材料和试剂

1. 蛋白 G Dynabeads （Life Technologies，目录号：10004D）
2. Protein A Dynabeads （Life Technologies，目录号：10002D）
3. GFP 重组兔单克隆抗体（ Thermo Fisher Scientific，目录号： G10362）
4. 兔多克隆抗 GFP（Abcam，目录号： ab290）
5. SP1 抗体（Santa Cruz，目录号： sc-17824）
6. 蛋白酶抑制剂鸡尾酒套装 III（ Calbiochem /Merck，目录号：539134-1SET）
7. RNase I（Life Technologies，目录号：AM2295）
8. Turbo DNase（Life Technologies，目录号：AM2238）
9. T4 PNK plus 10 × PNK 缓冲器（NEB，目录号：M0201L）
10. 小鼠 RNase 抑制剂 40 U/µL（NEB，目录号：M0314L）
11. T4 RNA 连接酶 1 高浓度 30 U/µL（NEB，目录号：M0437M）
12. 10 T4 RNA 连接酶反应缓冲液（NEB，目录号：B0216SVIAL）
13. FastAP 1 U/µL（Life Technologies，目录号：EF0652）
14. 蛋白酶 K 0.8 U/µL（NEB，目录号：P8107S）
15. MyONE硅烷珠（Life Technologies，目录号：37002D）
16. 预腺苷酸化适配器 L3-App IDT ( rAppAGATCGGAAGAGCGGTTCAG /ddC/)
17. ATP [γ- 32 P]（PerkinElmer，目录号：NEG502A250UC）
18. 4% - 12% NuPage凝胶（Life Technologies，目录号：NP0322BOX）
19. LDS-4 × 样品缓冲液（ NuPage加载缓冲液）（Life Technologies，目录号：NP0007）
20. 预染蛋白质大小标记（ Fermentas ，目录号：SM1811）
21. 硝酸纤维素膜protran BA85（VWR，目录号：732-4174）
22. 20×转移缓冲液（Life Technologies，目录号：NP0006-1）
23. 20× MOPS-SDS 运行缓冲液（Life Technologies，目录号：NP0001）
24. Whatman 滤纸（GE Healthcare，目录号：3030917）
25. 胶卷（富士，目录号：4741019236）
26. 苯酚/氯仿（Sigma，目录号：P3803）
27. 锁相凝胶重管（VWR，目录号：713-2536）
28. GlycoBlue （ Ambion ，目录号：9510）
29. 3 M 乙酸钠 pH 5.5（Life Technologies，目录号：AM9740）
30. 2× TBE-尿素上样缓冲液（Life Technologies，目录号：LC6876）
31. 6% TBE-尿素预制凝胶（Life Technologies，目录号：EC68652B）
32. 低分子量标记物（NEB，目录号：N3233L）
33. TBE 运行缓冲液（Life Technologies，目录号：LC6675）
34. SYBR green II（Life Technologies，目录号：S-7564）
35. 19 G 注射器针头（BD， Microlance ，目录号：300637）
36. 玻璃预过滤器（Whatman，目录号：1823010）
37. Costar SpinX色谱柱（Corning，目录号：8161）
38. CircLigase TM （ Lucigen ，目录号：CL4115K）
39. 10 环化酶缓冲液（ Lucigen ，目录号：CL4115K）
40. 甜菜碱溶液 5 M（Sigma，目录号：B0300-1VL）
41. Cut_oligo ' GTTCAGGATCCACGACGCTCTTCaaa '（HPLC 纯化，IDT）
42. BamHI （ Fermentas ，目录号：FD0055）
43. 快速消化缓冲液（ Fermentas ，目录号：FD0055）
44. 2× Phusion 高保真 PCR 预混液（NEB，目录号：M0531L）
45. NaOH（默克/西格玛，目录号：S8045-500G）
46. RLT 缓冲液（Qiagen，目录号：79216）
47. PBS（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
48. UltraPure TM琼脂糖（Invitrogen，目录号：16500-500）
49. QIAquick凝胶提取试剂盒（Qiagen，目录号：28706）
50. Tris（VWR，目录号：0826）
51. 氯化钠（NaCl）（VWR，目录号：27810.364）
52. 氯化镁（MgCl 2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：M2670）
53. 氯化钙（CaCl 2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：C1016）
54. 氯化钾（ KCl ）（ Thermo Fisher Scientific，目录号： AM9640G ）
55. 尿素（ Thermo Fisher Scientific，目录号：15505035 ）
56. 脱氧胆酸钠（ Thermo Fisher Scientific，目录号： 89904）
57. Tween-20（ Thermo Fisher Scientific，目录号：28320 ）
58. 十二烷基硫酸钠（SDS）（ Thermo Fisher Scientific，目录号：28364 ）
59. Triton X-100（ Thermo Fisher Scientific，目录号：28314 ）
60. 引物（从 IDT 纯化的 HPLC）：
P5_Solexa：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACATCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
P3_Solexa：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT
Rt1clip/5Phos/ NNAACCNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGgatcCTGAACCGC
Rt2clip/5Phos/ NNACAANNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGgatcCTGAACCGC
Rt3clip/5Phos/ NNATTGNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGgatcCTGAACCGC
Rt4clip/5Phos/ NNAGGTNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGgatcCTGAACCGC
Rt5clip/5Phos/ NNCGCCNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGgatcCTGAACCGC
Rt6clip/5Phos/ NNCCGGNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGgatcCTGAACCGC
Rt7clip/5Phos/ NNCTAANNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGgatcCTGAACCGC
Rt8clip/5Phos/ NNCATTNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGgatcCTGAACCGC
Rt9clip/5Phos/ NNGCCANNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGgatcCTGAACCGC
Rt10clip/5Phos/ NNGACCNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGgatcCTGAACCGC
Rt11clip/5Phos/ NNGGTTNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGgatcCTGAACCGC
Rt12clip/5Phos/ NNGTGGNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGgatcCTGAACCGC
Rt13clip/5Phos/ NNTCCGNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGgatcCTGAACCGC
Rt14clip/5Phos/ NNTGCCNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGgatcCTGAACCGC
Rt15clip/5Phos/ NNTATTNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGgatcCTGAACCGC
Rt16clip/5Phos/ NNTTAANNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGgatcCTGAACCGC

解决方案

1. 裂解缓冲液（见配方）
2. 高盐洗涤（见食谱）
3. PNK 缓冲液（参见配方）
4. PK 缓冲液（见配方）
5. PK 缓冲液 + 7 M 尿素（参见配方）
6. 1 × RNA 连接酶缓冲液（参见食谱）
7. 10 × RNA 连接酶缓冲液（参见食谱）
8. 1 × FastAP缓冲区（参见配方）

食谱

1. 裂解缓冲液
50 mM Tris-HCl，pH 7.4
100 毫米氯化钠
1% Igepal CA-630
0.1% 安全数据表
0.5%脱氧胆酸钠
当天：1/100 体积的蛋白酶抑制剂混合物 III，组织：1/1,000 体积的抗核糖核酸酶

