材料和试剂

1. 大豆种子 (William 82) ( Glycine max ) 或其他适合转化的大豆品种
2. 农杆菌属发根菌 K599化学感受态细胞（北京卓曼生物科技有限公司目录号： ZC1506）
3. pCAMBIA3301 或其他质粒 ( CAMBIA)
4. NcoI和BstEII （ Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）
5. 草铵膦( Basta® ) （上海艾克美生化有限公司，目录号：A607805g）
6. 卡那霉素溶液 (100 mg/L) ( Inalco Pharmaceuticals。目录号： 1758-9316）
7. 链霉素溶液 (100 mg/L)（ Inalco Pharmaceuticals。目录号：1758-9319）
8. GUS 染色液（ Biorigin Inc，目录号：BN20175）
9. 胰蛋白胨（OXOID LIMITED，目录号：LP0042B）
10. 酵母提取物（OXOID LIMITED，目录号：LP0021T）
11. NaCl（北京博美基因科技有限公司目录号：SH5001-01）
12. CaCl 2 ·2H 2 O（Sigma-Aldrich目录号：C7902-500G ）
13. 90% 丙酮（Sigma-Aldrich目录号：270725-500mL）
14. 甘油
15. 液体和固体 LB 培养基（1 L）（见食谱）
16. 0.1 M CaCl 2溶液（参见配方）

设备

1. 一次性塑料培养皿（北京瑞爱正特生物技术有限公司）
2. 医用一次性无菌注射器
3. 纱布
4. 一次性透明杯
5. 1 升培养瓶

程序

A. 大豆种子的制备

1. 选择完整且均匀的种子，去除任何有病、小或损坏的种子。用蘸水的纱布准备适量干净的培养皿，将选好的种子放在干净的培养皿中，将湿润的纱布铺在大豆种子上，盖上培养皿，避光孵育12小时。
2. 在将种子转移到营养土之前，用水预先润湿土壤，在每个盆中装满等量的预先润湿的湿土，并轻轻按压盆以压平土壤。接下来，将吸收的种子均匀地放在压实的土壤上。然后，根据需要用一层剩余的土壤轻轻覆盖每个花盆。使用喷雾瓶向每个盆喷洒适量的水。
3. 在 28°C 的温室中孵育 5-7天，直到长出 10 厘米的幼苗以进行下一步转化。

B. 发根农杆菌感受态细胞的产生

1. 将冷冻的 K599 化学感受态细胞储存在 -80 °C，然后将它们轻轻浸入紫外线照射的超洁净台上的无菌接种环中。在无抗菌板上画一条线，然后在 37°C 下孵育 16-20小时。
2. 取一个菌落并将其接种在 5 mL 的 LB 液体培养基中。在 28°C 下以 220 rpm 的速度振荡 12–16 小时。
3. 将 2 mL 的细菌溶液转移到 100 mL 的 LB 液体培养基中，并在 28°C 下以 220 rpm 的速度孵育，直到 OD 600 = 0.5。
4. 转移到无菌离心管中，以 3,000× g离心5 分钟。去除上清液。
5. 加入 10 mL 预冷的 0.1 M CaCl 2溶液，轻轻悬浮细胞，置于冰上 20 分钟。在 4 °C下以 3,000× g离心5 分钟并去除上清液。
6. 加入 4 mL 含有 15% 甘油的预冷 0.1 M CaCl 2溶液并轻轻悬浮。
7. 无菌Eppendorf 管中分配发根农杆菌感受态细胞，每管 200 μL 。在 -80 °C冷冻。

