材料和试剂

材料

1. 细胞培养皿，直径 100 mm（NEST，目录号：704001）
2. 12 孔板（NEST，目录号：712011）
3. 1,000 μL 蓝色尖端（Biosharp，目录号：BS-1000-T）
4. 200 μL 黄色尖端（Biosharp，目录号：BS-200-T）
5. 10 μL 透明吸头（Biosharp，目录号：BS-10-T）
6. 1.5 mL 管（AXYGEN，目录号：AXYMCT150CS）
7. 0.6 mL管（AXYGEN，目录号： AXYMCT060C）
8. 医用 X 光胶片（FUJIFILM，目录号：SUPER RX-N）
9. 细胞刮刀（BIOLGIX，目录号：70-1180）

细胞

1. A549 细胞（美国典型培养物保藏中心）

抗体和质粒

1. 抗 Tyk2 抗体（Cell Signaling Technology，目录号：14193；1:1,000）
2. 抗 AHI1 抗体（Santa Cruz，目录号：sc-515382；1:500）
3. 抗微管蛋白抗体（ Proteintech ，目录号： 66031-1-Ig；1:3,000）
4. 山羊抗兔 IgG (H+L) HRP（ Bioworld ，目录号：BS13278；1:10,000）
5. 山羊抗小鼠 IgG（H+L）HRP（ Bioworld ，目录号：BS12478；1:10,000）
6. 快捷键质粒（RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体）
7. shAHI1质粒
shAHI1(#1)-前向：5'-CACCGCGGAGACATTATCCGAGTGTTCGAAAACACTCGGATAATGTCTCCG-3'
shAHI1(#1)-反向：5'-AAAACGGAGACATTATCCGAGTGTTTTCGAACACTCGGATAATGTCTCCGC-3'
shAHI1(#2)-向前：5'-CACCGCCATATTGGTCCGACAGTTTCGAAAAACTGTCGGACCAATATGGC-3'
shAHI1(#2)-反向：5'-AAAAGCCATATTGGTCCGACAGTTTTTCGAAACTGTCGGACCAATATGGC-3'

试剂

1. Dulbecco 改良的 Eagle 培养基（DMEM 基础培养基）（Gibco，目录号：C11995500BT）
2. 胎牛血清（FBS）（PAN，目录号：P30-3302）
3. 青霉素 - 链霉素（Biosharp，目录号：BL505A）
4. 0.25% 胰蛋白酶-EDTA（Biosharp，目录号：BL512A）
5. 环己酰亚胺（CHX）（Sigma，目录号： C7698-1G）
6. SuperSignal West Dura 扩展套件 (Thermo Scientific)
7. LongTrans （ UCallM ，目录号：TF07）
8. 用于细胞培养的二甲基亚砜 (DMSO)（ P an R eac A ppli C hem，目录号：67-68-5）
9. Bradford （S angon Biotech，目录号：C900164-0200）
10. 脱脂牛奶（ Biosharp ，目录号： BS102-500g)
11. BSA （ Solarbio ，目录号：A8020）
12. 无血清细胞冷冻培养基（NCM B io tech，目录号：C40100）
13. KCl（ S angon Biotech，目录号： 7447-40-7）
14. NaCl（ S angon Biotech，目录号：7647-14-5）
15. EDTA （ Solarbio ，目录号：9002-07-7）
16. NP40 （ Solarbio ，目录号：9016-45-9）
17. 抑制剂混合物（Sigma，目录号：58914000）
18. NaF （ S angon Biotech，目录号： 7681-49-4）
19. PMSF （ Solarbio ，目录号： 329-98-6)
20. Acr -Bis（30%）（ Biosharp ，目录号：BL513B）
21. TEMED （ Beyotime ，目录号：SY728）
22. APS （S angon Biotech，目录号：7727-54-0）
23. SDS（ Solarbio ，目录号：151-21-3）
24. 甘氨酸（ Solarbio ，目录号：56-40-6）
25. Tris碱基（ Solarbio ，目录号： 77-86-1）
26. 吐温 20 （S angon Biotech，目录号：9005-64-5）
27. β-巯基乙醇（Sigma，目录号： 60-24-2)
28. 异丙醇（Sangon，目录号：A507048-0500）
29. PageRuler 预染蛋白梯（ Thermo Fisher Scientific，目录号： 26616)
30. Na 3 VO 4 （ S angon Biotech，目录号：13721-39-6）
31. Na 2 HPO 4 （ Solarbio ，目录号： 7558-79-4）
32. KH 2 PO 4 （ Solarbio ，目录号：7778-77-0）
33. 溴酚蓝（ Solarbio ，目录号：34725-61-6）
34. 甘油（ Solarbio ，目录号：G8190-500 ml）
35. HCl（永华，目录号：210101204）
36. 10× PBS 缓冲液（见配方）
37. 裂解缓冲液 (1% NP40)（参见配方）
38. 8% 分离胶（见配方）
39. 5% 浓缩胶（见配方）
40. 10×运行缓冲液（见配方）
41. 10×转移缓冲液（参见配方）
42. 100 mM PMSF（参见配方）
43. 10% APS（见食谱）
44. 堆积混合（见食谱）
45. 3× 加载缓冲区（见食谱）
46. SDS 样品缓冲液（参见配方）
47. 1× PBST 缓冲液（参见配方）
48. 1% NP40 洗涤缓冲液（见配方）
49. 1 M Tris-HCl（见食谱）