2. 高盐洗
50 mM Tris-HCl，pH 7.4
1M 氯化钠
1 毫米乙二胺四乙酸
1% Igepal CA-630
0.1% 安全数据表
0.5%脱氧胆酸钠

3. PNK缓冲器
20 毫米 Tris-HCl，pH 值 7.4
10 毫米氯化镁2
0.2% 吐温-20

4. PK缓冲区
100 mM Tris-HCl，pH 7.4
50 毫米氯化钠
10 毫米乙二胺四乙酸

5. PK 缓冲液 + 7 M 尿素
100 mM Tris-HCl，pH 7.4
50 毫米氯化钠
10 毫米乙二胺四乙酸
7M尿素

6. 1 × RNA 连接酶缓冲液（无 DTT）
50 毫米 Tris-HCl pH 值 7.5
10 毫米氯化镁2

7. 10 × RNA 连接酶缓冲液（无 DTT）
500 毫米 Tris-HCl pH 7.5
100 毫米氯化镁2

8. 1 × FastAP缓冲区
10 毫米 Tris pH 7.5
5 毫米氯化镁2
100 毫米氯化钾
0.02% 海卫 X-100

设备

1. 冷冻微量离心机
2. Picofuge （ Thermo Fisher Scientific，目录号：75004061 ）
3. Stratalinker UV 交联剂 2400 Stratagene
4. 变性琼脂糖凝胶装置（Bio-Rad Laboratories）
5. 磁力架（ Thermo Fisher Scientific、Invitrogen）
6. 电泳室（Life Technologies ，目录号：EI0002）
7. 转移装置（Life Technologies，目录号：EI0002）
8. XCell II 印迹的海绵垫（Life Technologies，目录号：EI9052）
9. Thermoblock （ Thermo Fisher Scientific，Invitrogen）
10. 热混合器（ Boekel Scientific）
11. 超声仪（必能信数字超声仪）
12. 对β粒子敏感的盖革计数器（Ludlum 3测量仪盖革计数器辐射计44-9薄饼探头）
13. 3/8" 或 1/2" 有机玻璃台式防护罩（P 32防护罩）
14. 细胞刮刀
15. 液氮 (N 2 )
16. 保鲜膜
17. 蓝光透照仪
18. 紫外透照仪
19. X光片盒

软件

1. iMAP （ Jernej Ule 的实验室， https://imaps.goodwright.com/ ）
2. PureCLIP （Sabrina Krakau ， https://pureclip.readthedocs.io/en/latest/index.html ）
3. CTK包（张朝林实验室， https://zhanglab.c2b2.columbia.edu/index.php/CTK_Documentation ）

程序

使用 GFP 标记的蛋白质执行iCLIP -seq 实验的分步过程，并在各个步骤中进行了修改/改进。此程序（指定为 iCLIP-1.5）已使用经过验证的抗体应用于表位标记蛋白（即 GFP 或 FLAG 标记蛋白）和内源性蛋白（例如 SP1）。对于多西环素诱导表位标记的细胞系，在收获前 24 小时诱导蛋白质表达。由于此协议遵循原始iCLIP -seq 方法的工作流程(Huppertz et al., 2014)，因此使用此协议生成的数据可以接受标准iCLIP分析管道。
将所有缓冲液储存在 4°C，并在冰上执行该程序。在整个协议中，室温定义为 22°C。除非另有说明，否则整个协议中的所有洗涤步骤均以 900 μL 的体积执行。

A. 细胞的紫外交联

1. 在直径为 15 厘米的组织培养板中培养 HEK293 细胞（~80% 汇合度）（注 1）。
2. 取出介质并用冰冷的 1 清洗一次细胞 PBS。轻轻加入 6 mL 冰冷的 PBS，并将板放在适合Stratalinker内部的小冰盘上（注释 2）。
3. 在Stratalinker 2400（或等效的 UV-C 交联剂）中以 150 mJ /cm 2在 254 nm 下照射细胞一次（注释 3、4、5）。
4. 刮掉细胞并转移到 15 mL Falcon 管中。在 4 °C 下以 1,000 × g离心5 分钟，去除上清液，快速冷冻细胞以备后用。

B. 裂解、部分 RNA 消化和免疫沉淀

1. 制备蛋白 G Dynabeads以与抗 GFP 抗体偶联（注释 6）。通过轻轻上下移液几次，用900 μL的裂解缓冲液（添加蛋白酶抑制剂）清洗 100 μL的蛋白 G Dynabeads 。将管子放在磁性架上以分离珠子并去除上清液。重复洗涤步骤三次，最后一次洗涤后，将珠子重新悬浮在 100 μL的裂解缓冲液中。
2. 加入 10 μg抗 GFP 抗体。在室温（即 ~22 °C）下旋转管子 1 小时（注释 7）。
3. 当珠子旋转时，将细胞颗粒重新悬浮在 2.2 mL 的iCLIP裂解缓冲液中，辅以蛋白酶抑制剂（1:100 蛋白酶抑制剂鸡尾酒套装 III）。表达游离 FLAG/GFP 的细胞可用作阴性对照（注 9）。
4. 超声仪对样品进行超声处理：15 个循环，0.3秒开，0.7 秒关（三轮）（注释 10）。
5. 将 1 mL 的细胞裂解物转移到 1.5 mL Eppendorf 管中。
6. 在 PBS 中准备至少两种 RNase I 稀释液：1:50 稀释高 RNase I 和 1:250 稀释低 RNase I （注释 11、12、13）。
7. 将 20 μL 的 RNase I（来自稀释库存）和 2 μL 的 Turbo DNase 添加到 1 mL 的裂解物中，并将管子放在热混合器上。在 37°C 下将样品在热混合器（1,200 rpm）中摇动 5 分钟，然后立即放回冰上 5 分钟。
关键： RNase I 稀释的优化对于实验的成功极为重要（见注释 11）。在 37 °C 下孵育样品 5 分钟。
8. × g离心裂解物在微量离心机中在4 °C 下放置 30 分钟。将澄清的上清液转移到新的 1.5 mL Eppendorf 管中并置于冰上。
9. 将 20 μL 的澄清裂解物转移到 Eppendorf 管中作为输入。在干冰/液氮中快速冷冻并储存在 -80 °C 直至进一步使用。
10. 1 小时后，用 900 μL 的冰冷裂解缓冲液清洗抗体结合珠（来自步骤 B1）两次。
11. 最后一次洗涤后，将澄清的细胞裂解物添加到珠子中。在冷藏室 ( 4 °C) 中旋转 2 小时或过夜（注释 14）。
12. 将试管置于磁力架上分离磁珠，去除上清液，加入 900 µL 高盐缓冲液（注 15）。
13. 在寒冷的房间里旋转 5 分钟。重复三遍。
14. 用 PNK 缓冲液洗涤 3 次（无需在冷室中旋转）。添加 900 μL 的 PNK 缓冲液，然后轻轻上下移液。将试管放回磁力架上并弃去上清液（注释 16）。
15. 1洗一次 FastAP缓冲液（无需在冷藏室中旋转）。添加 900 µL 的1 FastAP缓冲液并轻轻上下移液。将管子放回磁性架上并丢弃上清液。

