材料和试剂

活的培养皿。艰难细胞细胞
甲磺酸乙酯（EMS）
利福平
无菌水
蔗糖
10％（w/v）牛磺胆酸
硫代乙醇酸盐
溶菌酶
脑心浸液（BD Bacto ^TM，目录号：237500）
酵母提取物（BD Difco ^TM，目录号：212750）
0.1％（w/v）L-半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：C7352）
BHIS介质（参见配方）
BHIS琼脂培养基（见配方）

设备

15 ml锥形螺帽管
50ml锥形螺帽管
厌氧室
分光光度计或酶标仪
生物安全柜
台式微量离心机
摆动离心机
65°C热块
50°C水浴
37°C水浴

程序

诱变
1. 在厌氧室中，接种5ml具有C的菌落的BHIS培养基。艰难梭菌并在37℃下生长过夜注意：使用15 ml或50 ml锥形螺旋盖管将有助于清洗步骤和孵育步骤。但是，协议并不是绝对必需的。
2. 第二天，将过夜培养物稀释到5-ml BHIS培养基中至OD 600 = 0.05，并在37℃下生长至OD 600 = 0.5。
  注意：OD ₆₀₀ = 0.5是对数中期增长。需要对数期培养以确保引入的突变有效地传递给每一代。
3. 将EMS加入1％（v/v）并生长3小时注意：
  1. 确保正确挂起EMS，它可以在管底部形成小球。
  2. EMS是一种强大的DNA诱变剂。按照您的机构协议处理废物。
4. 洗涤培养物两次，在3,000×g离心10分钟，在室温下用10ml BHIS培养基离心以除去EMS。
5. 将沉淀重悬于40ml BHIS培养基中
6. 在37℃下在BHIS培养基中恢复细胞过夜注意：在该群体中利福平抗性的频率将有助于确定细胞的诱变是否成功。通常，观察到利福平耐药性增加约1,000倍。
发芽无效表型的分离
1. 传播50微升的回收，诱变的。艰难细胞接种到20个BHIS琼脂培养皿上注意：艰难梭菌在琼脂培养基上最有效地产孢。向板中加入更多的细胞导致产生更少的孢子。我们已经发现，较低的接种物（例如50μl）导致较大的孢子产量。
2. 在37℃下在厌氧室中孵育平板，直到形成孢子（大约4-7天，取决于使用的艰难梭菌菌株）。
3. 使用无菌环或移液器吸头，从板上刮下生长物，并在含有1ml无菌水/板的1.5ml微量离心管中悬浮每个板的生长。
  注意：在厌氧室外的所有艰难梭菌操作应根据您的机构IBC（例如在生物安全柜中）进行。
4. 在4℃下不搅拌孵育过夜注意：在4℃下在水中过夜孵育有助于从母细胞释放孢子。
5. 用微量离心机在室温下以14,000×g离心1分钟，用1ml无菌水洗涤5次。
  注意：当营养细胞/母细胞溶解时，经常看到白色的细胞碎片层。该层出现在孢子层的顶部，并且可以在洗涤期间安全地移除。
6. 将孢子颗粒合并到3ml水中。
7. 小心地将孢子悬浮液铺在7ml 50％蔗糖的顶部
8. 在室温和4000xg离心20分钟。
9. 从管中除去水层和蔗糖。
  注意：孢子在试管底部形成沉淀。营养细胞和细胞碎片保留在界面处或分散在蔗糖部分内。
10. 如上述步骤B5中所述，将纯化的孢子在无菌水中洗涤五次
11. 将纯化的孢子悬浮于补充有10％（w/v）牛磺胆酸的40ml BHIS培养基中注意：
  1. 天门冬氨酸是艰难梭菌芽孢的发芽物。
  2. 在使用前过滤灭菌BHIS + 10％牛磺胆酸培养基。
12. 在37℃下温和搅拌过夜（例如摇动）。
  注意：这种条件将刺激仍然能够对牛磺胆酸作为发芽物反应的那些孢子的萌发。因为这个协议选择萌发无效的表型，孢子发芽的条件（即有氧与厌氧）无关紧要。
13. 将溶液在室温下以3,000xg离心10分钟以沉淀孢子和发芽的孢子。
14. 将沉淀重悬在10ml BHIS培养基中，在65℃下有氧培养60分钟注意：只有休眠孢子能够在这种情况下存活。
15. 离心溶液，如步骤B13
16. 将沉淀重悬在250mM巯基乙酸盐中注意：因为该方法选择萌发无效表型，所以必须人工发芽孢子以恢复作为集落的突变体（Kamiya等人，1989）。
17. 在50℃下孵育30分钟。
18. 离心溶液，如步骤B13
19. 将沉淀重悬于补充有4mg/ml溶菌酶的水中
20. 在37℃下孵育15分钟。
21. 将25μl等分试样在20个BHIS琼脂平板上铺平注意：要丰富萌发无效的表型，请重复步骤B1-B21。

食谱

BHIS中
37 g/L脑心脏输液
5 g/L酵母提取物
0.1％（w/v）L-半胱氨酸
BHIS琼脂培养基
BHIS介质
1.5％（w/v）琼脂

致谢

我们要感谢Charlotte Allen和Ritu Shrestha帮助开发这个协议。这项工作是由美国心脏协会国家科学家发展赠款给JAS（No. 11SDG7160013）支持。资助者在研究设计，数据收集和分析，决定发布或准备手稿方面没有任何作用。

参考文献

Francis，M.B.，Allen，C.A.，Shrestha，R。和Sorg，J.A。（2013）。由艰难梭菌发芽受体（CspC）识别胆汁酸是重要的用于建立感染。 PLoS Pathog 9（5）：e1003356。
Kamiya，S.，Yamakawa，K.，Ogura，H。和Nakamura，S。（1989）。回收热或碱改变的艰难梭菌的孢子。 a> J Med Microbiol 28（3）：217-221
McFarland，L.V。（2008）。关于艰难梭菌相关疾病的流行病学变化的更新。 Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol 5（1）：40-48。