材料和试剂
1. 离心管（ 1、5、2、15 和 50 mL ）（ Sangon Biotech）
2. 无菌培养瓶（50 和 250 m L ）（ Sangon Biotech）
3. 移液器（10、20和200 μ L , 1 和 5 m L ) (Eppendorf)
4. 96 孔 ELISA 板（ Sangon Biotech，目录号： F605031 ）
5. 培养皿（ Sangon Biotech，目录号：F611003）
6. 47 毫米滤纸片（ Whatman ，目录号： 1822047）
7. 来自TIANgel Midi 纯化套件（TIANGEN，目录号： DP209）的旋转柱 CA2
8. 盐酸(HCl )
9. 硝酸 (HNO 3 )
10. 98% 硫酸( H 2 SO 4 )
11. Tris (C 4 H 11 NO 3 ) （生工生物，目录号： A100826）
12. 冰醋酸（CH 3 COOH）（ Sangon Biotech，目录号： A501931)
13. 氯化铵 (NH 4 Cl) （生工生物，目录号： A501569）
14. 七水硫酸镁 ( MgSO 4 ·7H 2 O ) （生工生物，目录号： A610329）
15. 二水氯化钙（ CaCl 2 ·2H 2 O ）（ Sangon Biotech，目录号： A610050）
16. 氢二钾磷酸盐（ K 2 HPO 4 ）（ Sangon Biotech，目录号： A610447）
17. 磷酸二氢钾（ KH 2 PO 4 ）（ Sangon Biotech，目录号： A600445）
18. EDTA 二钠盐（C 10 H 14 N 2 O 8 Na 2 ·2H 2 O）（ Sangon Biotech，目录号： A100105）
19. 七水硫酸锌（ Zn SO 4 ·7H 2 O ）（ Sangon Biotech，目录号： A602906）
20. 硫酸铁( II)（ FeSO 4 ·7H 2 O ）（ Sangon Biotech，目录号： A600461）
21. 硼酸（ H 3 BO 3 ）（ Sangon Biotech，目录号： A100588）
22. 四水氯化锰 (II)（ MnCl 2 ·4H 2 O ）（ Sangon Biotech，目录号： A500331）
23. 六水合氯化钴 ( CoCl 2 ·6H 2 O )（Sigma-Aldrich：目录号： 255599）
24. 硫酸铜 ( II) 五水合物 ( CuSO 4 ·5H 2 O ) （ Sangon Biotech，目录号： A600063）
25. 无水乙醇（生工生物，目录号： A500737）
26. 中性红（生工生物，目录号： A600895）
27. 1 M Tris-HCl (pH 7.5) （生工生物，目录号： A610283）
28. 碘化钠（ NaI ）（ Sangon Biotech，目录号： A610283）
29. 七钼酸铵四水合物 [(NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 ·4H 2 O] （ Sangon Biotech，目录号： A600067）
30. 孔雀石绿草酸盐（ Sangon Biotech，目录号： A620330）
31. TAP 培养基（见食谱）
32. 40× TAP 盐混合物（见食谱）
33. 磷酸盐溶液（50 μ g /m L ）（参见配方）
34. Hutner 的微量元素（参见食谱）
35. TAP固体培养基（参见食谱）
36. 1 M 硫酸 (H 2 SO 4 )（参见配方）
37. 2 M NaOH（见食谱）
38. 70% 乙醇（见食谱）
39. 0.1% 中性红溶液 (w/v)（见配方）
40. 1 M Tris-HCl (pH 7.5) 用 0.1% 中性红溶液 (w/v) 补充至 6% (v/v)（见配方）
41. 6 M NaI （见食谱）
42. 洗涤缓冲液（见配方）
43. 2 M 盐酸 (HCl)（参见食谱）
44. 磷酸盐 (Pi) 溶液 (10 μ g /m L )（参见配方）
45. 2.1 MH 2 SO 4中的28 mM 七钼酸铵（参见配方）
46. 0.35% 聚乙烯醇中的 0.76 mM 孔雀石绿（参见配方）

