材料和试剂

鼠标
异氟烷气体（Abbott Laboratories）
解剖盘蜡（黑色）（Fisher Scientific，目录号：S17432）
管道
HEPES
EGTA
MgSO 4 4 /
Triton-X-100
紫杉醇（来自Sigma-Aldrich的紫杉醇，目录号：T7191）
PBS
NaN ₃
脱氧胆酸钠
BSA 10％在PBS中
柠檬酸三钠二水合物（Merck KGaA，目录号：567446）
1N HCl（1mol/L）（Merck KGaA，目录号：1090571000）
多聚甲醛（PFA）16％溶液，EM级（Electron Microscopy Sciences，目录号：15710）
鬼笔环肽-Alexa 568（Life Technologies，Molecular Probes ，目录号：12380）
注意：Alexa类型可以根据可用的其他荧光团来选择。
DAPI：1mg/ml PBS中的储备溶液（在4℃下储存）
Alexa标记的二抗。在我们的研究中，这些来自生命技术 - 分子探针山羊抗（物种）IgG（H + L）和所有高度交叉吸附，以确保不存在种间反应性。注意：对于任何一次抗体的组合，必须选择相应的二级抗体和荧光团波长。在我们的例子中，Phalloidin-Alexa 568（红色荧光）用于标记由肌动蛋白制成的微丝，DAPI用于DNA，第二抗体通常用Alexa 488（绿色荧光）和Alexa 647（远红色荧光）标记。后者被推荐用于产生弱信号的抗原，因为其被目前的共聚焦显微镜系统非常好地检测。当不能使用鬼笔环肽时，可以另外使用Alexa 568或555（红色荧光）标记的二抗。
注意：在我们的研究中，没有使用商业一抗。
不含DAPI的Prolong Gold封片剂（Life Technologies，目录号：P36934）
2x PHEM（参见配方）
固定剂（见配方）
20 mM柠檬酸钠缓冲液（见配方）
初级亲和纯化抗体的溶液（参见配方）
二抗溶液（参见配方）

设备

恒温水浴
用于异氟烷麻醉的Tem Sega蒸发器装置
剪刀3厘米和微型剪刀（精细科学工具）
镊子n°5（Fine Science Tools）
双目
30 G 1/2"针
U-100胰岛素注射器+针
显微镜载片76×26×1.1mm
1.5 ml Eppendorf管
微量移液器
18 x 18 mm玻璃盖玻片 1
快速共聚焦显微镜（我们使用Leica SP5共聚焦显微镜）
63x NA 1.4油浸镜头

