材料和试剂
1. 0.22 μm 过滤器（PALL，目录号：4612）
2. 50 mL 离心管（ NEST ，目录号： 602001 ）
3. 0.45微米PVDF （微孔）
4. RPMI 1640 培养基（Gibco）
5. 胎牛血清 (FBS) (Gibco)
6. 1% 青霉素/链霉素 (Gibco )
7. 离心器皿（Hitachi，目录号：3 29607A）
8. Annexin Ⅴ-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒（Absin ，目录号：abs50001）
9. 细胞计数试剂盒 8（Dojindo，目录号：CK04）
10. FITC 缀合的小鼠抗人 CD107a（BioLegend，目录号：328606）
11. PBS（美伦生物，目录号：MA0015）
12. PE 缀合的小鼠抗人 CD56（BioLegend，目录号：304605）
13. PKH67 绿色荧光细胞连接器 Midi 套件（Sigma-Aldrich，目录号：MIDI67）
14. 二氧化硅纳米球混合物（NanoFCM，目录号：S16M-Exo）
15. DAPI（Sigma，目录号：D9592）
16. 4% 多聚甲醛（ChemCruz，目录号：sc281692）
17. 12% SDS-PAGE（TGX 免染色 FastCast 丙烯酰胺试剂盒，12%）（Bio-Rad，目录号：161-0185）
18. SDS-PAGE 上样缓冲液（5×）（ Beyotime，目录号：P0015L ）
19. SDS-PAGE 电泳缓冲粉（Servicebio，目录号：G2081-1L）
20. SDS-PAGE 转移缓冲粉（Servicebio，目录号：G2017）
21. 西方封闭缓冲液（Beyotime，目录号：P0023B-100ml）
22. 乙酸双氧铀（HSA Biotech）
23. RIPA （太阳生物）
24. PMSF （西格玛）
25. TEMED （Bio-Rad）
26. TBST (20×) (Solarbio)
27. 上样缓冲液 (5 × ) (Beyotime)
28. 10–180 kD 标记（苦艾酒）
29. Western 化学发光 HRP 底物（Millipore，目录号： WBKIS0100）
30. SKOV3细胞（中国典型培养物保藏中心，CCTCC）
31. OV-90细胞（中国典型培养物保藏中心，CCTCC）
32. 一抗和二抗（表 1）

表 1 。一抗和二抗
抗体物种主持人公司目录编号稀释比例
CD63 人类兔子艾博康 ab134045 1:1,000
CD81 人类兔子科学技术委员会 56039s 1:1,000
钙联接蛋白人类兔子生物龙 BD-PT0613 1:1,000
CD56 人类兔子科学技术委员会 99746s 1:1,000
穿孔素人类兔子生物龙 BD-PT5792 1:1,000
兔-HRP 兔子山羊苦艾酒 ABS20040 1:5,000

设备

1. 透射电子显微镜（ Hitachi，目录号：HT-7700）
2. 超速离心机（日立，目录号：CPN100N）
3. ChemiDoc XRS高灵敏度化学发光仪（Bio-Rad Laboratories）
4. 过滤器盒（100 kD）（Sartorius，目录号：VF05H4）
5. 流式细胞仪（Beckman Coulter Inc.，型号：FC500）
6. 荧光显微镜（Olympus BX51）
7. 纳流式细胞术 (NanoFCM)
8. P28S转子（日立）
9. 蠕动泵p（Millipore，型号： XX80EL005）
10. 高压灭菌器（ MEDNIF，型号： LS-B50L）
11. 紫外线照射(SJMAEA)
12. 离心机（Eppendorf）
13. 生物安全柜（Thermo Scientific）
14. PowerPac TM (Bio-Rad)

软件

1. 斐济：ImageJ 1.53a
2. GraphPad 棱镜 8
3. NanoFCM软件（NanoFCM Profession V1.0）
4. FlowJo 10