设备

1. 分光光度计（岛津制作所，型号：UVmini-1240）
2. 离心机（ Thermo Scientific，目录号：75002411）
3. 日立Himac CT15RE台式高速微量离心机
4. 日立CR21N高速冷冻离心机
5. Vortex（IKA，型号：IKA MS 3 basic）
6. 热循环仪（ Thermo Scientific，目录号：4484073）
7. 酶标仪（Tecan，型号：Infinite® F50酶标仪）
8. 真空泵（金腾，型号：GM-0.5B）
9. 分析天平（ Sangon Biotech，目录号：G001142）
10. 空气干燥箱（ Sangon Biotech，目录号：G003409）
11. 超净工作台（AIRTECH，目录号：SW-CJ-2F）
12. 通风柜（ALPHA、VAV 控制器）
13. 尼康数码相机 D7200

软件

1. Microsoft Excel （微软公司）
2. Microsoft PowerPoint （微软公司）
3. Prism GraphPad ( Dotmatic , Inc.)

程序

C. reinhardtii中测量polyP和总 P的过程。第一步是培养藻类细胞。接下来，收集适当数量的藻类细胞以提取P（ polyP或总P），然后从干燥的细胞中用盐酸或硝酸将polyP或总P消化成Pi。为了量化释放的 Pi，使用孔雀石绿比色法。

图1 。细胞培养和 P 测量的基本工作流程。 A.藻类细胞培养程序。 B 和 C分别显示了polyP和总 P 测量的程序。使用 Microsoft PowerPoint进行创作和创作。

A. 培养方法

Wang 等人的协议。 (2021)。
mL烧瓶中使用 20 mL TAP 培养基培养细胞。每周将体积为200 μ L的固定相细胞培养物转移到 20 m L 的新鲜培养基中。使用摇摆培养箱将培养物生长条件调整为在 25 °C 下以 150 rpm 的速度摇动，并用白色荧光灯（ 150 μmol光子 m -2 s -1 ）连续照射培养物本身。细胞密度约为1 × 10 7 细胞（转移后 3-5 天，晚期线性期）用于实验。
下面给出具体步骤：
1. 选择野生型 (CC-4533) 和突变体 ( Crptc1 ) 或其他所需用无菌牙签或移液器吸头从新鲜平板中分离菌株，并用 20 m L液体培养基（TAP培养基或适当的选择培养基）使用 50 m L烧瓶。在连续白光下以 150 rpm 和 25 °C 旋转 5-7天。该原代培养物生长至稳定期。
2. 将培养物接种到装有 20 m L TAP 的50 m L烧瓶中培养基，适当调整接种量，使接种液OD 750约为0.2 ～ 0.3。培养物将达到稳定期（~1 × 10 7 个细胞）在 5 – 7 天后再次进行。 OD 750应每 12 小时测量一次，以计算藻类细胞的数量。
3. 将 1 m L的次级藻类细胞转移到含有 100 m L TAP培养基的 250 m L烧瓶中并孵育 3-5天。
3次匀化后，不同藻株达到相同或相似的生长状态。
选修的：
4. 测定一次 OD 750 ，计算回归方程，绘制生长曲线。
注：生长期可通过测定细胞密度，绘制生长曲线来确定。

