材料和试剂

人胚胎干细胞（ESC）
M15细胞（ECACC，目录号：95102517）
小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）
0.1％明胶
PBS
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）高葡萄糖（Gibco ，目录号：11995-075）
DMEM低葡萄糖（Gibco ，目录号：11885-084）
KnockOut DMEM/F12（Gibco ，目录号：12660-012）
RPMI1640（Gibco ，目录号：11875-093）
胎牛血清（FBS）（Hyclone，目录号：SH30310.03）
200mM L-谷氨酰胺（L-Gln）（Nacalai Tesque，目录号：16948-04）
5,000单位/ml青霉素和链霉素（PS）的混合物（Nacalai Tesque，目录号：26252-94）
10mM MEM非必需氨基酸溶液（NEAA）（Gibco ，目录号：11140-050）
2-巯基乙醇（2-ME）（Sigma-Aldrich，目录号：M7522）
D - （+） - 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G5146）
KnockOut血清替代品（KSR）（Gibco ^®，目录号：10828）
B27补充剂（Gibco ^®，目录号：17504044）
重组人激活素A（R& D Systems，目录号：338-AC）
重组人bFGF（Pepro Tech，目录号：100-18B）
BIO（Calbiochem ^®，目录号：361550）
DAPT（Wako Pure Chemical Industries，目录号：041-30983）
Y-27432（和光纯药工业，目录号：688000）
丝裂霉素C（MMC）（Sigma-Aldrich，目录号：M4287）
0.05％胰蛋白酶-EDTA（Life Technologies，目录号：2014-11）
0.25％胰蛋白酶-EDTA（Life Technologies，目录号：25200-072）
EF介质（见配方）
hESC Medium（请参阅配方）
EB介质（参见配方）
hESCs内胚层培养基（见配方）
肠介质（见配方）

设备

24孔板（Corning，目录号：3526）
10mm圆盘（Corning，目录号：430167）
60mm培养皿（BD Biosciences，Falcon ，目录号：353004）
离心机
37℃5％CO 2细胞培养箱