C. RNA 3 '末端去磷酸化、L3 接头连接和 5 '末端标记

为 3' 接头连接引物 RNA 片段，RNA 3' 末端去磷酸化分两步进行。这确保完全去除 RNase I 切割留下的 3'-环磷酸基团。

1. 将珠子重新悬浮在 100 μL 的以下混合物中，并在 37 ° C 下在热混合器（1,200 rpm）中摇动 15 分钟。
H 2 O 79微升
10 FastAP缓冲液 10 μL
核糖核酸酶抑制剂 2 μL
涡轮 DNase 1 μL
FastAP酶 8 μL
2. 当管子摇晃时，为每个样品准备 300 μL 的以下混合物。将混合物添加到每个试管中，并在摇动的同时再孵育 20 分钟。
H 2 O 230 µL
5 PNK (pH 值 6.5) 60 µL
0.1 M DTT 3 µL
涡轮 DNase 1 µL
RNase 抑制剂（小鼠） 2 µL
T4 PNK 酶 4 µL
3. 分离珠子并用 900 μL PNK 缓冲液清洗一次（无需在冷室中旋转）。
4. 用高盐缓冲液洗涤 3 次。在冷藏室中每次旋转 5 分钟。
5. 用 PNK 缓冲液洗涤 3 次（无需在冷室中旋转）。
6. 轻轻上下移液，用1 份连接酶缓冲液（无 DTT）清洗一次（注释 16）。
7. μL的结扎混合物中重新悬浮珠子。
H 2 O 12 µL
10连接酶缓冲液（无 DTT） 3 µL
100% 二甲基亚砜 0.6 µL
50% PEG 8000 9 µL
RNase 抑制剂（小鼠） 0.4 µL
T4 RNA 连接酶 1（高浓度 30 U/µL ） 2.5 µL
预腺苷酸化适配器 L3-App (20 μM ) 2.5 μL
8. 在室温下孵育 90 分钟。每 10-15 分钟轻弹一次管子。或者，可以在室温下在热混合器中摇动试管。
9. 添加 500 μL的 PNK 缓冲液并放置在磁架上以分离珠子。丢弃上清液。
10. 用高盐缓冲液洗涤 3 次。每次在冷室内旋转 5 分钟。
11. 用 PNK 缓冲液在冷室中不旋转地清洗三次。轻轻上下移液几次。将管子放回磁性架上并丢弃上清液。
12. 将珠子重新悬浮在 1 mL 的 PNK 缓冲液中。
13. 将 200 μL的珠子 (20%)（热珠）转移到新管中。将剩余的 800 μL珠子保留在冰上的 PNK 缓冲液中（冷珠）。从热珠中去除上清液并重新悬浮在 5' 末端标记混合物中。
T4 PNK 0.2 μL
32 P-γ-ATP 0.4 μL
10 × PNK 缓冲液 0.4 μL
H 2 O 3.0微升
注意：所有32 P 相关工作必须在指定的放射性同位素区域进行。处理放射性物质时，始终在防护罩后面工作。
14. 在 37°C 下孵育 5 分钟，同时在热混合器中以 1,200 rpm 的转速摇动。
15. 使用磁力架分离热珠，并将上清液作为放射性废物丢弃。
16. 将热珠重悬于 20 μL的 1 NuPage加载缓冲区（LDS 示例缓冲区）。可选：在 1 中添加还原剂 (DTT) 用于打断抗体链的NuPage加载缓冲液。
17. 从冷珠中去除上清液并将它们与热珠混合。
18. 从-80 °C 取出输入管。在冰上解冻并添加 LDS 样品加载缓冲液。
19. 在 70°C 下加热珠子和输入管 5 分钟。磁性分离珠子并将上清液转移到新管中。
20. 将样品 (20 μL ) 上样到 4%–12% NuPAGE Bis-Tris 凝胶上（注释 17 ）。使用 1× MOPS-SDS 电泳缓冲液（从 20× MOPS-SDS 电泳缓冲液稀释而来）。此外，加载 5 μL的预染色蛋白质大小标记。
1个 2个 3个 4个 5个 6个 7 8个
梯子输入梯子样本1 空的样品2 空的控制

21. 在 180 V 下运行凝胶 1 小时。对于高分子量蛋白质，运行凝胶 72 分钟。
22. 从凝胶底部切下含 ATP 的染料前端，并作为固体放射性废物丢弃。
23. 根据制造商的说明，使用纯硝酸纤维素膜和Whatman 滤纸设置转移。使用1× 转移缓冲液（从 20× 转移缓冲液中稀释）（注释 17）。
24. 一夜之间在 14 V 的冷藏室中转移。

D. RNA分离

1. 在冰冷的 PBS 中冲洗膜并用保鲜膜包裹。在 -80 °C 的暗室中将富士胶片曝光 30 分钟（注释 18、19、20）。
2. 使用放射自显影作为在膜上切割所需区域的掩码来分离 RNA-蛋白质复合物（图 1）。使用新的无菌刀片将每个样品的膜切成小块（~1-2 毫米切片），并将它们放入 Eppendorf 管中。将管子放在冰上，直到所有样品都被切除。

图 1. RNase 1 稀释和 CLIP 放射自显影的优化。 A. 在 RNase I 处理（1:25–1:250 稀释）后，对32 P 标记的 RBP-RNA 复合物进行了 CLIP 放射自显影。在高 RNase 1 条件下 (1:25)，放射性标记的 RNA 信号减弱。最佳 RNase 1 浓度（此处为 1:250）导致放射性标记的 RNA 作为涂片运行，高于 RBP 的预测大小（此处为~72 kDa ）。注意：通常在放射自显影照片上观察到抗体链。底部面板显示蛋白质印迹结果以指示 GFP 标记的诱饵蛋白的回收。右侧的黑条表示要切除的膜上区域。 B.部分 RNase I 消化（RNase I 稀释度，1:250）后输入 (INP) 和32 P 标记的免疫纯化 (IP) RBP-RNA 复合物的放射自显影。由于输入样品未进行放射性标记，因此未观察到放射性信号。红色框表示膜上被切除以提取 RNA 的区域。这里的RBP (SP1) 大小约为 82 kDa 。仅 GFP 样本显示为阴性对照。
注意：A 和 B 中显示的代表性放射自显影图用于两个不相关的 RBP。