设备

1. 37 °C，5% CO 2强制通风培养箱（Thermo Scientific，目录号：3111）
2. 电恒温水箱（上海景鸿，目录号：DK-8D）
3. 干式恒温器（AOSHENG，目录号：MK-10）
4. SDS-PAGE 凝胶浇铸装置（ Tanon ，目录号：VE-180）
5. 蛋白质电泳和印迹仪器（ Tanon ，目录号：EPS 300）
6. 离心机（Eppendorf，目录号：5425R）

软件

1. 微软幻灯片
2. 图片J
3. GraphPad棱镜

程序

CHX 可用于确定不同条件下蛋白质稳定性/半衰期的变化，例如敲除与野生型、过表达或敲低情况。该协议使用 AHI1 击倒细胞中 Tyk2 稳定性的示例。

A. 细胞培养和转染

°C、 5% CO 2条件下在补充有 10% FBS、100 单位/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素（完全培养基）的 DMEM 中培养。细胞采用0.25%胰蛋白酶-EDTA酶切技术培养并体外传代。

1. 从-80°C 或液氮中取出 A549 细胞，迅速放入 37°C 恒温水浴中约 2-3分钟，直至细胞完全解冻。
2. 将细胞放入 157× g离心3 分钟。
3. 去除无血清细胞冷冻培养基，加入1 mL完全培养基复苏细胞，将细胞转移至100 mm培养皿中。
4. 在 100 mm 培养皿中培养 A549 细胞，直至 90% 汇合。
5. 5 个细胞）的比例将细胞播种到 12 孔板的六个孔中。
6. 18-24小时后，观察细胞密度（约 80% -90 %），然后进行质粒（如shCtrl或 shAHI1）的转染。
7. 转染前去除培养基并加入 1 mL 新鲜的完全培养基。
8. 根据需要标记 1.5 mL 管，并在管中添加 50 μL 的 DMEM 基本介质。
9. 制备转染溶液 A：将 1 μg 质粒加入 DMEM 培养基中，并在 1.5 mL 管中轻轻混匀。
10. 准备转染溶液 B：将LongTrans （ DMEM：质粒：longtrans = 50 μL：1 μg：2 μL）添加到 DMEM 培养基中，并在 1.5 mL 管中轻轻混合。
11. 轻轻混合转染溶液 A 和 B，并在室温 (RT) 下放置 10 – 15 分钟。
12. 将混合物轻轻加入相应的培养基中并轻轻摇动。
13. 将盘子放在培养箱中大约 36-48小时（对于过表达质粒）或 48-72小时（对于击倒质粒）。
14. 在适当的时间点用 CHX (50 μg/mL) 处理细胞（B 部分）。

B. CHX治疗

注意：CHX 是一种剧毒化学品，如果吞咽会剧毒；请避免直接接触和释放到环境中。万一发生意外或感到不适，请立即就医。
1. 去除细胞培养基并更换为 1 mL完全培养基。
2. 将 500 μ g CHX 分配到 0.6 mL 管中。
3. 将 10 μL 的 DMSO 添加到管中并充分混合（CHX 的最终浓度应为 50 mg/mL）。 CHX 最好在新鲜时溶解以确保最大活性。
4. 将 1 μL 的 CHX 缓慢加入 1 mL 细胞培养基中，轻轻摇动板以混合均匀。同样，将 1 μL 的 DMSO 添加到相应的井中作为对照。
5. 收获细胞并提取细胞蛋白（C 部分）。

