材料和试剂

下面提供的所有目录号担任向导；也可以使用其他来源。

材料

铝箔
色谱柱，200 × 10 mm，15 mL（VWR，目录号：552-5410）
一次性玻璃巴斯德移液器（150 毫米；VWR，目录号：612-1701）
玻璃珠，3 毫米（ Supelco ，目录号：1040150500）
玻璃切割器（Bohle，目录号：BO 400.1）
玻璃弹珠（Fisher Scientific，目录号：S04581）
玻璃移液器（例如，带刻度的移液器 BLAUBRAND ® Type 3 Class AS，10 mL，刻度：10 mL；Carl Roth，目录号：HXT8.1）
玻璃棉（VWR，目录号：519-3101）
Hamilton 700 系列注射器 25、100 和 500 μL （Peter Oehmen GmbH，目录号：9221013、9221015、6055335）
长颈玻璃管（Carl Roth，目录号：0486.2）
磁棒 ROTILABO® Micro ，直径 2 mm，长度 5 mm（Carl Roth，目录号：0955.2）
移液器吸头 200 μL和 1,000 μL （SARSTEDT AG & Co. KG，目录号：70.760.002 和 70.3050.020）
尖底玻璃管，10 mL（Merck，目录号：CLS9950210）
圆底玻璃管，10 mL，带接头和塞子（Carl Roth，目录号：NY90.1）
报春花染色的喷雾瓶（Carl Roth，目录号：YC44.1）
TLC 板，硅胶 60（Merck，目录号：105626）
TLC 室（Carl Roth，目录号：1N64.1）
化学品

丙酮 pa（VWR，目录号：32201）
四水合钼酸铵（Carl Roth，目录号：3666.1）
L-抗坏血酸（Carl Roth，目录号：3525.2）
氯仿，乙醇稳定并经认证不含光气和 HCl (CHCl 3 )（Roth，目录号：7331.2）
CM Sepharose TM Fast Flowing（Sigma-Aldrich，目录号：17 0719-01）
去离子水
二氯甲烷（DCM）（VWR，目录号：32222）
N'，N'-二异丙基乙胺（DIPEA）（Sigma-Aldrich，目录号：D125806）
N'，N'-二甲基甲酰胺（DMF）（Sigma-Aldrich，目录号：D4551）
乙醇 pa（VWR，目录号：20821.321）
甲醇 (MeOH)（VWR，目录号：20847.307）
氮气，99.999% (ALPHAGAZ, Air Liquide, Düsseldorf, Germany)
高氯酸（VWR，目录号：20589）
Primuline （Sigma-Aldrich，目录号：206865）
磷酸氢二钠二水合物（VWR，目录号：28029）
三乙胺（VWR，目录号：8.08352）
抗坏血酸溶液（见配方）
提取液（见配方）
钼酸盐溶液（见配方）
磷酸盐标准溶液（见配方）
Primuline染色溶液（参见配方）
反应溶剂（见配方）
TLC 洗脱液（见配方）

脂质

1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE，Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL，美国，目录号：850725）
1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DPPE，Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL，美国，目录号：850705）
注意：此过程也已使用短链脂质成功执行，包括 1,2-二己酰-sn-甘油-磷酸乙醇胺（diC6-PE，目录号：850697）、1,2-二辛酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（diC8-PE，目录号：850699 ）和 1-hexadecanoyl-2-hexanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine（C16C6-PE，定制），均购自 Avanti Polar Lipids（Alabaster，AL，USA）。

荧光染料

pHrodo Red NHS-ester（Invitrogen，目录号：P36600）
pHrodo Green STP-ester（Invitrogen，目录号：P35369）
Alexa Fluor TM 488 NHS-酯（Invitrogen，目录号：A20000）
TAMRA NHS 酯（ Lumiprobe ，目录号：18120）和 SNARF-1 NHS 酯（Invitrogen，目录号：S22801）也成功执行了此过程。