3. 对于输入，将膜与 IP 样本平行切割，匹配切除区域的大小（图 1B）。
4. 将 20 μL的蛋白酶 K 添加到 180 μL的 PK 缓冲液中。将此蛋白酶 K 混合物添加到含有膜片的试管中。
5. 在 37°C 的热混合器中摇动管子 20 分钟。
6. 添加 200 μL的 PK-7M 尿素缓冲液，并在 37°C 下再摇动 20 分钟。为了制作 PK-7M 尿素缓冲液，首先将 420 毫克尿素溶解在 500 μL 的 PK 缓冲液中，然后通过缓慢添加 PK 缓冲液使最终体积达到 1 mL。
7. 短暂离心管，收集溶液，并将其与 400 µL 苯酚/氯仿一起添加到 2 mL Phase Lock Gel Heavy 管中。
8. 在热混合器中在 37°C 下摇动 5 分钟。
9. 通过在室温下在台式离心机中全速离心管 5 分钟来分离相。
10. 将水层转移到新管中（注意不要接触凝胶基质）。将上清液再次离心 1 分钟，然后转移到新管中。
11. 加入 0.75 μL 的GlycoBlue和 40 μL 的 3 M 醋酸钠（pH 值 5.5），混合，然后加入 1 mL 的冰冷 100% 乙醇（EtOH）。通过多次倒置管子进行混合，并在 -20 °C 下放置过夜。
12. 第二天，在 4°C 下以 16,100 x g离心样品20 分钟。
13. 取出上清液，用 900 μL 的冰冷 80% EtOH 清洗颗粒，再次离心 10 分钟。
14. 将沉淀重悬于 5 μL H 2 O 中并转移至 PCR 管中。保持在冰上（或-80 °C），直到输入样品准备好进行 cDNA 合成。

E. 输入适配器连接

在将 RNA 样本转化为 cDNA 之前，输入的 RNA 必须经过 L3 适配器连接。值得注意的是，对于某些剪接体亚基（例如 U2AF65 和 PUF60），与免疫沉淀蛋白-RNA 复合物的 L3 衔接子连接不会有效发生，这可能是由于空间位阻(Shao et al., 2014; Han et al., 2022)。在这种情况下，我们建议 IP 样本应与输入一起处理，以便在免疫沉淀和三个高盐缓冲液洗涤（步骤 B12）后，您可以直接进行放射性标记（步骤 C11）并省略去磷酸化和接头连接步骤如上文 C 部分所述。按照上面详述的方法从膜中分离 RNA，然后继续执行下面针对输入样本指出的步骤。
1. 对于 5 μL输入样本，添加：
H 2 O 15微升
10 FastAP缓冲液 2.5 μL
核糖核酸酶抑制剂 0.5 μL
FastAP酶 2.5 μL
2. 在 37°C 下孵育 15 分钟，同时以 1,200 rpm 的转速摇动。然后，添加 75 μL的以下主组合：
H 2 O 48 µL
5 PNK (pH 6.5) 20 µL
0.1M DTT 1 µL
RNase 抑制剂（小鼠） 1 µL
涡轮 DNase 1 µL
T4 PNK 酶 4 µL
3. 在 37°C 下再孵育 20 分钟，同时以 1,200 rpm 的转速摇动。
4. 使用磁性机架，每个样品分离 20 μL 的MyONE硅烷珠。
5. 用 900 µL RLT 缓冲液清洗一次。上下移液几次，然后取出缓冲液。
6. 在 300 μL 的 RLT 缓冲液中重新悬浮珠子。然后，将 RLT 缓冲液中的这些珠子添加到样品中。
7. 添加 10 μL 的 5 M NaCl 和 615 μL 的 100% EtOH。
8. 在室温下混合并旋转样品 15 分钟。
9. 15 分钟后，将管子放在磁力架上并去除上清液。
10. 在 1 mL 的 75% EtOH 中重新悬浮珠子，并将悬浮液移至新管中。
11. 让它静置 30 秒，然后放回磁力架上。
12. 去除液体并在 1 mL 的 75% EtOH 中再次悬浮。静置 30 秒。取出液体并再次重复该过程。
13. picofuge将管子旋转下来，然后将它们放回磁力架上。清除所有残留液体。
14. 让空气干燥 3 分钟。
15. 在 10 µL 的 H 2 O 中重新悬浮。让它在室温下静置 5 分钟。
16. 使用磁力架，分离珠子并在 10 µL H 2 O 中收集 RNA。将 5 µL 冷冻在 -80 °C 下作为备用输入样品（注释 21）。
17. 对于剩余的 5 µL 输入样本，添加：
H 2 O 1.2 µL
10 T4 RNA 连接酶反应缓冲液 2 µL
100% 二甲基亚砜 0.3 µL
50% PEG 8000 8 µL
RNase 抑制剂（鼠） 0.2 µL
T4 RNA 连接酶 1（高浓度 30 U/µL ） 1.3 µL
预腺苷酸化适配器 L3-App (20 μM ) 2 μL
18. 在室温下孵育 90 分钟，并以 1,200 rpm 的速度摇动。
19. 取 20 µL MyONE硅烷珠。
20. 用 900 μL 的 RLT 缓冲液清洗一次。
21. 在 61.6 μL 的 RLT 缓冲液中重新悬浮珠子。
22. 将 61.6 μL 的 RLT 缓冲液中的珠子添加到样品中。
23. 添加 61.6 μL 的 100% EtOH，并在室温下孵育 15 分钟，移液器尖端留在管中。每 3-5 分钟上下移液器以混合样品。
24. 15 分钟后，移液器在 1 mL 75% EtOH 中重新悬浮并移至新管中。让它在室温下静置 30 秒，然后取出液体。
25. 加入 1 mL 的 75% EtOH，移液器重新悬浮，30 秒后取出液体。
26. 用 1 mL 的 75% EtOH 再次洗涤。
27. picofuge短暂旋转样品并去除残留液体。
28. 在室温下风干样品 3 分钟。重悬于 5 µL 的 H 2 O。

F. cDNA的逆转录和凝胶提取

现在输入和 CLIP 样本已同步，从 -80°C 中取出 CLIP 样本并对所有样本执行逆转录 (RT)（图 2）。

iCLIP文库制备的示意图。使用条形码引物逆转录接头连接的 RNA 片段。显示了适配器和 RT 引物序列。在进行文库制备的 PCR 之前，cDNA 会经过大小选择、环化和线性化。
注意：RT 引物序列对应于Rt1clip，如材料和试剂部分所列。