程序

A. NK细胞培养上清制备

1. 在辅以 5% FBS 和 1% 青霉素/链霉素的 RPMI 1640 培养基中维持 NK 细胞在体外扩增。
2. 在培养的第 14 天将 FBS 更改为无外显子 FBS，并继续培养两天。
注：无外泌体的胎牛血清是通过 100,000× 离心胎牛血清获得的 g 16 h ，然后收集上清液。
3. 调整细胞密度为1×10 9 个细胞/500 mL，收集细胞培养上清液进行预处理。
4. 将细胞培养上清液以 300× g离心 10 分钟去除细胞，然后将上清液转移到新的离心管中。
注意：第一步离心力应控制在350×g以下，以免损伤NK细胞。
5. 将上一步得到的上清液再次以2000 × g离心10分钟，去除细胞碎片，然后将上清液转移至TFF系统的样品杯中进行后续处理。
注意：可以通过增加样品杯的数量或向单个样品杯中多次添加液体来增加上清液的体积。

B. TFF 系统浓缩 NK 细胞培养上清液

注意：以下所有步骤均在 4°C 下执行；作为参考，我们在冷藏中执行了所有步骤。
1. 依次连接进样杯、进液管、蠕动泵、滤芯（100 kD）、出液管、废液管、废液杯，并在液体接口处安装压力指示器出口管以完成 TFF 系统的组装（Kim 等人，2021 年）。
注意：样品杯应提前高压灭菌，整个TFF系统在操作前30分钟进行紫外线照射灭菌。
2. 步骤A4 -A 5预处理后的细胞培养上清液加入样品杯中，启动蠕动泵，2.5bar压力浓缩至浓缩体积约13mL。
3. 将浓缩液转移到 50 mL 离心管中，并将 10 mL PBS 添加到样品杯中。
4. 将蠕动泵的压力降低到 1 巴。
5. 在 TFF 系统再循环大约五次后，关闭蠕动泵并将 PBS 转移到上述 50 mL 离心管中。
注意：应尽可能排出管道中的所有残留液体，以提高外泌体的回收率。

C. 使用超速离心法制备 NK-Exo

注意：以下所有步骤应尽可能在 4°C 下执行；生物安全柜中的步骤应在冰上进行。
1. 将浓缩液从步骤B5到装有超速离心机的离心管中， 4℃ 10,000× g离心 30 分钟；然后，通过 0.22 μm 过滤器过滤。
注意：离心管应提前30分钟进行紫外线照射，以下所有步骤均应在生物安全柜中无菌操作。
2. 上一步的液体在 4°C 下以 100,000× g离心 70 分钟。
3. 预冷PBS重新悬浮外泌体颗粒，并在 4 °C 下以 100,000× g再次离心70 分钟。
注意：悬浮液至少应占离心管容积的1/2，以免离心力过大损坏离心管。
4. 用 500 μL 的 PBS 去除并重新悬浮上清液。然后，立即使用或储存在 -80 °C。
注意： NK-Exo 应尽快使用或在 -80 °C 下储存长达三个月。

D. 通过纳米流式细胞术检测颗粒浓度、颗粒大小和表型

1. 用 200 nm PE 和 AF488 荧光共轭聚苯乙烯珠校准仪器的粒子浓度，并用二氧化硅纳米球鸡尾酒校准仪器的粒径。
2. 在最终检测期间将 NK-Exo 连续稀释到 2,000–12,000 个粒子/分钟的最佳记录范围，并记录在每次检测期间通过 1 分钟间隔的所有粒子。
笔记：
a. NK-Exo 应按 1:10、1:100 和 1:1,000 的比例稀释，直到其检测速率达到 2,000 – 12,000 个粒子/分钟。
b. 孵育应在黑暗条件下进行。
3. 然后，用 PBS 洗涤染色混合物，并在 4°C 下以 100,000× g离心70 分钟。
注意： PBS至少应占离心管体积的1/2，以免离心力过大损坏离心管。
4. 用 50 μL 的 PBS 重新悬浮 NK-Exo，并通过纳米流式细胞术进行测试。
5. 使用标准曲线，将流速和横向散射强度转换为 NanoFCM 软件中相应的浓度和大小。