设备

移液器 P200 和 P1000（GILSON® ，目录号：FD10005 和 FD10006）
分析天平（Sartorius Entris-i II，220 g/0.1 mg；Buch Holm，目录号：4669128）
Chemidoc MP 成像系统 (Bio-Rad)，照明波长为 460 – 490 nm 和 520 – 545 nm，分别带有 530/28 nm 和 695/55 nm 发射滤光片
CLARIOstar酶标仪（BMG LABTECH）
冷冻 -20 °C
玻璃干燥器Boro 3.3，盖子上有插座，20 厘米，包括旋塞阀（BRAND GmbH，目录号：65238）
加热块（ Rotilabo® Block Heater H 250；Carl Roth，目录号：Y264.1 ）
磁力搅拌器（例如，IKAMAG® 、 DREHZAHL ELECTRONIC、IKA、德国 Staufen im Breisgau）
冷冻离心机（例如， Multifuge® 3-R， Kendro Laboratory Products，目录号：75004371 ）
带接口 I-100 和旋转蒸发器 Rotavapor® R -100、SJ29/32、V、220–240V 的真空泵 V-100（ Buchi ，目录号：11593636、11593655D 和 11100V111、11061895）
涡旋混合器（Vortex Genie 2 Scientific Industries Inc.，目录号：SI-0236）
水浴锅（ Julabo CORIO C-BT5，目录号：9011305）

软件

ImageLab 软件版本 5.2.1 (Bio-Rad)

程序

DOPE 与pHrodo Red NHS-ester 的偶联反应（图 1）

在整个过程中应使用玻璃器皿，因为脂质会粘在塑料器皿上，而氯仿可以从塑料器皿中提取成分。脂质储存在冰上处理，以减少移液过程中氯仿的蒸发。在本节中，将描述DOPE 与pHrodo Red NHS 酯的偶联。该程序也成功地使用pHrodo Green STP 酯和 Alexa Fluor 488 NHS 酯与 DPPE 作为脂质进行。使用此程序也可以标记 C 16 C 6 PE等短链脂质。
注意：下面给出的体积仅供参考。需要根据使用的荧光团和脂质为每个反应正确计算所有体积。

图1 。 pHrodo红色标记 DOPE的合成方案
脂质在氯仿中接收并包装在密封的玻璃安瓿瓶中；储存在 -20 °C 直至使用。
注意：对于长期储存，在真空干燥器中蒸发溶剂并将脂质储存在-80°C，以避免不饱和脂质氧化。为了蒸发溶剂，我们使用连接到耐化学腐蚀真空泵的玻璃干燥器，达到 10 mbar (± 2 mbar) 的最终真空度和 1.5 m 3 /h 的抽吸能力。
要制备脂质储备液，请将 10 mg 等分试样从 Avanti 玻璃安瓿瓶转移到玻璃螺口瓶中。在 250 mbar 的干燥器中蒸发玻璃瓶中的溶剂 3 小时，并在 30 mbar 下额外孵育 1 小时。用螺帽关闭小瓶并储存在 -20 °C 直至进一步使用。
注意：氯仿是一种危险溶剂。在穿着适当的防护服的同时，在通风橱中进行所有工作。
从冰箱中取出所需的脂质库存，放在冰上，然后溶解在氯仿中，最终脂质浓度为 10 mg/ mL。
注意： DOPE 以外的脂质在氯仿中的溶解度可能有限，需要氯仿/甲醇/水的混合物。如需更多说明和指南，请访问 Avanti Polar Lipids 网站 (https://avantilipids.com/products)。
μg的荧光团 NHS 酯，通常在 1 到 2 mg 之间）从 CHCl 3储备溶液转移到带有接头 (NS 14) 的圆底玻璃管中。为了最大限度地提高反应产量，我们使用超过荧光团 NHS- 或 STP-酯 2 倍摩尔过量的脂质。
在室温下在 N 2气流下小心蒸发溶剂。去除溶剂后，添加一个小的磁力搅拌棒。
注意：我们将一次性玻璃巴斯德吸管的大端滑入连接到 N 2气瓶的实验室管中。将流量调整为通过移液管的温和的 N 2气流。移液器可以用环形支架夹固定，以将其固定在固定位置。
溶解荧光团（500 μg ) 在 100 μL的反应溶剂中（参见食谱）并将其转移到含脂质的玻璃管中。对于 500 μg荧光团，使用大约 100 μL 。
添加 DIPEA 至终浓度为 130 mM（例如，2.3 μL DIPEA 用于 100 μL反应溶剂）。
注意： DIPEA有毒，会导致严重的皮肤灼伤。
用玻璃塞 (NS 14) 密封容器并用铝箔包裹。将容器放在磁力搅拌器的顶部，让反应在室温下搅拌过夜。