1. 将 RNA (5 µL) 转移到 PCR 管中并添加以下试剂（注释 22）：
Rt#CLIP引物 (0.5 pmol / μL ) 1 μL
dNTP 混合物 (10 mM) 1 μL
2. 将试管放入 PCR 机中并使用以下加热程序：
a. 70 °C 5 分钟。
b. 然后，保持在 25°C，直到添加 RT 混合物。
c. 同时，准备 RT 组合：
H 2 O 7 µL
5第一链缓冲器 4 µL
0.1 M DTT 1 µL
RNase 抑制剂（小鼠） 0.5 µL
上标 III 0.5 µL
d. 将 13 μL 的 RT 混合物添加到每个管中，并使用以下热程序：
25 °C 5 分钟
42 °C 20 分钟
50 °C 40 分钟
80 °C 5 分钟
4 °C 保持
3. 加入 1.65 μL的 1 M NaOH，并在 98 °C 下孵育 20 分钟。
4. 加入 20 μL的 1 M HEPES–NaOH pH 7.3。这将消除强标记样品的放射性并防止 RNA 干扰后续反应（注释 23）。
5. 加入 350 μL的 TE 缓冲液、0.75 μL的GlycoBlue和 40 μL的 3 M 乙酸钠 (pH 5.5)，混合，然后加入 1 mL 冰冷的 100% EtOH。再次混合并在 -20 °C 下沉淀过夜。
6. 第二天，在 4°C 下以 16,100 x g离心15 分钟。去除上清液并用 500 μL的冰冷 80% EtOH 清洗颗粒。再次离心，去除上清液，将沉淀重悬于 6 μL H 2 O中。
7. 在 cDNA 中加入 6 μL的 2× TBE-尿素加载缓冲液，并在加载前立即将样品加热至 80°C 5 分钟。此外，在加载凝胶时，在每个样品之间留一条空道以避免交叉污染。
8. 根据制造商的说明，在 1 TBE 运行缓冲液中使用 6% TBE-尿素凝胶设置凝胶运行装置。在加载样品之前，请务必使用 P1000 移液器吸头从孔中冲洗掉尿素。
9. 在 180 V 下运行 6% TBE-尿素凝胶 40 分钟，直到下方（深蓝色）染料接近底部（图 3，注释 24）。

图 3. cDNA 的凝胶纯化和大小选择。 6% TBE-尿素凝胶电泳指导iCLIP cDNA 产物切除的卡通插图。当凝胶在 180 V 下运行 40 分钟时，cDNA 和两种染料（指示）的迁移模式具有高度可重复性（确保记下在使用您的凝胶时获得指示的条带迁移模式所需的时间）在初始实验中拥有自己的动力包）。凝胶切片被切除以纯化对应于高 (H)、中 (M) 和低 (L) 分子大小 cDNA 分数的 cDNA。这个数字是在Konig等人之后制作的。 (2011)。

10. 切断包含大小标记的凝胶通道。在 20 mL 的 TBE 缓冲液中孵育 10 分钟，并在轻轻摇动的同时添加 2 μL的 SYBR green II。用 TBE 清洗一次并通过紫外线透照可视化。使用 100% 比例打印结果，并使用打印输出作为遮罩来指导从凝胶的其余部分切除 cDNA 条带（注释 25）。
11. 与完整的 L3-App 序列一起，引物序列占cDNA 的52 nt 。用无菌剃刀切割三个条带，分别为 70-85 nt 、85-120 nt和 120-200 nt （图 3）（注释 26）。
12. 使用以下方法之一压碎凝胶块：
a. 将 400 μL的 TE 添加到每个凝胶块中，并用 1 mL 注射器柱塞将其压碎。
或者
b. 使用无菌 19G 针在底部穿孔，准备 0.5 mL 管。针可以用火焰加热以帮助穿孔。将凝胶碎片放入其中，然后将管子放入 2 mL 收集管中。在室温下全速离心 2 分钟。取下 0.5 mL 管，并在每个收集管中添加 400 μL的 TE。
13. 在 37°C 下孵育样品 1 小时，同时在热混合器中摇动。然后，放在干冰上 5 分钟，然后在 37°C 下再放回一小时，同时摇动。
14. 将两个 1 厘米的玻璃预过滤器放入 Costar SpinX柱中，并将每个样品的上清液的液体部分转移到这些柱中。
15. 在室温下在台式离心机中全速离心 1 分钟。收集溶液并将其与 400 μL的 RNA 苯酚/氯仿一起添加到 2 mL 锁相凝胶重管中。
16. 在热混合器中在 37°C 下摇动 5 分钟。
17. 通过在室温下在台式离心机中全速离心管 5 分钟来分离相。
18. 将水层转移到新管中（确保不要接触凝胶基质）。或者，将上清液再次离心 1 分钟，然后将液体转移到新管中。
19. 添加 1.5 μL 的GlycoBlue和 40 μL 的 3 M 醋酸钠（pH 值 5.5）。混合并添加 1 mL 的冰冷 100% EtOH。通过多次倒置管子进行混合，并在 -20 °C 下放置过夜。

G. cDNA环化

1. 第二天，在 4°C 下以 16,100 x g离心样品15 分钟。取出上清液，用 500 μL 的冰冷 80% EtOH 清洗一次。在 4 °C 下以 16,100 × g离心样品10 分钟并去除上清液。
2. μL的连接混合物中重新悬浮颗粒：
H 2 O 4.9微升
10 环环酶缓冲液 0.8 μL
50 毫米氯化锰2 0.4 μL
环环酶II 0.3 μL
甜菜碱(5 M) 1.6 μL
3. 转移到 PCR 管中并在 60°C 下孵育样品 2 小时（注释 27）。
4. 然后，向每个管中添加 30 μL的寡核苷酸退火混合物：
H 2 O 26微升
FAST 消化缓冲液 3 μL
10微米 Cut_oligo 1 μL
5. 使用以下程序退火寡核苷酸： 95°C 2 分钟，然后连续孵育 20 秒，从 95°C 开始，每次将温度降低 1°C，直到达到 25°C。然后，保持在 25°C。
6. 加入 2 μL BamHI并在 37 ° C下孵育 30 分钟；然后，在 80°C 下孵育 5 分钟（图 2）。
7. 将样品转移到 1.5 mL Eppendorf 管中。添加 350 μL TE、0.75 μL GlycoBlue和 40 μL 3 M 乙酸钠 (pH 5.5) 并混合。然后，加入 1 mL 的冰冷 100% EtOH。再次混合并在 -20 °C 下沉淀过夜。

H. 图书馆准备和凝胶提取

1. 第二天，在 4°C 下以 16,100 x g离心样品15 分钟。如上所述，取出上清液并用 500 μL的冰冷 80% EtOH 清洗。
2. 将样品重新悬浮在 23 μL的 H 2 O中。
3. 为确定文库制备所需的最少 PCR 循环数，我们建议使用 17 和 20 个循环至少进行两次初始 PCR 反应。还可以测试额外的循环次数。我们通常不会对需要超过 22 个循环的iCLIP文库进行测序（注释 28、29）。
为每个样品设置以下反应混合物：
cDNA 1微升
P3/P5 Solexa引物混合物（每个 10 μM ） 0.25 μL
2× Phusion HF PCR 预混液 5 μL
H 2 O 3.75微升
4. 在以下条件下运行 PCR：
98℃ 30 秒

98℃ 10秒
65℃ 30 秒

72℃ 30 秒
72℃ 3分钟
10℃ 抓住
5. 将 8 μL的 PCR 产物与 2 μL的 5 TBE 加载缓冲液混合，加载到 6% TBE 凝胶上，在 180 V 和 120 mA 下运行 25-30 分钟，并用 SYBR Gold 染色凝胶 15 分钟。
6. 对凝胶成像并估计文库制备所需的最少循环次数（注释 30）。如前所述(Huppertz et al., 2014)（图 4），PCR 过程中的过度扩增通常会导致以更大尺寸迁移的二级条带。我们将文库分成两半，每半使用 10 μL cDNA 模板。由于前半部分（和后半部分）使用了 2.5 倍以上的浓缩 cDNA，因此文库制备所需的循环数比初始测试 PCR 中使用的循环数少一个。

