材料和试剂

II型胶原酶（Sigma-Aldrich，目录号：C6885）
青霉素链霉素（Gibco ）
HEPES
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）
Dispase II（STEMCELL Technologies）
牛生长血清（Hyclone）
II型胶原酶溶液（参见配方）
胶原酶/分散酶溶液（参见配方）
生长培养基（参见食谱）

设备

剪刀
50ml锥形管
显微镜
100 mm细胞培养皿
40μm过滤器
荧光活化细胞分选仪（FACS）

程序

从成年小鼠中取出感兴趣的骨骼肌（胫前肌，大疱/腓肠肌或四头肌），并用细剪刀清洁头发腱和脂肪。
将肌肉放入50毫升锥形管，加入两倍体积的胶原酶消化培养基（1克肌肉2毫升消化培养基）。在37°C轻轻搅拌试管30分钟至1.5小时。消化时间取决于肌肉是来自新生儿，成年或老年动物。在消化期间，定期检查显微镜下的肌肉，直到肌肉开始损失和单个肌纤维分离。
消化后，用5ml生长培养基终止胶原酶，并将解离的肌肉直接转移到100mm细胞培养皿中。
用破碎的末端玻璃移液管（破碎端的孔径大小为直径约5mm）破碎肌肉，直到所有的肌肉都能轻易地通过移液管。肌肉组织与单个肌纤维的解离可以在显微镜下确认
倾斜板以收集组织悬浮液，并将其转移到新管中
如果肌肉没有完全解离，加入5毫升生长培养基，并重复步骤5和6
在100×g下旋转离解的肌纤维悬浮液3分钟。肌肉纤维将沉降并形成颗粒
弃去上清液（或以500×g旋转5分钟以收集单核细胞），并将肌纤维重悬于5ml生长培养基中。
重复步骤7和8两次，以去除所有单核细胞和小纤维碎片
加入15毫升的胶原酶II/Dispase II溶液到5ml的肌纤维悬浮液，消化纤维在37℃下1小时，轻轻地搅拌。长的孵育时间将确保肌纤维完全消化
Votex消化的纤维团块至少1分钟，然后将所有消化的细胞通过40μm过滤器
离心消化的细胞在500×g离心5分钟，以沉淀卫星细胞。用PBS洗涤细胞沉淀两次，以去除所有的酶
将生长培养基中的卫星细胞重悬（对于1,000,000个细胞，约10ml），并在未涂布板中预培养板细胞20分钟以除去成纤维细胞污染。
在生长培养基中收集未附着的细胞用于进一步应用，例如细胞培养和FACS（Chapman等人，2013; Conboy等人，2010）。
分离的肌肉干细胞的质量和纯度可以通过肌肉生成标志物，如Pax7和Myf5（图1）的免疫染色进行分析。

图1.分离的肌肉干细胞的免疫染色

食谱

胶原酶消化培养基II型胶原酶250U/ml
HEPES 10mM（pH 6.4）
解决在DMEM
肌肉干细胞的生长培养基
20％牛生长血清
1％Pen Strep
溶于DMEM培养基中
胶原酶/分散酶溶液II型胶原酶（250U/ml）3.2ml
Dipase II（10U/ml）4ml
生长培养基7.8ml

致谢

该协议改编自Chapman等人（2013）; Conboy等人（2010）和Li 等人（2009）。

参考文献

Chapman，M.R.，Balakrishnan，K.R.，Li，J.，Conboy，M.J.，Huang，H.，Mohanty，S.K.，Jabart，E.，Hack，J.，Conboy，I.M.and Sohn，L.L。从单个肌纤维分选单个卫星细胞揭示了细胞表面标记物和肌原生成能力的异质性。 Integr Biol （Camb） 5（4）：692-702。
Conboy，M.J.and Conboy，I.M。（2010）。成人肌纤维相关干/前体细胞的制备方法Mol Biol.61：149-163。
Conboy，M.J.，Cerletti，M.，Wajers，A.J.，Conboy，I.M。（2010）。成人肌纤维相关干/前体细胞的免疫分析和FACS分选。 Methods Mol Biol 621：165-173。
Li，J.，Reed，S.A.and Johnson，S.E。（2009）。肝细胞生长因子（HGF）通过SHP2信号调节原代小鼠成肌细胞增殖。 em> Exp Cell Res 315（13）：2284-2292