收集与目标峰对应的分数（洗脱体积在 14 和 16.5 mL 之间）（图 9）。
然后按照制造商的说明清洁/储存色谱柱。
7. 检查蛋白质浓度。
当使用OD 280nm的测量来估计蛋白质浓度时，可以使用 ProtParam 工具（Expasy ， Swiss Bioinformatics Resource Portal ； https : // web.expasy.org/protparam/ ）。然后可以使用以下公式计算蛋白质浓度：[蛋白质]=OD 280nm / ( ε.L )，其中 L 是光穿过溶液的距离（通常为 1）。
8. 使用离心浓缩器（截止值：10 kDa ）将洗脱部分浓缩至所需的最终浓度（在浓缩过程中定期检查蛋白质浓度）。
9. 将浓缩样品均质化，将其转移到预冷的 1.5 mL 安全锁 Eppendorf 管中，并在液氮中快速冷冻。然后可以将蛋白质储存在-80°C。
经过这种两步纯化过程后，通常获得的蛋白质产量为每升细菌培养物 0.7-1 毫克。蛋白质身份和纯化质量也可以通过 SDS-PAGE 进行评估，如本协议先前所述（图 10）。

图 9. 体积排阻层析纯化的洗脱曲线。红色条划定了感兴趣的峰值。为了评估纯化的质量，100 μL的洗脱部分含有将scFv 2H7 -P18F3 重新注入Superdex柱（分析样品）。 OD：光密度； AU：任意单位； E：洗脱。

2H7 -P18F3 的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE) 分析。（左图）从尺寸排阻色谱法中洗脱的感兴趣部分的迁移曲线揭示了 25 至 37 kDa之间的主带，其中可见污染物的数量非常有限。对凝胶进行 Stain Free 蛋白质检测（人造色素）。（右图）使用抗 His 抗体进行的蛋白质印迹分析证实了纯化蛋白的身份。 MW：分子量； kDa ：千道尔顿。

食谱

1. LB 培养基 (1 × )
请使用LB 粉末。 LB 培养基也可以按照以下配方配制：1% 胰蛋白胨、0.5% 酵母提取物和 1% NaCl。调节至 pH 7.0 并通过高压灭菌法灭菌。在室温下储存。

2. SOC 培养基 (1×)
最好使用具有分解代谢物抑制 (SOC) 培养基的超优肉汤。 SOC 培养基也可以根据以下配方制备：2% 胰蛋白胨、0.5% 酵母提取物、10 mM NaCl、2.5 mM KCl 、10 mM MgCl 2 、10 mM MgSO 4和20 mM 葡萄糖。调节至 pH 7.0 并通过高压灭菌法灭菌。在室温下储存。

3. 卡那霉素原液 (50 mg/mL)
对于 1 mL 的 10 个等分试样，称取 500 mg 硫酸卡那霉素粉末并溶解在 10 mL 的 ddH 2 O 中。使用注射器过滤器（0.2 μm孔径）过滤灭菌。在十个 1.5 mL 安全锁 Eppendorf 管中分配 1 mL，并将等分试样冷冻在 -20 °C。

4. 50%甘油溶液
对于 100 mL，将 50 mL 无菌甘油与 50 mL 无菌 ddH 2 0 混合。在室温下储存。

5. 细菌重悬液/IMAC电泳缓冲液
50 mM Tris 和 500 毫米氯化钠。调整至 pH 值 7.2 * 。在室温下储存。

6. IMAC 洗脱缓冲液
50 mM Tris、500 mM NaCl 和 500 mM 咪唑。调整至 pH 值 7.2 * 。以 0.2 μ m过滤并脱气溶液。在室温下储存。
*注意：溶液的 pH 值应至少比目标蛋白质的理论等电点 ( pI ) 低或高 1 个 pH 单位，以最大限度地减少纯化过程中的蛋白质聚集。可以使用ProtParam工具（ Expasy ，瑞士生物信息学资源门户； https://web.expasy.org/protparam/ ）从蛋白质氨基酸序列计算理论pI 。 BMFP scFv 2H7 -P18F3 的理论pI为 9.23。

7. Tris 缓冲液 (TBS)
50 mM Tris-Cl 和 150 mM NaCl。调节至 pH 值 7.6。在室温下储存。

8. Tris 缓冲盐水 (TBST)
50 mM Tris-Cl 和 150 mM NaCl。 0.5% 吐温 20。调节至 pH 7.6。在室温下储存。

9. Western blot封闭液（TBS-5%牛奶）
每 100 mL 补充 5 g TBS 低脂牛奶。以 0.2 μ m过滤。

10. Western blot抗体稀释液（TBST-5%牛奶）
TBST 添加了 5 g/100 mL 低脂牛奶。使用注射器过滤器（0.2 μm孔径）进行过滤。

11. 磷酸盐缓冲液 (PBS)
2.7 mM KCl 、138 mM NaCl、1.5 mM KH 2 PO 4和 8 mM Na 2 HPO 4 。调节至 pH 值 7.2。以 0.2 μ m过滤。在室温下储存。

致谢

这项工作得到了法国巴黎SATT IDF- Innov （BG 和 AC）的支持； Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM)，法国（BG、JLT 和 AC）； Institut National de la Transfusion Sanguine (INTS)，法国巴黎（至 BG 和 AC）。

利益争夺

BG 和 AC 是与该协议相关的专利申请的发明人，该申请由法国国家输血研究所、法国国家科学研究中心(CNRS)、巴黎大学Inserm （现为巴黎西泰大学）提交（编号 WO2017103020A1，提交日期25 2015 年 12 月，2017 年 6 月 22 日发布）。作者声明他们没有其他竞争利益。

参考

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Lobstein, J.、Emrich, CA、Jeans, C.、Faulkner, M.、Riggs, P. 和 Berkmen, M.（2012 年）。 SHuffle，一种新型大肠杆菌大肠杆菌蛋白表达菌株能够在其细胞质中正确折叠二硫键结合的蛋白。微生物细胞事实11：56。
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