E. 通过透射电子显微镜检测 NK-Exo

1. 重新悬浮从 NK 细胞上清液中纯化的外泌体（> 10 9 /mL）。
2. 获取 10 μL 样品并将其放在铜网格上。沉淀 1 分钟后，使用滤纸去除多余的液体。
3. 取10 μL醋酸双氧铀，加入铜网上沉淀1 min；使用滤纸去除多余的液体。
4. 在室温下干燥几分钟后，使用透射电子显微镜 (100 kV) 获得图像结果。

F. 通过蛋白质印迹分析检测 NK-Exo

1. 在 NK-Exo 中加入 150 μL 含有 1.5 μL 蛋白酶抑制剂 (PMSF) 的 RIPA。冰上静置5 分钟后，13,000× g离心20 分钟，收集上清液。
注意：这些步骤在 4 °C 下执行。
2. 上一步得到的上清液中加入5×loading buffer， 95℃加热10分钟。
3. 上一步的产品分开通过 12% SDS-PAGE并使用 10–180 kD 标记作为指示标尺。
根据感兴趣的蛋白质的分子量选择凝胶百分比。
4. 在 80 V 的运行缓冲液中运行凝胶约 30 分钟，然后将电压调整为 120 V 并运行 50 分钟，直到加载染料到达凝胶底部。
注意：运行时间可能因使用的设备或凝胶的类型和百分比而异。
5. 使用 PVDF 膜在转印缓冲液中以 300 mA 转印凝胶80 分钟。
6. 阻隔膜 Western 封闭缓冲液室温封闭 2 小时。
7. 用初级抗体（表 1）孵育膜过夜，并在 4°C 下摇动。
8. 1×TBST 洗膜 3 次，每次 10 分钟。
9. 用适当的二级抗体（表 1）孵育膜，并在室温下摇动 2 小时。
10. 1×TBST洗膜3次，每次10 min
11. 图像在化学发光仪下使用 Western 化学发光 HRP 底物显示。

对于表型分析，NK-Exo首先按照1×10 9颗粒/mL的浓度悬浮于50μL PBS中，与5μL PE-conjugated小鼠抗人CD56 （NK细胞的标志物）和FITC混合- 偶联小鼠抗人 CD107a （NK 细胞脱颗粒的标志物），并在 37°C 下孵育 30 分钟。

G. NK-Exo摄取

1. 使用 PKH67 绿色荧光细胞连接器 Midi 套件对 NK-Exo 进行染色，并将 NK-Exo 与稀释缓冲液（稀释剂 C）混合。
注意：不要使用涡旋剧烈混合；用移液器轻轻混匀。
2. 上一步的NK-Exo混合液加入预先配制好的2×PKH67染液中，轻轻混匀，孵育4分钟。
注意：必须将 NK-Exo 添加到染料溶液中（顺序不得更改），并且在孵育期间必须不时混合染料。
3. 添加等体积的 FBS 以停止染色 1 分钟。
4. g离心70 分钟，洗去残留染料。
注意：如果染色后的外泌体不立即使用，可在-80℃避光保存一周。
5. 在24孔板中培养SKOV3细胞，每孔5×10 4 个细胞，每孔加入20μg NK-Exo ， 37℃共培养6小时。
6. 孵育后，用 PBS 清洗细胞并固定在 4% 多聚甲醛中，并用 DAPI 染色细胞核。
注意：用 PBS 洗涤应足以避免残留染料影响实验结果。
7. 使用荧光显微镜成像，并使用 ImageJ 1.53a 软件量化 SKOV3 细胞对 NK-Exo 的吸收。

H. NK-Exo 的功能表征

1. 每孔1 × 10 4 个细胞的浓度添加到 96 孔板中。
2. 将浓度为 80 μg/mL 的 NK-Exo 添加到每个孔中，并在 37°C 下孵育 24 小时。
3. 在每个孔中加入 10 μL 的细胞计数试剂盒 8 (CCK8) 试剂，并在 37°C 下孵育 2 小时。
注意：对于此悬浮液体积，将 10 μL 的 CCK8 试剂添加到每个孔中。对于其他体积，添加相应体积的 CCK8。
4. 在 450 nm 处测量细胞活力。一式三份重复每个实验，并使用 GraphPad Prism 8 软件进行统计分析。
5. 使用以下公式计算细胞存活率：