C. 提取细胞蛋白

1. 制备细胞裂解缓冲液：使用前将PMSF（1:100）加入1×NP-40裂解缓冲液中。
2. 将细胞放在冰上并吸出培养基。
3. 轻轻加入 1× PBS 彻底清洗并丢弃 PBS。重复两次。
4. 向细胞中加入裂解缓冲液（每孔100 μL ）。
5. 将细胞置于冰上 30 分钟。
6. 用细胞刮刀刮掉完全裂解的细胞。
7. 将细胞裂解物转移到 1.5 mL 管中。
8. 将 1.5 mL 管放入 12,000 x g的 4 °C 离心机中15 分钟。
9. 将上清液转移到新的 1.5 mL 管中以获得清除的裂解物（保存在-80 °C）；丢弃细胞碎片沉淀物。
10. 使用 Bradford 确定蛋白质浓度。
11. 变性 30 – 50 μg 蛋白质并向样品中添加SDS 样品缓冲液。
12. 在 96°C 的金属浴中将样品煮沸 10 分钟。
13. × g离心1 分钟。
14. 将样品用于蛋白质印迹或将其保存在 -20 °C 以备将来使用。

D. 蛋白质印迹分析蛋白质降解

1. 用 8% 分离胶和 5% 浓缩胶制备 8% SDS-PAGE 凝胶（凝胶浓度可根据检测蛋白的分子量调整至 8% – 12%）。
2. 用双蒸水 (dd H 2 O)将 10× 运行缓冲液稀释至 1× 。
3. 在垂直电泳槽中加入 1×电泳缓冲液。
4. 在流水下轻轻拉出SDS-PAGE凝胶的梳子，组装成垂直电泳室。
5. 用运行缓冲液填充腔室。
6. 将变性蛋白质样品加载到堆叠凝胶的通道中，并在两侧放置 2 μL 的 PageRuler 预染色蛋白质阶梯，以指示蛋白质的分子量。
7. 当样品在堆叠凝胶中时，使用恒定的 80 V 运行约 30 分钟，并在 110 V 的分辨率凝胶中运行约 90 分钟，以更好地分离蛋白质。
8. 将 PVDF 膜浸泡在无水甲醇中约 1 分钟以激活。
9. 准备 1× transfer buffer (10× transfer buffer:absolute 甲醇：双蒸水 = 1:1:8）。
10. 将凝胶按海绵、滤纸、凝胶、滤纸、海绵的顺序放在1 ×转移缓冲液中的活化 PVDF 膜上。
11. 使用恒定的 360 mA 将蛋白质转移到凝胶上 90 – 120 分钟，然后将电泳槽浸入冰水中。
12. 在 RT 处用 5% 脱脂牛奶阻断 PVDF 膜，轻轻摇动 30 分钟。
13. 按指定稀释度在 1% BSA 中稀释一抗。
14. 用稀释的初级抗体孵育膜，在 RT 下轻轻摇动 2 小时或 4°C 过夜。
15. × PBST 缓冲液中清洗膜10 分钟。重复三遍。
16. 以 1:10,000 稀释 5% 脱脂牛奶中的抗小鼠或抗兔二抗。
17. 用二抗孵育膜，在室温下轻轻摇动 1 小时。
18. × PBST 缓冲液中清洗膜10 分钟。重复三遍。
19. 在暗室中使用 X 射线胶片使用SuperSignal West Dura Extended 试剂盒可视化免疫反应条带。
20. 使用 Microsoft PowerPoint 将凝胶图像编辑为合适的大小。
21. 使用 ImageJ 计算条带的像素并计算蛋白质半衰期。
22. 使用 GraphPad Prism 制作折线图。