程序

样品制备
1. 在组织收集期间需要麻醉小鼠。在麻醉前10分钟，在50ml塑料管中制备15ml PHEM 1x（来自PHEM 2x），并在恒温水浴中温热至37℃。将容器中的管在37℃的水中运输到解剖室，并在几分钟内使用
2. 麻醉鼠标使用异氟醚吸入与Tem Sega蒸发器的帮助
3. 在继续麻醉的同时，将其置于放置在化学萃取罩中的双目显微镜下，以便操作者不吸入异氟烷和甲醛气体。
4. 用细剪刀打开腹部，相对于肛门定位远端（下降）结肠，将其从周围组织中取出，并与后者相距约2.5厘米。对于空肠，横切它从盲肠/近端结肠约2.5厘米。有关小鼠消化道的计划，请参阅： http：//www.informatics。 jax.org/cookbook/figures/figure76.shtml。
  注意：对于我们的研究，敏感的基于细胞骨架的结构，如有丝分裂纺锤体的保存是必不可少的，只能通过快速处理实现。因此，我们每个肠段使用一个动物，并没有矫直肠。对于其他研究，例如某些细胞类型的核中存在某些转录因子，这可能不太重要。
5. 使用注射器，用PHEM 1x在37℃冲洗结肠或空肠切片。
  注意：37℃对于避免对有温度敏感的有丝分裂纺锤体的改变是重要的。对于其他研究，这可能不那么重要。
6. 立即用固定剂补充15μM紫杉醇。
  注意：固定剂含有PHEM缓冲液，已知可优化Ca ^{2 +}敏感微管的保存（Schliwa和van Blerkom，1981 ）和一些Triton-X-100以加速固定的速度。它补充有紫杉醇，以进一步防止微管损失。紫杉醇确实与微管结合，并使其对甲醛固定的降解具有抗性。没有添加紫杉醇，发现锭子更短，有时变形，使得我们的研究中所描述的锭子角度的测量不可靠。当微管的保存不是必需的时，可以省略紫杉醇。然而，推荐使用PHEM缓冲液，因为它可以防止甲醛固定期间的pH变化，例如PBS。
7. 切出一个1-2厘米的部分，并将其放在充满硬化的解剖盘蜡（黑色）充满5ml固定剂在室温下的杯子。用细剪刀沿其长度切开结肠或空肠段。
8. 通过用剪刀切割通过隔膜进入心脏牺牲鼠标
9. 针组织扁平和轻微拉伸蜡表面，粘膜上，并继续在室温固定40分钟。
10. 在约10分钟后，在固定剂中，在微型剪刀的帮助下将组织切成小的1.5mm ³方块。
11. 将它们转移到1.5毫升的Eppendorf管，总共40分钟后，在PBS中冲洗他们三次，每次10分钟。它们现在可以在4℃下在补充有8mM NaN 3的PBS中储存数周。
12. 在微量移液管上使用截止的蓝色尖端，将几片转移到放置在双目下的显微镜载玻片上。对于结肠碎片，使用固定在U-100胰岛素注射器上的两个薄的30G 1/2"针去除肌肉衬里。为此，肌肉衬里必须首先定位在粘膜层下面。然后通过在层之间插入一根针并使用它将肌肉层固定在适当位置，同时使用另一根针滑动或剥离粘膜，将它们分开。
  注意：空肠的肌肉薄层很薄，很脆弱，不需要去除。
13. 使用其中一个针作为切割装置，同时将粘膜碎片保持在适当位置，另一个切割成薄的约1.5mm长的切片，其包含两至三排邻接的隐窝。转移30-40这样切片到1.5ml离心管中。所有后续步骤在这样的Eppendorf管中进行，每个一抗联合一个
14. 将管具有约30个粘膜切片在旋转的轮上，并在30分钟内连续孵育1ml含有200mM NH 4 Cl，3％脱氧胆酸钠的H 2中的PBS 0.5％Triton-X-100的PBS和PBS/BSA 1％/Triton 0.2％封闭。在每个温育步骤后，使用安装在微量移液管上的1ml蓝色吸头以在切片由于重力沉降到管底部之后去除液体。注意避免因靠着光源握住管子而损失切片。
  注意：必须制备H 2 O中的脱氧胆酸盐溶液。
15. 对于用某些抗体（例如针对转录因子Atoh1或Cdx2）的标记，通过将含有样品的管与1ml的0.1mM柠檬酸钠缓冲液（pH6.0）（从20x储备缓冲液制备）置于块加热器在95℃下30分钟，然后在PBS/BSA 1％/Triton 0.2％中封闭
切片的免疫标记
1. 继续使用含有切片的相同的Eppendorf管，并在与第一抗体和第二抗体孵育期间以及在洗涤期间将它们安装在转向轮上。
2. 与在1ml PBS/BSA 1％/Triton 0.2％中稀释的第一抗体的孵育在4℃的冷室中过夜。
3. 在1ml PBS/BSA 1％/Triton 0.2％中冲洗3×10分钟
4. 与在PBS/BSA 1％/Triton 0.2％中稀释的1ml第二抗体（每管补充2μl储备Phalloidin-Alexa 568的2μl储备抗体）孵育5小时。
5. 冲洗2×10分钟。
6. 在2μl稀释在PBS/BSA 1％/Triton 0.2％的储备DAPI中孵育20分钟
7. 在PBS中冲洗1×10分钟。
8. 取出PBS，并用150μlPBS替换。重新悬浮切片，倒转管，将其内容物放置在双目下的显微镜载玻片上。
9. 使用U-100胰岛素注射器和针头，收集玻片中心的切片。
10. 使用微量移液管上的黄色尖端并稍微倾斜载玻片，移除PBS以使碎片几乎干燥。用滤纸帮助除去PBS的最后痕迹。
11. 使用截止的黄色提示，添加30微升Prolong Gold封固介质到切片，并使用U-100胰岛素注射器和针将它们悬浮在它。
12. 小心地降低一个18 x 18毫米玻璃盖玻片，以安装切片。
  注意：大约一半的切片会在他们身边。
13. 在室温下放置过夜，使固定介质在4℃的黑暗中聚合并储存。
快速共聚焦显微镜
为了能够在一个会话期间收集足够大数量的图像堆栈，我们建议使用快速共焦显微镜和63x NA 1.4油浸镜头。例如，使用Leica SP5共焦显微镜以双向共振模式（8,000Hz）扫描，每个通道具有8x平均/平面/平面。同时检测DAPI和Alexa 647，依次检测Alexa 488和568（或555）。旋转扫描头，使得一个场包括平行于扫描方向定向的两个至三个隐窝。采集通常由60个平面×4个通道组成，具有0.5μm的步长和141nm的像素尺寸。
许多图片和3D动画都可以在这里免费下载： http：//

食谱

2x PHEM（500ml）

18.14克
管道

6.5克
HEPES

3.8克
EGTA

0.99克
MgSO 4 4 /

溶于500ml水中，用10mM KOH调至pH7.0
固定剂（3％PFA-PHEM 1X-Triton 0.2％-Taxol15μM）（10ml）

1,875 ml
16％PFA

5 ml
2x PHEM

100微升
20％Triton-X-100

38μl
4mM紫杉醇（溶于DMSO）

3 ml
H sub 2 O
20mM柠檬酸钠缓冲液，pH6.0 将5.88g柠檬酸三钠脱水物溶解在1,000ml蒸馏水中
用1N HCl调节pH至6.0
主要亲和纯化抗体的溶液
将一级亲和纯化的抗体从储备液稀释至在PBS/BSA 1％/Triton 0.2％中的2至6μg抗体/ml。通常，这对应于1/500到1/2,000的稀释注意：必须测试每种抗体的特异性，并通过连续稀释测定最佳抗体浓度，以获得1至6μg/ml抗体。理想地，在通过敲除或敲低抑制抗原后对组织测试特异性。如果本地化是已知的，获得就足够了。
二抗溶液
第二抗体以2μl/ml的PBS/BSA 1％/Triton 0.2％的储备溶液使用，向其中加入每ml2μl鬼笔环肽-Alexa 568储备液。

致谢

该协议已经在Bellis等人（2013）中开发和报道。由Ligue Contrele癌症支持J.Bellis。

参考文献

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