存活率=（ OD实验-OD空白）/ （ OD对照-OD空白） × 100 %

6. 使用Annexin Ⅴ-FITC/PI Apoptosis Detection kit检测NK-Exo诱导肿瘤细胞凋亡的比例。
7. 预处理 SKOV3 和 A2780 卵巢癌细胞与 80 μg/mL 的 NK-Exo 作用 24 小时。
8. 用 1× PBS 洗涤细胞两次并重悬于 1× 结合缓冲液中。
9. 在黑暗中用 5 μL 的 Annexin Ⅴ-FITC 染色 10 分钟，然后在流式细胞术分析前用 5 μL的 PI 染色 5 分钟。
10. 使用流式细胞仪对凋亡细胞进行定量，并使用 FlowJo 10 进行分析。
数据分析

A. TFF系统拦截效率的量化

1. 通过纳流检测TFF系统滤液和制备的NK-Exo的粒径和浓度，评价外泌体在TFF系统中的拦截效率。
2. 记录每次检测期间通过 1 分钟间隔的所有粒子（表 2）。

表 2 。 TFF系统浓缩后超滤液和浓缩液中的颗粒分布比较。滤液中的颗粒小于 70 nm，而 NK-Exo 的粒径范围为 60 至 90 nm。通过比较两者的总颗粒数，可以得出截留效率为94.40%。
集中超滤液
尺寸（纳米）事件尺寸（纳米）事件
40 – 50 0 40 – 50 3个
50 – 60 577 50 – 60 177
60 – 70 1474 60 – 70 75
70 – 80 1205 70 – 80 17
80 – 90 661 80 – 90 5个
90 – 100 397 90 – 100 1个
100 – 150 592 100 – 150 3个
150 – 250 86 150 – 250 1个
全部的 4992 全部的 282

3. 通过 NanoFCM 软件转换和分析收集的数据以获得粒子浓度和粒子大小（图 1A–1B）。

图 1 。 NK 细胞外泌体 (NK-Exo) 的分离和纳流检测。通过纳流检测超滤液 (A) 和 NK-Exo (B) 的颗粒浓度和大小。

B. NK-Exo 的表征

1. 通过透射电子显微镜收集外泌体的形态学图像（图 2A）。它们显示出带有颗粒的典型碟形尺寸约为 80 nm，这与纳流结果一致。外显子表面标记 CD63、CD81 和 TSG101 的表达通过蛋白质印迹法鉴定（图 2B）。

图 2 。 NK 细胞来源的外泌体 (NK-Exo) 的表征。 (A) NK-Exo 的透射电子显微镜图像。比例尺：100 纳米。 (B) CD81 (22 kDa)、CD63 (46 kDa)、TSG101 (44 kDa) 和 calnexin (90 kDa) 在 NK-Exo 上的表达的蛋白质印迹分析（A：细胞裂解物，B：NK-Exo）。

C. NK-Exo 的内化

1. 用 PKH67 标记的 NK-Exo 处理 SKOV3 细胞 6 小时，用 4%多聚甲醛固定 30 分钟，并用 PBS 洗涤三次。在 0.1 处用 DAPI 染色 μ g/mL 20 min，PBS洗涤3次。
2. 拍摄那些标记细胞的免疫荧光图像（图 3A）。
3. J软件量化荧光强度和面积以计算 PKH67 标记的 NK-Exo 的摄取率（图 3B）。

图 3. 卵巢癌细胞对 NK 细胞衍生的外泌体 (NK-Exo) 的细胞摄取。 (A) NK-Exo 被 SKOV3 细胞摄取。 SKOV3 细胞被 DAPI 染成蓝色，NK-Exo 被 PKH67 染成绿色。 (B) 通过绿色荧光强度量化的 NK-Exo 摄取量（10×，比例尺：200 μm；100×，比例尺：40 μm，n = 3，平均值± SEM ， t-检验， ** p < 0.01)。荧光强度的定量表明 SKOV3 细胞显着摄取 PKH67 标记的 NK-Exo，摄取率在 6 小时内达到 50%。