数据分析

shCtrl或 shAHI1转染的 A549 细胞中的蛋白质稳定性。

图 1. AHI1 敲低加速了 Tyk2 蛋白降解。 (A)用对照shRNA ( shCtrl ) 或针对 AHI1 (shAHI1 ) 质粒的shRNA转染A549 细胞。转染后 72 小时，用 DMSO（0 小时时间点）或 CHX（50 μg/mL，6 小时和 12 小时时间点）处理细胞。使用针对Tyk2、AHI1 或微管蛋白的抗体通过蛋白质印迹分析全细胞提取物。微管蛋白用作上样对照。 (B) Tyk2 和 Tubulin 的条纹图像被导入图像 J。测量所有条带的像素数，然后在 GraphPad Prism 软件中计算剩余的 Tyk2 百分比。来自张等人。 (2022)。

笔记

蛋白质的降解率彼此之间可能存在很大差异。因此，建议_ 使用 CHX确定蛋白质降解的时间过程提前追逐分析。一些内源性蛋白质降解非常快，因此CHX 的处理时间可调整为30-60分钟。有时需要设置少至五个时间点来检测蛋白质的半衰期。 CHX chase assay的其他实验数据也可以在我们课题组的其他论文中找到（冯等人，2018 年；元等人，2020）。

食谱

1. 10×PBS缓冲液
试剂量（克）
氯化钠 80.00
氯化钾 2.00
Na 2 HPO 4 14.20
KH 2 PO 4 2.70
2 O将 10× PBS 缓冲液稀释至 1× PBS。

2. 裂解缓冲液 (1% NP40)
试剂体积（毫升）
1% NP40 洗涤缓冲液（配方 13） 9.85
乙二胺四乙酸 (0.5 M) 0.05
Na 3 VO 4 (0.2 M) 0.05
氟化钠(0.5 M) 0.02
抑制剂鸡尾酒 0.02

3. 8%分离胶
试剂体积（毫升）
DDH 2 O 3.80
Tris-HCl (pH 8.0)（配方 14） 2.00
Acr -Bis (30%) 2.13
10% APS（配方 8） 0.08
泰美德 8.00×10 -3

4. 5% 堆叠贝尔
试剂体积（毫升）
堆叠混合（见配方 9） 3.00
10% APS（配方 8） 0.02
泰美德 5.00×10 -3

5. 10×电泳缓冲液
试剂量（克）
Tris碱基 30.00
甘氨酸 144.00
安全数据表 40.00
2 O将 10× running buffer 稀释成 1× running buffer
6. 10×转移缓冲液
试剂量（克）
Tris碱基 24.00
甘氨酸 142.00
2 O将 10× 转移缓冲液稀释为 1× 转移缓冲液

7. 100 毫米 PMSF
试剂数量
永磁同步光纤 0.696 克
异丙醇 40.00 毫升

8. 10% 平均分
试剂量（克）
APS 1.00克
DDH 2 O 10.00 毫升

9. 堆叠组合
试剂体积（毫升）
Acr -Bis (30%) 16.70
1 M Tris-HCl (pH 6.8) （配方 14） 12.50
20% 安全数据表 0.50
DDH 2 O 70.30

10. 3×加载缓冲区
试剂量（克）
1 M Tris-HCl (pH 6.8) （配方 14） 1.88 毫升
20% 安全数据表 3.00 毫升
甘油 3.00 毫升
溴酚蓝 6.00 × 10 -3克
DDH 2 O 2.20 毫升

11. SDS-样品缓冲液
试剂比率（％）
3× 上样缓冲液（配方 10） 85
β-巯基乙醇 15

12. 1× PBST 缓冲液
试剂体积（毫升）
1×PBS 500
吐温20 5个

13. 1% NP40 洗涤缓冲液
试剂体积（毫升）
5M 氯化钠 1.50
1 M Tris-HCl (pH 7.4) 2.50
NP40 0.50
DDH 2 O 45.50

14. 1 M Tris-HCl
试剂数量
三聚体 121.10 克
盐酸至 pH = 6.8、7.4 或 8.0
DDH 2 O 至 1 升

致谢

这项工作得到了江苏省高校自然科学研究项目 (20KJB310008) 、江苏省青年学者基金 (BK20200864) 和国家重点研发计划 (2018YFC1705500): 2018YFC1705505 的资助。该协议改编自之前发表在 Cell Research 上的工作（Zhang 等人。 , 2022) 。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

伦理

该研究不涉及人类受试者或动物工作。

参考

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