标记脂质的提取

萃取时，加入 0.5 mL CHCl 3 、1 mL MeOH 和 0.5 mL H 2 O，然后再加入 0.5 mL CHCl 3和 0.5 mL H 2 O。反应混合物应首先为单相，然后变为双相（图2）。

图2 。荧光标记脂质的提取过程结果。有色有机相在底部，水相在顶部。
将有机相（有色底相）转移到新的玻璃管中。
注意：短链脂质可能需要用 CHCl 3进行多次后续洗涤，以产生脱色的水相。
2流或使用旋转蒸发器干燥有机相。
溶剂完全蒸发后，继续纯化（参见 C1 和 C2 部分）或将样品储存在 -20 °C。

纯化的标记脂质

C1。通过制备纯化薄层色谱法 (TLC)
需要确定产品的保留因子 (R f )。为此，可以执行测试 TLC（图 3）。
使用玻璃切割机准备一个大约 5 厘米宽的 TLC 板。
用铅笔小心地在盘子底部上方约 1 厘米处画一条线。
将少量溶解的脂质原液和溶解的粗反应产物（例如，用玻璃巴斯德吸管）涂在底部的细线上，让它们完全干燥。
用 TLC 洗脱液（参见食谱）填充 TLC 室，填充高度约为 0.8 厘米。
盖上盖子，让腔室饱和约 5 分钟。
将 TLC 板小心直立放入腔室中，然后盖上盖子。当溶剂前沿距离顶部约 1 厘米时，从腔室中取出 TLC 板。
用铅笔标记溶剂前沿线。
让 TLC 板在通风橱下干燥约 1 小时，然后在白光和长波紫外线下拍摄图像，以使荧光团偶联脂质和未反应的荧光团可见，例如使用 Chemidoc MP成像系统。
报春花染色溶液（见食谱）喷洒板，使干燥后在长波紫外线下可见脂质。
计算 R f值如下：

R_f= (Distance of product)/(Distance of mobile phase)

pHrodo Red-DOPE 和pHrodo Green-DOPE，不同荧光团缀合的 DOPE 脂质的R f值分别为 0.70 和 0.55 。

图3 。薄层色谱法（TLC）。 A. TLC 制备所需的材料。 B.准备好的TLC板； L = 纯脂质，P = 反应产物。 C. TLC 板直立放置在 TLC 室中。 D.白光下拍摄的 TLC 板。 E. Primuline染色后的 TLC 板，在长紫外光下拍照。未反应的 DOPE 和pHrodo Red-DOPE 的位置分别由空心箭头和实心箭头表示。 O，起源； F，色谱图的溶剂前沿。

使用 20 厘米长的薄层色谱板准备制备薄层色谱。
在 20 厘米长的薄层色谱板底部上方 1 厘米处画一条线。
将反应产物溶解在 100 μL CHCl 3 :MeOH（2:1，v/v）中。
将溶解产物的全部体积均匀地涂在 TLC 板的线上，例如，使用玻璃巴斯德吸管。
让 TLC 板在通风橱中完全干燥约 1 小时。
用 TLC 洗脱液（参见食谱）填充 TLC 室，填充高度约为 0.8 厘米。
盖上盖子，让腔室饱和 20 分钟。
将 TLC 板直立放置在腔室中。
当溶剂前端位于顶部下方约 1 厘米时，取下 TLC 板。
让 TLC 板在通风橱下干燥，然后在白光和长波紫外线下拍摄图像，使荧光团耦合脂质和未反应的荧光团可见。典型结果如图 4 所示。