D. NK-Exo功能验证

1. 通过纳米流分析检测典型 NK 细胞标记 CD56 和脱粒标记 CD107a 在 NK-Exo 上的表达（图 4A）。
2. 通过蛋白质印迹检测 NK-Exo 中 CD56 和穿孔素的表达（图 4B）。 NK细胞是已知通过释放效应子发挥其细胞溶解作用穿孔素等分子，可能有助于 NK-E xo对肿瘤细胞的细胞毒性。
3. 通过 CCK8 测定检测 NK-Exo 对 SKOV3 和 OV-90 卵巢癌细胞的细胞毒性（图 4C）。
4. 使用流式细胞仪检测 NK-Exo 介导的 SKOV3 和 A2780 卵巢癌细胞凋亡（图 4D）。流式细胞术分析细胞凋亡证实 NK-Exo 可诱导 SKOV3 细胞凋亡和A2780细胞；这凋亡细胞的比例由晚期凋亡细胞和（右上象限）和早期凋亡细胞（右下象限象限）。

图 4 。 NK 细胞衍生的外泌体 (NK-Exo) 的功能表征。 (A) 纳流检测 NK-Exo 表面 CD56 和 CD107a 的表达。红点代表积极信号。 (B) CD56 (122 kD) 和穿孔素 (61 kD) 表达的蛋白质印迹分析（A = 细胞裂解物，B = NK-Exo）。 (C) NK-Exo 对 SKOV3 细胞和 OV-90 细胞的 CCK-8 测定（n = 3，平均值±SEM， t-检验，* p < 0.05，*** p < 0.001）。 (D) NK-Exo 处理后通过流式细胞术对 SKOV3 和 A2780 细胞的细胞凋亡分析。

讨论

传统的外泌体分离方法是超速离心。然而，该方法对应用体积有限制，只能通过小体积和多台离心机获得大量外泌体，成本非常高，对外泌体在临床治疗中的应用提出了很大挑战（ Liang 等人，2018）。
为了克服这些问题，我们使用 TFF 系统结合传统的超高速离心方法来浓缩大量的细胞培养上清液。浓缩可确保保留外泌体，同时去除较小的杂质和多余的水。此步骤可实现细胞培养上清液浓度的 50-160 倍，并充分捕获 NK-Exo 以确保无外泌体损失。
在浓缩之前，我们对细胞培养上清液进行了两步低速离心，以去除大的细胞碎片。此步骤减少了 TFF 系统的浪费并加快了浓缩速度。入口压力保持在 2.5 bar 以进行浓缩，以避免损坏 NK-Exo 的结构完整性。然后在完成浓缩之前以缓慢的速度降低压力以进行最终浓缩，以提高 NK-Exo 的回收率。然后通过超速离心将 NK-Exo 从浓缩溶液中分离出来。采用纳流法检测切向流滤液和NK-Exo的颗粒浓度和粒径，确定TFF系统对NK-Exo的截留效率高于90%。
正如 NK-Exo 的表征结果所证实的那样，该方法不会破坏 NK-Exo 的结构完整性，NK-Exo 仍保持其特征形态和大小，并去除了大部分细胞碎片污染。
在本研究中，对 NK-Exo 进行了进一步的功能验证。首先，NK-Exo被证实能够进入卵巢癌细胞并进一步发挥作用。我们在 NK-Exo 中检测到一些细胞毒性物质，证明 NK-Exo 能够对 OC 细胞产生细胞毒性作用并诱导细胞凋亡体外。因此，通过我们的方案从大规模细胞培养上清液中分离出的 NK-Exo 可以保持其完整的形态结构、表型和抗肿瘤活性，所有这些都为 NK-Exo 在临床肿瘤治疗中的应用提供了可能性。

致谢

XZ 得到了中国贵州省科技计划 [授权号：(2019)1263] 和贵州省科技重点计划 [授权号：ZK (2021)012] 的支持。 JZ 得到贵州省自然科学基金资助[批准号: J (2015)2017]。【基金】：四川省妇女儿童发育与相关疾病重点实验室基金项目(No.2022002)

利益争夺

作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

参考

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