B. P的提取

本节包含两部分。第一个是polyP的纯化和降解，第二个是用硝酸消化藻类中的总 P。纯化和降解后，聚磷和总磷含量转化为释放的磷，可用孔雀石绿比色法测定。

1. polyP的纯化和降解
改编自 Werner 等人的协议。 (2005), Canadell等人。 (2016), 和 Wang 等人。 (2021)。
a. 使用分光光度计确定藻类的OD 750并记录下来。
b. 将 500 μ L藻类（记录准确重量）加入 1.5 m L离心管中。 8,000 ×离心后 g在室温下 5 分钟，通过移液器去除所有上清液并收获藻类细胞。
注：样品可直接纯化或保存于-20 °C。为了更准确地测量干重，使用真空泵在 47 mm 滤纸板上过滤5 m L藻类，然后放入干燥箱中几个小时（图 1）。 47 mm 滤纸片的重量应在样品加载前后使用分析天平测量。
c. 将 50 μ L的 1 M H 2 SO 4 （参见食谱）加入藻类中，通过移液器或涡旋混合以匀浆，然后将试管置于室温下 5 分钟。
d. 用 50 μ L的 2 M NaOH （参见配方）和 100 μ L的 1 M Tris-HCl (pH 7.5) 用 0.1% 中性红溶液补充至 6% (v/v)（见配方）。将试管轻轻颠倒混合四次。
polyP提取重现性的关键步骤。必须分别通过添加 2 M NaOH 或 1 M H 2 SO 4将太酸性（粉红色）或太碱性（黄色）的样品校正到适当的 pH（橙红色）。
e. 1,600 ×离心 g在 4 °C 下保持 10 分钟。
f. 用移液器将 150 μ L的上清液排放到一个新的 1.5 m L离心管中，其中含有 450 μ L的 6 M NaI （新鲜制备；参见食谱）。
g. 通过移液器吹打 3-5 次混合，然后转移至硅胶柱（来自TIANgel Midi 纯化试剂盒的离心柱 CA2 ）。以 12,000 ×离心柱 g室温 1 分钟。
h. 丢弃流出液并将色谱柱放回收集管中。将 400 μ L洗涤缓冲液（参见配方）加入柱中，并以 12,000 ×离心柱 g室温1 分钟。
i. 重复步骤 B1h。
j. 弃去流穿液，将色谱柱放回收集管中，12,000 ×离心 g在室温下 2 分钟以去除残留的洗涤缓冲液。
k. 将色谱柱转移到干净的 1.5 m L 离心管并打开盖子放置柱子 2-5 分钟以干燥膜。
l. 向膜中央加入50 μL ddH 2 O，室温孵育2 min ， 12,000 ×离心 g在室温下保持 2 分钟。
注：洗脱的polyP可直接降解；但是，应避免将其在室温下放置较长时间。如需长期保存，可保存在-20°C。
m. 吸取 10 μ L洗脱的polyP ，加入 10 μ L 2 M HCl（参见食谱），充分混合，然后离心几秒钟。
n. 在 95°C 下在热循环仪中孵育 30 分钟，然后转移到冰上。
o. 降解的polyP样品可以直接用孔雀石绿比色法测量或储存在-20°C。
2. 总磷的测定
a. 标记 2 m L离心管并称重。
b. 将 10–15 m L细胞收集到 15 m L离心管中，并以 2,070 ×离心 g室温 5 分钟。
c. 弃上清，ddH 2 O洗涤藻细胞，2,070 ×离心 g室温 5 分钟。
d. 重复步骤 B2c。
e. 丢弃上清液，用 1 m L 的ddH 2 O 悬浮藻类细胞，并将整个悬浮液转移到 2 m L离心管中。
f. 12,000 ×离心 g在室温下放置 5 分钟，然后小心吸取所有上清液以防藻类样品丢失。
g. 用藻类样品干燥管并称重。
h. 加入 0.4–1.0 mL 浓HNO 3并在 4 °C 下孵育过夜，直至溶液干净。
i. 2 O洗涤2 mL离心管内部，将所有洗涤水转移至50 mL离心管中，用ddH 2 O稀释至50 mL。
j. 然后可以使用孔雀石绿比色法对该样品进行 P 浓度测定分析。

C. 用孔雀石绿比色法定量 P

1. 标准曲线的绘制（表 1）

表 1.标准曲线
1个 2个 3个 4个 5个 6个 7
浓度微克/毫升 0 0.25 0.5 0.75 1个 1.5 2个
Pi 溶液 ( 10 μg /mL ) μL 0 2.5 5个 7.5 10 15 20
ddH 2 O微升 100 97.5 95 92.5 90后 85 80