图4 。 pHrodo标记的脂质的制备薄层色谱 (TLC)，在 TLC 板的右侧有纯产品的参考。所示色谱图在白光下拍照前已完全干燥。原点由黑线表示。

C2。从制备型TLC中重新提取标记的脂质
用抹刀小心地刮掉产物带，并将二氧化硅放入尖底玻璃管中（没有接头，必须适合离心机）。
将 1 mL 提取溶液（参见食谱）添加到每个使用的试管中，并将每个试管涡旋 1 分钟。
g离心管10 分钟。
将液相转移到新的玻璃管中。
重复步骤 2 – 4，直到液相变为无色。
注意：在具有合并液相的玻璃管中，几分钟后一些二氧化硅可能会沉淀在底部。可以将液相转移到新容器中以去除二氧化硅。
3和 H 2 O (v/v)混合物。将有机相（有色底相）转移到新的玻璃管中并通过N 2气流或在干燥器中干燥。继续进行量化（D 部分）或储存在 -20 °C。

C3。通过柱层析纯化
例如，使用 Alexa Fluor 488 DPPE 进行纯化。确切的梯度条件可能因使用的脂质和荧光团而异。
准备专栏。
为带玻璃的色谱柱提供一个羊毛塞，以在阀门前形成一个紧密的过滤器。
将足够的 CM Sepharose（通常大约 20-25 mL 悬浮液）转移到烧杯中，以在柱中产生 10 cm 高（1 cm 直径）的固定相。
将 Sepharose 一次性填入柱中，用完多余的 MeOH。
注意：小心不要让色谱柱干涸！
在色谱柱顶部变干之前关闭阀门。要去除柱子中的气泡，请在 Sepharose 沉降时轻轻敲打它，例如，用软木塞环。
沉降后，将 Sepharose 覆盖在 1 – 3 mm 厚的玻璃珠层下。根据表 2 中给出的混合物逐渐冲洗 MeOH 至 CHCl 3 。

用于冲洗色谱柱的MeOH 和 CHCl 3比率
V甲醇(毫升) V氯仿(mL)
7 3个
5个 5个
3个 7
1个 9
0 10 (10 × )

将反应产物溶解在大约 250 μL的 CHCl 3中，并通过沿壁画圆圈移动将其小心地添加到柱的顶部，以确保均匀分布。用小体积清洗样品管直至无色，然后将其应用到色谱柱上（图 5A）。
执行柱层析，同时逐渐增加洗脱液的甲醇含量，从纯 CHCl 3开始（表 3）。在 10 mL 玻璃管中分别收集所有分数。
在干燥器或旋转蒸发器中蒸发所有样品管中的溶剂。反应产物可以通过TLC 识别（图 5B）。继续量化或将样品储存在 -20 °C。

纯化 A488-DPPE 的MeOH 和 CHCl 3比率
V 甲醇 (毫升) 氯仿3 (毫升) 甲醇 (%) 总体积 (mL)
-- 20 0 20
1个 19 5个 20
1.4 18.6 7 20
4.5 45.5 9 50
3.6 26.4 12 30
9 51 15 60 (A488-DPPE)
15 15 50 30 (A488-DPPE)
20 10 67 30 (A488-DPPE)

图5 。通过柱层析纯化。 A.用于纯化标记脂质的色谱柱。 B. TLC 板以确定含有分数的产品，以硝基苯并恶二唑(NBD) 标记的脂质为例。所示色谱图在环境光下拍照前已完全干燥。

