材料和试剂

植物材料
1. 在野生型或突变植物中表达GFP-TALIN的拟南芥转基因植物（Kong等人，2013）。肌动蛋白探针品系如LIFEACT-YFP和GFP-fABD2，THRUMIN1-GFP转基因品系也是有用的。
2. 在23℃下在100μmol/m 2/s白光（16h）/黑暗（8h）循环下生长的3-4周龄植物的年轻和完全膨胀的莲座叶。
  注意：在土壤中生长的植物比在MS培养基的平板中生长的植物更好。原因是植物生长在植物板上的叶子在样品处理过程中比在土壤上生长的植物更容易枯萎。
红色玻璃纸膜（TokyoButaiShowmei，目录号：20）
（任选的）作为抑制肌动蛋白动力学的肌球蛋白ATP酶抑制剂的2,3-丁二酮单肟（BDM）（Sigma-Aldrich，目录号：B0753）
含有Silwet L-77（Bristol-Myers Squibb公司，目录号：BMS-SL7755）的疏散溶液（参见Recipes）

设备

注射器（10ml）
共聚焦显微镜（Leica Microsystems，型号：SP5，配有63x/1.20W物镜和多线100mW氩激光器）
植物生长室或房间
红色安全灯（红色LED或荧光灯过滤红色膜）
镊子
剃刀刀片
剪刀
定制的比色杯系统和环架：该系统由两个互补配合的钢环组成，两个圆形盖玻片（直径22mm，1号和5号）和硅环（100个） μm）（Wada和Kong，2011;见视频1）

软件

开放源代码软件ImageJ（ http://rsbweb.nih.gov/ij/）

程序

叶标本的制备（见视频1）

视频1.在比色杯系统中制备叶片样本
1. 在弱光条件下（30μmol/cm 2 ^-1白光）孵育植物几个小时。
  注意：
  1. 在弱光条件下，叶绿体沿着垂直于入射光的细胞壁积累（积累反应）。然而，它们在强光照条件下远离该区域并且累积到与入射光平行的背斜壁（回避反应）。
  2. 此步骤对于在回避反应期间观察叶绿体是有用的。此外，根据您的实验目的，此步骤可以跳过或修改。
2. 通过在填充有排出溶液（0.01％Silwet L-77）的注射器中抽真空来分离玫瑰叶并消除叶中的空气。
3. 用刀片将叶子切成小块（约4 mm x 4 mm）。
4. （任选的）抑制剂处理，例如50mM 2,3-丁二酮单肟（BDM）
  1. 在疏散溶液中稀释感兴趣的抑制剂至合适的浓度。作为模拟处理，将不含抑制剂的载体溶液（DMSO）以相同的稀释率加入到排出溶液中。
  2. 通过使用填充有溶液的注射器温和抽真空消除叶中的空隙
  3. 在暗红色光下孵育叶片样品适当的时间（0.5〜1小时）
5. 将切下并切割的叶（用抑制剂溶液处理，如有必要）正面朝上放在圆盖玻片（5号）上
6. 用圆盖玻片（1号）小心地盖住叶子样本，并将其放置在比色杯系统中。
  注意：小心移除叶片样品和盖玻片之间的空间中的任何气泡，不仅是叶片空气空间中的空气。
共聚焦显微镜
1. 通过在暗红色光下观察样本来找到合适的叶绿体，并使用在弱激光功率下的快速扫描在栅栏细胞中的质膜和叶绿体之间的附近调整焦点。
  注意：在暗红色光条件下的眼睛观察被推荐以减少对cp-肌动蛋白丝动力学的任何光影响。暗淡的红光条件是使用放在光路中的一片红色玻璃纸薄膜制成的卤素灯。如果需要调整焦距，将输出激光器设置在最低功率（488 nm的1-5％），尽可能检测到叶绿素荧光。
2. 在黑暗中在显微镜载物台上孵育样品几分钟。
  注意：cp-肌动蛋白丝的消失（解聚）由光学蓝色激光的几次扫描诱导。然而，黑暗孵育诱导cp-肌动蛋白丝的聚合在蓝色激光扫描后。
3. 使用SP5软件（实时数据模式）设置光学参数以优化信噪比。
  1. 激发激光器：多线氩激光器（100mW的激光功率）被设置为20％输出功率，并且进一步在GFP激发的488nm的10％和用于诱导叶绿体回避反应的458nm的5％。
    注意：根据实验条件和各个系统的性能，激光功率可根据经验进行调整，以获得高信噪比的图像。
  2. 特定荧光信号的发射带：GFP为500至550nm，叶绿素为640至740nm。
  3. 使用具有4x数字变焦的适当分辨率（例如256 x 256或512 x 256）的镜头（63x/1.20 W）捕获图像（以0.5-μm步长从三到四个图像持续20或30个延时周期，至少20秒的时间间隔（见下文）。范围处于XYZT模式。
    注意：共聚焦显微镜的扫描速度是有限的，并且cp-肌动蛋白丝是动态调节的。因此，可以通过改变扫描速度和y轴分辨率来在一些范围内控制时间和空间分辨率。双向模式也可以用来缩短采集时间。
  4. 为了诱导叶绿体回避反应，在适当时间的间隔期间使用刺激激光（458nm，2.8μW）使用感兴趣区域（ROI）扫描适当的矩形或圆形区域。
    注意：为了诱导回避反应，蓝光直接在叶绿体的一侧。 ROI的宽度通常设置在10-20μm左右，以观察移动叶绿体上cp-肌动蛋白丝动力学的所有过程（解聚，聚合，不对称分布）。
    
    视频2.在蓝光诱导叶绿体回避反应期间的Cp-肌动蛋白细丝动力学。以约33秒的间隔收集延时图像（以1.5-μm深度的四个图像最大化），并以5帧/秒（fps）播放。总耗用时间为11:33（mm：ss）。图像是假色的，以指示GFP（绿色）和叶绿素（红色）荧光。在图像采集之间的间隔期间，使用458nm激光扫描照射用蓝色圆（直径15μm）表示的区域，以诱导回避反应。比例尺=10μm。
  5. （可选）可以在较高的光学和时间分辨率（例如，具有6x数字变焦的128×68的分辨率）捕获cp-肌动蛋白丝消失的连续图像。
4. 调整其他微观条件以优化图像质量。
  注意：光学组应根据实验条件而变化。成像质量主要取决于在肌动蛋白探针的表达水平和荧光蛋白的性质上可变的荧光强度。因此，最好的光学集合应该根据具体情况确定。
定量分析
1. 从定量分析的独立实验获得足够的时间推移图像。
2. 使用ImageJ软件程序分析延时图像（ http://rsbweb.nih.gov/ij/），其填充有适当的插件，例如，肌动描记器，肌动蛋白丝的强度和长度（Kong等人，2013）。

食谱

疏散解决方案
0.01％（v/v）Silwet在去离子水中

致谢

该方案基于Kong等人（2013）描述的方法。这项工作得到了日本教育，文化，体育，科学和技术部的科学研究的Grants-in-Aid（批准号25440140至S.-G.K.和25120721和25251033至M.W.）的部分支持。

参考文献

Kong，S.G.，Arai，Y.，Suetsugu，N.，Yanagida，T.and Wada，M。（2013）。叶绿体 - 肌动蛋白丝的快速切断和运动性是拟南芥中叶绿体避免反应所必需的植物细胞 25（2）：572-590
Wada，M。和Kong，S.G。（2011）。分析拟南芥中的叶绿体运动和重新定位。 < em> Methods Mol Biol 774：87-102。