根据表中Pi浓度梯度，依次加入这些物质：
a. 添加 Pi 溶液 (10 μg /mL) （参见食谱）和相应体积的 ddH 2 O。
b. 在 2.1 MH 2 SO 4中加入 86 μL的 28 mM 七钼酸铵（参见配方）。
c. 加入 64 μL 0.76 mM 孔雀石绿（参见食谱）。
d. 将 96 孔 ELISA 板在室温下放置 30 分钟，然后使用酶标仪测量 OD 595 。
注意：不要让反应进行超过 1 小时，因为它会导致高浓度 Pi 样品中出现小沉淀物和背景样品中的polyP降解，从而干扰正确的 Pi 测量。
e. 以 Pi 溶液体积 (10 μg /mL) 为 x 轴，OD 595为 y 轴绘制标准曲线。然后，可以根据标准曲线计算样品的P浓度。

图2 。标准曲线。 Pi 浓度作为 x 轴，OD 595作为 y 轴。使用 Microsoft Excel和Prism GraphPad绘制。

2. 样品中 P 的测定
a. 使用96 孔板进行polyP的反应和测量。为了量化释放的 Pi，在降解后向每个孔中添加 10 μL的polyP 、 90 μL的 ddH 2 O、86 μL的 28 mM 七钼酸铵溶解在 2.1 MH 2 SO 4中（参见食谱），以及 64 μL的 0.76 mM 孔雀石绿0.35% 聚乙烯醇（见食谱），按此顺序。通过轻轻移液混合井。
b. 空白对照由 100 μL ddH 2 O、86 μL 28 mM 七钼酸铵的2.1 MH 2 SO 4溶液和 64 μL 0.76 mM 孔雀石绿的 0.35% 聚乙烯醇溶液组成。
c. 将 96 孔板在室温下放置 30 分钟，然后使用酶标仪测量 OD 595 。

结果_

图3 。野生型菌株CC-4533和Crptc1突变体的PolyP和总P含量。（一）和 ( B )通过真空泵显示 5 mL 细胞的滤纸片。利用过滤前后滤纸的干重差计算藻细胞的重量。野生型菌株 CC-4533 和Crptc1突变体的多聚磷含量 (C) 和总磷含量 (D) 。 CrPTC1 是藻类中的液泡外排磷酸盐转运蛋白，并催化 Pi 转运出酸钙体。 Crptc1突变体过度积累总 P 和polyP （Wang 等人，2021）。数据显示为五个独立实验的平均值±标准差。照片是使用尼康数码相机 D7200 拍摄的。 C 和 D 是使用 Microsoft Excel 和 Prism GraphPad 绘制的。

食谱

1. TAP培养基
三聚体 2.42 克
40 × TAP盐混合物 25 毫升（配方 2）
磷酸盐溶液 (50 μg /mL) 0.4 毫升（配方 3）
哈特纳微量元素 1 mL（配方 4）
冰醋酸 1毫升
用 HCl 调节至 pH 7.0
添加 ddH 2 O 至 1 L 并在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟

2. 40× TAP 盐混合物
NH4Cl 15克
MgSO 4 ·7H 2 O 4克
CaCl 2 ·2H 2 O 2 克
将 ddH 2 O 添加到 1 L

3. 磷酸盐溶液 (50 μg /mL)
K 2 HPO 4 28.8 克
KH 2 PO 4 14.4 克
添加 ddH 2 O 至 100 mL

4. 哈特纳微量元素
EDTA 二钠盐 50 克
亚硫酸锌4 ·7H 2 O 22克
FeSO 4 ·7H 2 O 4.99克
H 3 B 3 11.4 克
MnCl 2 ·4H 2 O 5.06克
CoCl 2 ·6H 2 O 1.61克
CuSO 4 ·5H 2 O 1.57克
(NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 ·4H 2 O 1.10 g
将 ddH 2 O 添加到 1 L

5. TAP固体培养基
含 1% (w/v) 琼脂的 TAP 培养基（配方 1）
121 °C 高压灭菌 20 分钟

6. 1 M 硫酸 (H 2 SO 4 )
将 5.45 mL 的 98% 硫酸与 94.55 mL 的 ddH 2 O 混合并在室温下储存

7. 2M 氢氧化钠
将 8 g NaOH 与 80 mL ddH 2 O混合
添加 ddH 2 O 至 100 mL 并在室温下储存
8. 70% 乙醇
将 70 mL 无水乙醇与 30 mL ddH 2 O混合