根据 Bartlett (1959) 和Ploier和 Menon (2016) 对反应进行量化，对方案进行小幅修改

注意：下面描述的所有步骤必须在通风橱中使用适当的个人保护并遵循实验室安全指南进行。
打开电加热块（放置在通风橱中）并将其设置为 195 °C。
准备样品管。我们建议准备一式三份。
将样品溶解在适当体积的 CHCl 3中，然后将大约 20 nmol（假设收率为 100%）转移到玻璃管中。
经由N 2流蒸发溶剂。
准备标准管。我们建议为每个浓度准备两个标准品。
试样的磷酸盐标准溶液（参见配方）稀释至 0.4 mM。
转移 0 (0 μL )、5 (12.5 μL )、10 (25 μL )、20 (50 μL )、30 (75 μL )、40 (100 μL ) 和 50 nmol (125 μL ) 磷酸盐到玻璃管中。
将 650 μL高氯酸添加到所有管（包括标准管）中，并用玻璃弹珠松散地覆盖它们。
在 195°C 下加热罩中加热块中的所有管子约 1-2小时，直到溶液变清。让溶液冷却至室温。
打开通风橱下的水浴并将其设置为 80°C。
当样品处于室温时，向每个试管中加入 3.3 mL 的去离子水并涡旋。
向每个试管中加入 0.5 mL 钼酸盐溶液（参见食谱）并涡旋。
向每个试管中加入 0.5 mL 抗坏血酸溶液（参见食谱）并涡旋。
在 80°C 的水浴中将所有样品煮沸 10 分钟。
将所有样品冷却至室温后，将每个样品一式两份转移到 96 孔板中。
使用设置为 812 nm 的微孔板读取器确定每个孔的吸收。可以在 780 和/或 720 nm 重复读数以调整最佳灵敏度。
分别平均每个标准和样品的重复和三次读数。
从所有标准和样品读数中减去空白标准（0 nmol 磷酸盐）的值。这是修正后的吸光度。
绘制标准曲线（波长的平均吸光度与 nmol 磷酸盐）并使用 Microsoft Excel 等进行线性回归，得到类型为y = mx + b的方程式，其中y 是吸光度，x 是磷酸盐浓度，m是斜率；减去空白标准值后，y 轴 b 的截距为 0。
通过将样品吸光度与获得的标准曲线进行比较，使用回归线求解样品浓度（图 6）。

图6 。磷酸盐测定结果的典型图。线性回归应用于所有不同浓度（蓝点和虚线）的平均磷酸盐标准吸光度（812 nm）值。使用线性回归给出的方程确定样品浓度（红点）并包含在图中。

使用可靠的方法对少量产品进行分析，例如质谱分析。图 7 显示了pHrodo绿色标记的 DOPE的典型结果。

图7 。在负离子模式 (A) 和正离子模式 (B) 下通过 MALDI-TOF 质谱法获得的pHrodo绿色标记的 DOPE的示例性 MALDI-TOF 质谱图。由于制造商没有公布化学结构，并且只给出了大约 750 g/mol 的分子量，因此指示的信号对应于每次电荷质量 (m/z) 1,250 范围内的预期产品峰。因此，m/z 1,241.2 对应于去质子化产物分子，m/z 1,243.3 对应于质子加合物。

食谱

抗坏血酸溶液 (50 mg m/L)
将 600 毫克的 L-抗坏血酸溶解在 12 毫升的去离子水中。该溶液不能储存。

提取液
混合 2 mL 的氯仿、4.4 mL 的 MeOH 和 2 mL 的 H 2 O，并在室温下储存在密封的玻璃瓶中。

钼酸盐溶液 (12 mg/L)
144 毫克钼酸铵四水合物溶解在 12 mL 的去离子水中。该溶液不能储存。

磷酸盐标准溶液 (4 mM)
将35.598 毫克磷酸氢二钠二水合物溶解在 50 mL 的去离子水中。该溶液可储存在-20 °C。

Primuline染色溶液 (0.05%, w/v)
50 mg primuline溶解在 100 mL 的水/丙酮混合物中（v/v，20:80）

反应溶剂
将 6 mL 的 DCM 与 1 mL 的 DMF 混合，并在室温下储存在密封的玻璃瓶中。

薄层色谱洗脱液
混合30 mL 氯仿、35 mL EtOH、35 mL 三乙胺和 7 mL 去离子水。该溶液不能多次储存或使用。

致谢

该协议改编自我们之前的工作（ Kemmer等人，2015 年； Veshaguri等人，2016 年； Kühnel等人，2019 年；Bohr 等人，2020 年）。我们要感谢 PD Jürgen Schiller博士（德国莱比锡大学）在整个项目期间对质谱的不断帮助。这项工作得到了德国Forschungsgemeinschaft （INST 213/886-1 FUGG，INST 213/985-1FUGG；GU 1133/11-1）的仪器赠款的支持。图形摘要是使用BioRender.com创建的。

利益争夺

作者声明不存在竞争利益。

参考

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