C. A. rhizogenes的制备

1. 卡那霉素抗性的 pCAMBIA3301 载体中，并带有来自Nco I的膦丝菌素选择标记和BstE II 酶切位点。在该载体中，lac 启动子驱动插入基因的表达。为了筛选转化的根，该载体包含一个启动子，该启动子编码增强的草铵膦抗性基因，该基因源自花椰菜花叶病毒基因CaMV控制，可提供强根表达。编码卡那霉素抗性的基因提供了抗生素选择。用冻融法将带有目的基因的融合表达载体质粒转移到A. rhizogenes K599中。
2. °C的 K599 感受态细胞在室温或冰水浴中放置片刻，等待其部分融化。刚解冻的细胞具有最高的转换效率。
3. μL感受态细胞加入1 μg质粒 DNA ，用手轻轻摇动试管底部，充分混合。然后，让它在冰上静置 5 分钟，液氮 5 分钟，37°C 水浴 5 分钟，冰浴 5 分钟，依次进行。
4. 添加 800 μL不含抗生素的 LB 液体培养基，并在 28°C 下以 200 rpm 孵育 2-3小时。
5. 在室温下以 3,000× g离心1 分钟。留下 100 μL 的上清液，将剩余的细菌重新悬浮到含有适当抗生素的 LB 板上，并在 28°C 的培养箱中倒置孵育 2-3 天。

D. 毛根的诱导

1. 准备无菌一次性注射器。用注射器刺穿大豆幼苗的子叶（5 毫米），用A.感染大豆幼苗（大约 7 天大）。含有植物表达载体的发根基因（图 1）。准备一个无菌的一次性注射器，在目的基因转化的平板上刮下菌落，用针尖收集。然后，将针穿过子叶下胚轴（图 2 和 3）以刺穿植物，确保针穿过下胚轴的中央部分。在幼苗上方倒置一个透明塑料杯（高约20 cm），以利于保湿，从而提高感染效率，同时在避光条件下孵育24小时。

图1. 载体包含用于细菌选择和双丙氨膦的卡那霉素抗性基因用于植物选择的抗性 ( BlpR ) 基因

图 2. 菌膏接种

图 3. 靠近子叶节的下胚轴刺入

然后，在正常条件下生长（25°C；16：8 小时光/暗循环）。剪去杯底，倒置在植株上固定大豆植株，用土盖满患部，浇足水。
2. 大约两周后，观察受感染位置是否长出新根（图 4）。在此期间要施足水肥，保证植株正常生长，及时清除病株和枯死植株。

图 4.感染部位长出新根

在二叶期对待选植株直接喷洒草铵膦。（不同的植物对Basta ®的敏感性不同，同一植物在不同生长阶段的敏感性不同。临界筛选浓度的确定标准：野生型植物几乎不能发芽，或发芽后不能存活的Basta ®浓度。最优Basta ®筛选浓度根据大豆种子黄化程度和死亡率确定。）
注：喷洒选定植物的一般工作浓度为0.001% ～ 0.002%。
或者，可以通过 GUS 染色检测报告基因的表达。具体流程如下：
a. 预处理：将根切成小块，置于1.5 mL离心管中，加入预冷的90%丙酮完全覆盖材料，室温处理20~30 min。这一步可以预先固定组织并去除一些叶绿素。
b. 染色：用蒸馏水冲洗材料，置于1.5 mL离心管中；加入适量准备好的GUS染色液，直至材料完全被覆盖，用铝箔纸包好，室温放置过夜。
c. 洗脱：用25%、50%、70%和95%乙醇梯度洗脱，每次在摇床上轻轻摇动20分钟。
d. 观察：白底蓝点为肉眼或显微镜下GUS表达位点。
3. 7天后，当毛根长约5-10厘米（足以支持植株正常生长）时，选择长势一致的植株，在毛根形成的伤口下方约1厘米处剪下胚轴。去除主根，保留新根，并将其移植到新盆中。

食谱

1. 液体和固体 LB 培养基（1 L）
胰蛋白胨 10 克
酵母提取物 5 克
氯化钠 10 克
溶于1L双蒸水；然后，通过在 120 °C 下高压灭菌 20 分钟进行灭菌

2. 0.1 M CaCl 2溶液
称取 0.28 克 CaCl 2 ·2H 2 O，溶于50 mL双蒸水，定容至100 mL，高压灭菌。

致谢

该协议改编自我们之前的工作( Zhang et al., 2022 ) 。本研究得到国家重点研发计划（2022YFD1201700）、海南崖州湾种子实验室（B21HJ0215）和中国农业科学院南帆专项（YBXM04）的资助。

利益争夺

不存在利益冲突或利益冲突。

参考

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