程序

M15细胞的制备
1. 将5×10 6个M15细胞接种到具有10ml EF培养基的100mm培养皿中
2. 将M15细胞在37℃下在5％CO 2培养箱中温育
3. 当M15细胞汇合（2-3天）时，从100mm培养皿传代至5个100mm培养皿
  1. M15细胞用PBS洗涤
  2. M15细胞用1ml 0.05％胰蛋白酶-EDTA在37℃下胰蛋白酶消化5分钟
  3. M15细胞在190×g下沉淀5分钟。
  4. 将M15细胞接种到5个100mm培养皿中。
4. 当M15细胞汇合时，将M15细胞与含有EF培养基的10μg/ml MMC在5％CO 2培养箱中在37℃下温育2小时以阻止M15细胞增殖。 >
5. MMC处理的M15细胞用PBS洗涤
6. MMC处理的M15细胞用1ml 0.05％胰蛋白酶-EDTA在37℃下胰蛋白酶消化5分钟。
7. M15细胞在190×g下沉淀5分钟。
8. 在-150℃下将MMC处理的M15细胞重悬浮并冷冻于含有22％FBS和含有DMEM的20％DMSO的冷冻管中，每管1×10 7个细胞。
MEF的制备
1. 将MEF（5×10 6个）接种到具有10ml EF培养基的100mm培养皿中。
2. MEF在37℃下在5％CO 2培养箱中温育
3. 当MEF汇合（2-3天）时，从100mm培养皿通过到5个100mm培养皿
  1. MEF用PBS洗涤
  2. MEF用1ml 0.05％胰蛋白酶-EDTA在37℃下胰蛋白酶消化5分钟
  3. MEF在190×g下沉淀5分钟。
  4. 将MEF细胞接种到5个100mm培养皿中。
4. 当MEF细胞汇合时，将MEF与含有EF培养基的10μg/ml MMC在5％CO 2培养箱中在37℃下温育2小时。 MEF用MMC处理以阻止M15细胞增殖
5. MMC处理的MEF用PBS洗涤
6. MMC处理的MEF用1ml 0.05％胰蛋白酶-EDTA在37℃下胰蛋白酶消化5分钟。
7. M15细胞在190×g下沉淀5分钟。
8. 在-150℃下将MMC处理的M15细胞重悬浮并冷冻在含有每管2×10 6个细胞的含有DMEM的22％FBS和20％DMSO的冷冻管中。
维持人类ESC
1. 将1×10 5个MMC处理的MEF细胞接种到具有EF培养基的明胶包被的60mm皿中。
  注意：与小鼠ESC相比，使用较低数量的MEF细胞。
2. 将MMC处理的MEF细胞在5％CO 2培养箱中在37℃温育过夜。
3. 将5×10 6个人ESC在37℃下在5％CO 2培养箱中的hESC培养基（第0天）上铺板在MEF包被的皿上，直到传代（4-7 天）。
4. 每天更换培养基。
人类ESC的肠分化
1. 将1×10 7个MMC处理的M15细胞在37℃下在5％CO 2培养箱中接种到两个明胶包被的24孔板上过夜。
2. 在5％CO 2培养箱中在37℃下，用10μMY-27632（其为ROCK抑制剂并加入以抑制凋亡）处理铺在MEF包被的培养皿上的ESC（步骤C3） ℃过夜（第1天）。
3. 用PBS洗涤ESC
4. 将ESC用1ml 0.25％胰蛋白酶-EDTA在37℃下胰蛋白酶消化5分钟
5. ESC细胞在190×g下沉淀5分钟。
6. 除去上清液，并将1×10 6个细胞/ml重悬浮于EB培养基中。
7. 将5×10 4个在500μlEB培养基中的ESC接种到M15预包被的孔（第0天）。
8. 在第1,3,5,7和9天将培养基更换为hESCs内胚层培养基。
  注意：人ES细胞衍生的定形内胚层诱导与小鼠ESC的不同。
9. 在第10天将培养基更换为2ml肠道培养基。
10. 每两天用2ml肠内培养基更换培养基（图1）。
  
  图1.第30天时人ESC诱导的肠细胞。表达肠转录因子CDX2的细胞对于碱性磷酸酶（ALP）染色为阳性，碱性磷酸酶（ALP）是吸收性肠细胞的标志物。红色：CDX2，黑色：ALP。比例尺表示100μm

食谱

EF介质
含有10％FBS的DMEM高葡萄糖 2 mM L-Gln
50单位/ml PS
hESC中等
含有20％FBS的DMEM/F12 2 mM L-Gln
50单位/ml PS
100μMNEAA
100μM2-ME
5 ng/ml bFGF
EB介质
含有10％FBS的DMEM高葡萄糖 2 mM L-Gln
50单位/ml PS
100μMNEAA
100μM2-ME
hESCs内胚层培养基
RPMI1260与100ng/ml激活素A
2％B27补充剂
2 mM L-Gln
50单位/ml PS
100μMNEAA
100μM2-ME
肠介质
DMEM低葡萄糖与1mg/ml D - （+） - 葡萄糖 10％KSR
2 mM L-Gln
50单位/ml PS
100μMNEAA
100μM2-ME
5μMBIO
10μMDAPT

致谢

该协议改编自Ogaki等人（2013）。这项工作得到了一个Grant-in-Aid（＃21390280到SK和＃21790671到NS）和部分由全球COE赠款（Cell Fate监管研究和教育单位，SK）的支持，并从项目从教育，文化，体育，科学技术部（MEXT）日本实现再生医学。

参考文献

Ogaki，S.，Shiraki，N.，Kume，K。和Kume，S。（2013）。 Wnt和Notch信号指导胚胎干细胞分化为肠系谱。 Stem Cells 31（6）：1086-1096。