9. 0.1% 中性红溶液 (w/v)
将 0.1 g 中性红与 100 mL 70% 乙醇（配方 8）混合并在室温下储存

10. 1 M Tris-HCl (pH 7.5) 用 0.1% 中性红溶液 (w/v) 补充至 6% (v/v)
将 12.1 克 Tris 与 70 mL ddH 2 O混合
加入 6 mL 0.1% 中性红溶液 (w/v)（配方 9）
用 HCl 调节 pH 值至 7.5
添加 ddH 2 O 至 100 mL 并在室温下储存

11. 6 M NaI
将 8.9934 g NaI与 ddH 2 O 混合至 10 mL
每次都必须新鲜配制溶液并避光保存

12. 洗涤缓冲液
10 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 7.5）、50% 乙醇、1 mM EDTA 和 100 mM NaCl
混合 5 mL 的1 M Tris-HCl (pH 7.5 )、250 mL 的 100% 乙醇、1 mL 的 0.5 M EDTA、10 mL 的 5 M NaCl 和 200 mL的ddH 2 O
用 HCl 调节 pH 值至 7.5
添加 ddH 2 O 至 500 mL 并在室温下储存

13. 2M 盐酸
将 16.67 mL 的 37% HCl 与 83.33 mL 的 ddH 2 O 混合，并在室温下储存

14. 磷酸盐 (Pi) 溶液 (10 μg /mL)
混合 50 μL磷酸盐溶液（50 μg /mL；配方 3）和 200 μL ddH 2 O

15. 28 mM 七钼酸铵溶于2.1 MH 2 SO 4
将 3.46 克四水合七钼酸铵与 80 mL ddH 2 O混合
添加 11.2 mL 的 98% H 2 SO 4
添加 ddH 2 O 至 100 mL 并在室温下储存

16. 0.35% 聚乙烯醇中的 0.76 mM 孔雀石绿
2 O中混合 350 毫克聚乙烯醇，并在磁力搅拌器上剧烈搅拌，直到所有聚乙烯醇完全溶解
添加35毫克孔雀石绿草酸盐
添加 ddH 2 O 至 100 mL 并在室温下储存

致谢

藻类培养协议改编自Wang 等人。 (2021)。 polyP纯化方案修改自沃纳等人。 (2005) 和Canadell等人。 (2016)。这项工作得到了国家自然科学基金 (32130096、32202593 和 32102478) 和国家重点研发计划 (2021YFF1000404) 的支持。 KY 得到了中国农业科学院创新计划的支持。 XJ 和 LW 得到了中国博士后科学基金的支持（2021M693447 到 XJ；2021M693449 和 2022T150707 到 LW）。

利益争夺

未声明利益冲突或竞争利益。

参考

Wang, L., Jia, X., Zhang, Y., Xu, L., Menand, B., Zhao, H., Zeng, H., Dolan, L., Zhu, Y. and Yi, K.（ 2021 年）。液泡聚磷酸盐积累所需的两个含有 SPX 结构域的蛋白质家族的丢失与绿色植物向磷酸盐储存的过渡相吻合。摩尔植物14(5)：838-846。
Aschar-Sobbi , R., Abramov, AY, Diao , C., Kargacin , ME, Kargacin , GJ, French, RJ 和 Pavlov, E. (2008)。使用基于 DAPI 的新方法对聚磷酸盐进行高灵敏度定量测量。 J荧光18(5)：859-866。
Christ, JJ, Willbold , S. 和 Blank, LM (2020)。生命科学中多磷酸盐的分析方法。肛门化学92(6)：4167-4176。
Werner, TP、 Amrhein , N. 和Freimoser , FM (2005)。定量酿酒酵母中无机聚磷酸盐 (iPoP) 的新方法显示 iPoP 含量对生长期的依赖性。 Arch微生物学184(2)：129-136。
Canadell , D.、Bru, S.、 Clotet , J. 和Ariño , J.（2016 年）。芽孢中聚磷酸盐的提取与定量_ 酿酒酵母。生物协议 6（14）：e1874。