图 4. iCLIP文库的代表性 PCR 分析。左图： iCLIP的初步 PCR和输入样本以确定最佳循环数。 iCLIP样本（标记为 IP）使用两个不同的循环数（即 17 和 19）进行扩增，而输入 (INP) 使用 17 个循环进行扩增。虽然 IP 和输入的 19 和 17 个循环分别导致过度放大，从而导致二级产品尺寸更大，但选择 17 作为最佳循环数来为iCLIP样本（标记为 IP）准备最终文库。右图：凝胶图像显示iCLIP的最终文库和使用指定循环数制备的输入样品。注意：与初步 PCR 相比，最终 PCR 的模板 cDNA 浓度高 2.5 倍，因此iCLIP文库（标记为 IP）使用 16 个而不是 17 个循环制备。使用 15 个循环制备最终输入文库。 PCR 产物在 6% TBE 凝胶上分离并用 SYBR 金染色。

7. 准备以下反应混合物：
基因 10微升
P3/P5 Solexa引物混合物（每个 10 μM ） 1 μL
2× Phusion HF PCR 预混液 20 μL
H 2 O 9微升
8. 使用确定的最佳循环数运行相同的 PCR 程序。
9. 将 8 μL的 PCR 产物与 2 μL的 5 TBE 加载缓冲液混合，加载到 6% TBE 凝胶上，在 180 V 和 120 mA 下运行 25-30 分钟，染色，并使用 SYBR Gold 进行可视化（图 4）。
10. 如果文库出现扩增不足（即条带在凝胶上不清晰可见），请立即放回 PCR 机器进行两个或更多个循环并重新运行凝胶。
11. 使用适当的循环次数放大 cDNA 的后半部分，然后合并两半并继续进行琼脂糖凝胶提取步骤。
12. 在 TBE 中制备 2% 的琼脂糖凝胶。让它冷却下来，加入 1:10,000 SYBR Safe，混合并倒入凝胶。
13. 估计每个样品的体积，并相应地向每个样品中添加 6 种加载染料。
14. 将样品与低分子量 DNA 标记物一起加载到凝胶上。在样品之间留空一口井。
15. 在 90 V 下运行 1 小时（注释 31）。
16. 使用蓝光照明可视化，然后切割适当大小的凝胶切片（有关大小，请参阅库放大图像）并将它们放入 15 mL Falcon 管中。对每个样品使用新鲜的刀片。
17. 根据制造商的说明使用 Qiagen 凝胶提取套件进行凝胶提取，并进行以下修改：在室温下熔化凝胶块。在 20 μL的洗脱缓冲液中洗脱。为了提高产量，通过从第一次洗脱中取出流出物并将其添加回色谱柱来洗脱两次。
18. 量化iCLIP库，如前所述(Huppertz et al., 2014)。将高、中和低组分按 5:5:1 的比例混合用于测序（注释 32）。

iCLIP库进行排序。建议进行 50 个核苷酸的单端运行。

数据分析

由于该协议基本上遵循原始iCLIP -seq 方法的工作流程(Huppertz et al., 2014)，因此数据可以接受标准iCLIP分析管道。数据分析涉及多个步骤，包括如果多个样本在一个测序通道内运行，则进行多路复用、将读数映射到基因组、折叠随机条形码和去除 PCR 重复项，以及识别结合位点。简而言之，51 nt原始读数由三个随机位置、一个 4 nt多路复用条形码和另外两个随机位置组成，随后是 cDNA 序列，最初基于前 45 nt 进行去重。读取被解复用。删除随机位置、条形码和任何匹配 Illumina 适配器的 3' 碱基，并过滤掉短于 25 nt的读取。剩余的读数被修剪为 35 nt。这些步骤可以使用Trimmomatic执行 (Bolger et al., 2014).剩余的读数被映射到人类基因组/转录组。为了防止来自重复区域的读取错误分配，我们通常从进一步分析中删除映射质量 <3 的任何读取。可以使用几个免费提供的管道（例如， PureCLIP 、CTK 和iMAP ） (Krakau et al., 2017; Shah et al., 2017; Kuret et al., 2022)。此外，MEME 包可用于识别丰富的序列图案(Bailey et al., 2015)。

协议验证

在文库制备过程中扩增 cDNA 所需的 PCR 循环次数会直接影响结果数据的质量（即，循环次数较多的文库包含较多的 PCR 重复）。所需的循环次数取决于几个因素，包括蛋白质丰度、抗体质量、IP 效率和实验程序的技术限制(Buchbender et al., 2020)。在最初的iCLIP方法中，生成文库通常需要(Huppertz et al., 2014)27 – 30 个循环。我们观察到，对于我们修订的 iCLIP-1.5 协议，cDNA 文库扩增所需的循环数通常在 16 到 20 个循环之间。此外，输入材料和丰富的 RBP，如 PTBP1 和 U2AF35，需要更少的 PCR 循环，从 14 到 16。
在最近的几篇出版物中，这个修订后的协议已被用于对许多 RBPs(Han et al., 2022; Nabeel-Shah et al., 2022; Song et al., 2022)执行iCLIP -seq，包括特征良好和研究相对较少的 RBPs 。在我们最近的研究中，我们使用修订后的方案对 SP1执行了(Song et al., 2022)iCLIP -seq 。 SP1 iCLIP需要 17 个 PCR 循环才能获得适合高通量测序的 DNA 浓度。去除 PCR 重复项后，我们每次重复获得超过 1800 万个唯一映射读数（图 5A） (Song et al., 2022)。在进行这些实验的同时，我们还使用原始协议执行了 SP1 iCLIP -seq 的一次复制 [数据未在 Song 等人中发表。 (2022)]。该iCLIP文库需要 28 个 PCR 循环才能获得足以进行高通量测序的 DNA 浓度。丢弃 PCR 重复项后，我们仅获得了约 160 万个唯一映射读数（图 5A）（数据未发表），表明文库复杂度低且 PCR 重复率高。因此，我们修订后的 iCLIP-1.5 协议代表了对原始iCLIP -seq 方法的实质性改进，包括增强的接头连接、SMI 的掺入和 cDNA 的改进环化。
iCLIP -seq 数据的分析，这些数据是使用此修订后的协议生成的，用于具有良好特征的 RBP、CPSF5 (CFIm25) (Song et al., 2022)。使用 CTK 包进行分析以识别交联诱导的截断位点(Shah et al., 2017)。我们发现 CPSF5 优先结合目标转录物的 3 ' UTR，与其已知的作为切割和聚腺苷酸化复合物亚基的功能一致。此外，我们将 UGUA 基序确定为CPSF5 交联位点周围(Martin et al., 2012)最富集的 4聚体，如先前研究中所报道的那样。这些结果表明，我们修改后的 iCLIP-1.5-seq 协议忠实地捕捉了 RBP 的已知 RNA 结合偏好。

图 5. iCLIP -seq 数据分析的示例结果。 A. SP1 iCLIP -seq 数据的唯一映射读取数比较，使用修订后的协议（此处报告）或原始协议生成。 Song 等人分别将 SP1 重复 1-3 的iCLIP- seq 数据报告为 SP1.S2、SP1.S3 和 SP1-E。 (2022) ( GSE165739)。 B.左图：标准化的元图配置文件显示了 CPSF5 沿 mRNA 转录本的信号。 iCLIP -seq 是使用 GFP 标记的 CPSF5 执行的，如 Song 等人所述。 (2022)。使用登录号 GSE165739 从 GEO 数据库获取原始iCLIP数据。使用 CTK 包 (FDR ≤ 0.01)识别交联诱导的截断位点。右图：在 CPSF5 iCLIP -seq中鉴定的顶级 RNA 结合基序。 MEME 软件用于从头发现基序。目标 RNA 序列中的U被T替换，用于 MEME 分析。根据随机分类的序列计算统计显着性。

笔记

1. 对于标准实验，约5-7百万个 HeLa 细胞或约1000 万个 HEK293 细胞就足够了。我们通常分两个独立的批次培养细胞来代表生物复制。
2. 确保托盘/盘子不接触紫外线灯泡或覆盖能量检测器。这会导致 UV 曝光读数错误。
3. mJ /cm 2 ）优化紫外线照射的长度。然而，增加紫外线剂量可能会因 RNA 受损而扭曲文库制备，并可能触发细胞中的 DNA 损伤反应通路。因此，在增加紫外线剂量时应小心。
4. 生长在单层中的细胞同样暴露在紫外线下，因此只需要一轮辐照即可均匀交联。
5. 对于悬浮细胞，将细胞离心，用 1×PBS（6 mL）洗涤 3 次，将细胞留在 1×PBS 中，然后转移到 100 mm 培养皿中。如所述辐照和收获细胞。
6. 尽管蛋白 A 和 G 在结构上相似，但它们对不同物种的 IgG 亚类具有不同的亲和力。例如，蛋白 A 对兔、猪、狗和猫 IgG 具有更大的亲和力，而蛋白 G 对小鼠和人 IgG 具有更大的亲和力。因此，RBP 特异性一抗的宿主物种应与所用Dynabeads的目标物种相匹配。 Protein A Dynabeads应用于兔抗体。
7. 所需抗体的数量和孵育时间取决于抗体质量和纯度。这应该在初步实验中进行优化。对于 GFP 标记的细胞系，我们通常使用Thermo Fisher Scientific的 GFP 重组兔单克隆抗体 (G10362) 或来自 Abcam 的兔多克隆抗 GFP (ab 290)。对于Song 等人报道的SP1 iCLIP -seq。（2022），我们用了 10 微克SP1 抗体 (Santa Cruz sc-17824)。
8. 应分别使用 Nanodrop 或 Bradford 测定法测定 RNA 或蛋白质浓度。将所有样品标准化为最低浓度。建议将 2 mg/mL 作为最佳蛋白质浓度。我们为每个样品每次纯化取 1 mL 细胞裂解物。因此，2.2 mL 的细胞裂解物通常足以进行两次iCLIP实验。
9. 我们根据需要采用多种控制，包括原始材料中不存在 RBP 的样本（例如敲除或敲除细胞）、未进行交联的控制以及在 IP 期间不使用抗体的控制。对于表位标记的蛋白质（例如 GFP 和 FLAG），应使用表达游离 FLAG/GFP 的细胞。应该注意的是，只有 FLAG/GFP 的细胞通常会产生iCLIP 复杂性极低的文库，以 PCR 重复为主，因此不适合下游计算分析。
10. 强烈建议对核蛋白进行超声处理。它剪切基因组 DNA 并有助于从染色质中释放蛋白质。将探头保持在底部上方约 0.5 厘米，避免接触管子侧面。在冰上重复超声处理（15 个循环，打开 0.3 秒，关闭 0.7 秒）三次。在两轮之间将管子放在冰上约 3 分钟。用 70% EtOH 清洗探头，然后在超声处理前和样品之间用 dH 2 O 清洗探头。
11. RNA 片段化的优化对于实验的成功极为重要。酶促 RNA 消化取决于样品中存在的细胞类型和 RNA 数量。每一批新的 RNase I 都应该进行最佳稀释度测试。用高 RNase I 浓度（1:5 或 1:50）处理会在 SDS-PAGE 上产生尖锐的条带，对应于蛋白质预测大小约5 kDa 。最佳 RNA 片段应介于 50 nt和 200 nt 之间。最佳 RNase I 稀释度应产生 RBP-RNA 复合物，其以扩散方式运行，比预测的 RBP 大小高~20-80 kDa 。在对给定的 RBP执行完整的iCLIP -seq 实验之前，必须在初始实验中确定最佳 RNase I 稀释度。对于初始实验，应省略去磷酸化和 L3 适配器连接步骤（另请参见下面的注释 16）。在高 RNase I 条件下出现多个尖锐条带通常表明强相互作用的非特异性限制性商业惯例的共同纯化。为防止非特异性 RBP 的共纯化，我们建议使用尿素变性进行双重免疫沉淀，如Huppertz等人所述。 (2014)。有关 RNase I 优化步骤的详细说明，请参阅Huppertz等人。 (2014)。
12. 尽管应为每个新的 RBP 确定最佳的 RNase I 稀释度，但根据我们的经验，1:250 的稀释度适用于 HEK293 中的大多数 RBP。对于仅 GFP、无 UV 和/或无抗体的对照样品，RNase I 稀释 1:250 就足够了，并且无需测试多种稀释度，因为这些对照不会产生任何明显的放射性信号。
13. iCLIP裂解缓冲液包含 SDS，可在长时间孵育后禁用 RNase I。此外， SUPERase•In RNase Inhibitor 可用于抑制 RNase I。
14. 根据我们的经验，4°C 的过夜 IP 不会导致任何明显的 RNA 降解。可选：细胞裂解物可以与 25 µL 蛋白 A/G Dynabeads在4 °C下预孵育2 小时，以减少背景结合。取 25 µL 蛋白 A/G Dynabeads ，用iCLIP裂解缓冲液清洗三次，并在4°C 下与澄清的裂解物（在采集输入样品之前）一起孵育 2 小时，并进行端到端旋转。 2 小时后，将管子放在磁性架上，并将上清液转移到新管中。继续从步骤 9 开始的过程。
15. 如果需要监测抗体耗尽效率，请在此步骤（流穿）收集 20 μL ，用于 IP 前后裂解物的蛋白质印迹比较。此外，可以从流出物而不是全细胞裂解物中获取输入。来自澄清的全细胞裂解物（推荐）的输入保留了目标 RBP-RNA 复合物，而流穿物特别耗尽了诱饵。
16. FastAP缓冲液清洗、RNA 3' 末端去磷酸化和 L3 适配器连接的步骤。用高盐和 PNK 缓冲液洗涤后直接进行放射性标记。此外，无紫外线和无抗体对照无需进行 RNA 3' 端去磷酸化和 L3 接头连接步骤，因为这些对照通常在文库制备步骤中失败。在极少数情况下，当我们能够成功准备用于对照的iCLIP文库时，测序数据几乎总是由 PCR 重复项主导。由于 DTT 会降低 IP 效率，因此它已从用于 IP 的 L3 适配器连接步骤的连接缓冲区中删除。
17. 诺维克斯_ NuPAGE凝胶对于iCLIP的成功非常重要。自己浇注的 SDS-PAGE 凝胶 ( Laemmli ) 在运行过程中会改变其 pH 值，可达到 pH ∼ 9.5 并导致 RNA 碱性水解。诺维克斯_ NuPAGE缓冲液系统在整个运行过程中将 pH 值保持在 7 左右。推荐使用MOPS NuPAGE电泳缓冲液。稀释 20× transfer buffer 时不要忘记加入甲醇。
18. 如果实验仅旨在优化 RNase I 条件，则还要执行蛋白质印迹以评估诱饵的恢复情况。
19. 根据 RBP 和 IP 效率，放射自显影可能需要不同的曝光时间。在 -80 °C 下暴露 30 分钟、1 小时，甚至过夜。尽管iCLIP缓冲液条件消除了物理蛋白质-蛋白质相互作用，但不需要的相互作用蛋白质可能会与您感兴趣的蛋白质共同纯化。如果在您的蛋白质-RNA 复合物上方观察到其他蛋白质-RNA 复合物的污染条带，则只切割但不包括这些条带。或者，IP 可以在变性尿素条件下进行，如Huppertz等人所述。 (2014)。我们不使用超过两周的32 [P]。如果即使在长时间暴露后也未观察到 +UV 样品中的放射性拖尾，这可能是由于 IP 失败、您的蛋白质与 RNA 的结合非常弱，或者细胞在交联步骤中未正确暴露在 UV 下。在这种情况下，我们不建议继续进行图书馆准备实验。
20. 当比较不同的 RNase I 条件时，放射性标记带的大小必须改变。在高 RNase 条件下，与低 RNase 相比，放射性拖尾会减少，证实条带对应于蛋白质-RNA 复合物。此外，高 RNase 条件有助于确定免疫沉淀 RBP 的大小，因为 RBP 将与短 RNA 结合，因此将作为较不扩散的条带迁移，比预期的蛋白质分子量高~ 5 kDa 。在低 RNase 条件下，放射性带应该变得更加分散。在此基础上，使用以下指南进行 RNA 分离：70 nt RNA的平均分子量为∼ 20 kDa 。要分离大小在 40 到 300 nt之间的各种 RNA （包括衔接子），我们建议切割比蛋白质预期分子量高~ 15-80 kDa的宽条带。有关详细信息，请参阅Huppertz 等。 (2014)。注意：在极低 RNase 条件下（例如 1:1,200），RBP-RNA 复合物可能不会进入孔中。对照样品不应显示任何条带。
21. 剩余的 5 µL 可以在以后使用，以防输入的 cDNA 库无法放大。当使用针对内源性蛋白质的抗体时，相同的输入可用于相似分子量的 RBP。
22. iCLIP引物带有条形码，如Huppertz报道等。 (2014)。使用不同的引物 (Rt1clip–Rt16clip) 进行控制和实验复制。由于引物包含不同的 4 nt条形码序列，因此可以对样本进行多路复用。不同的条形码还使我们能够在文库制备过程中控制样品之间的交叉污染。此外，也可以使用 Superscript III以外的 RT 聚合酶。例如， irCLIP使用 f TIGRT-III 逆转录酶（ Ingex ，#TGIRT50）。
23. 在此阶段最多可以对三个具有不同条形码的样本进行复用。或者，可以为每个样品单独制作 cDNA 文库，并在 PCR 后混合以进行测序。
24. 我们观察到凝胶运行时间会因使用的电源组而异。对于初始实验，重要的是要注意较低（深蓝色）染料几乎到达底部所需的时间。至少在最初的实验中，建议包括 DNA 大小标记。
25. 如果您不使用 DNA 大小标记，则不需要此步骤。
26. 我们建议避免切割高于 200 nt或低于 70 nt 的凝胶切片。低于 70 的 cDNA 片段通常太短而无法准确映射到基因组。太长的 cDNA 片段不适合获得所需的分辨率。如果与 miRNA 或其他短 RNA 的结合不感兴趣，则没有必要分离低波段。
27. 我们增加了孵育时间并在反应混合物中加入了甜菜碱。已发现增加孵育时间和在反应混合物中添加终浓度为 1M 的甜菜碱可以改善难以连接的底物的环化。
28. 切勿将 cDNA 文库带到进行iCLIP RNA 或 cDNA 工作的区域，以避免样品交叉污染。文库制备应在指定区域进行，最好远离一般实验室工作场所。
29. 还可以测试额外的循环次数。重要的是要优化 PCR 循环数以避免过度放大。根据我们的经验，17-20 个循环产生的 cDNA 浓度足以用于大多数 RBP 的测序。强大的 RBP 和输入库通常需要较少的循环次数，通常在 14 到 16 之间。
30. cDNA 的大小将是产品的大小减去 P3/P5Solexa 引物和条形码 (128 nt ) 的组合长度。因此，在 cDNA 凝胶上切割 70-85 nt 的条带（使用 20-30 nt cDNA + 52 nt引物）预计会产生 145-160 nt的PCR产物。有关详细说明，请参阅Huppertz等人。 (2014)。
31. 较长的运行可能会提供更好的分辨率，但切割尺寸更大。我们在不同运行之间用 20% 漂白剂孵育凝胶电泳装置。在将其用于下一次运行之前，用水彻底冲洗以清洁设备。
32. 波段的比例可以调整。例如，如果 miRNA 很重要，则使用更多的较低波段。此外，还要考虑每个 PCR 样本的质量；如果 ½ PCR 反应之一被过度扩增，则使用更多处于正确扩增范围内的反应。

致谢

这项研究由加拿大卫生研究院基金会向 JFG 赠款 FDN-154338 资助。我们感谢 Benjamin J Blencowe博士和他的实验室成员，包括 Drs。 Thomas Gonatopoulos-Pournatzis 、Ulrich Braunschweig、Andrew Best 和 Esha Sharma 进行了有益的讨论和技术建议。我们还感谢 Greenblatt 实验室的所有成员，特别是Nujhat Ahmed 的有益讨论和她对手稿的批判性阅读，以及Shuye Pu 在iCLIP数据分析方面的帮助。 Song 等人使用了该协议。 (2022)。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

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