材料和试剂

70％乙醇
DMEM或其他组织培养细胞培养基
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich）
甲醛
100％甲醇
PBS
兔抗LC3B抗体（LC3B（D11）XP 兔mAb）（Cell Signaling Technology，目录号：3868）
HRP结合的二抗
荧光标记的抗兔二抗（Molecular Probes，Life Technologies，目录号：A-11008）
ProLong ^®金抗锑试剂与DAPI（Life Technologies，目录号：P36935）
M-PER裂解缓冲液（Pierce Antibodies，目录号：78501）
5％脱脂奶粉
完全ULTRA蛋白酶抑制剂混合物片剂（Roche Diagnostics，目录号：05892970001）
PhosSTOP磷酸酶抑制剂混合物片剂（Roche Diagnostics，目录号：04906837001）
样品缓冲液（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0737）
增强型化学发光（ECL）
吖啶橙（Sigma-Aldrich，目录号：A8097）
4-15％Mini-PROTEAN TGX预制凝胶（Bio-Rad Laboratories，目录号：456-1085）
E64d /胃蛋白酶抑制剂A（Sigma-Aldrich，目录号：E8640/P5318）
TBS（参见配方）
TBS-Tween（参见配方）
AbDil-Tw（参见配方）
TBS-Tx（参见配方）
AbDil-Tx（参见配方）
运行缓冲区（参见配方）
传输缓冲区（请参阅配方）

设备

24孔板
12孔板（或6孔板）
1.5 ml管
圆形显微镜盖玻片（Fisher Scientific，目录号：12-545-81）（这些盖玻片可以使用，不需要额外的涂布程序）
幻灯片
镊子有细微的提示
转移移液器
潮湿室（可从15厘米板，石蜡膜，箔和湿金缕梅自制）
带有液体瓶和管道的真空泵，用于清除洗涤溶液。
荧光显微镜
Western印迹装置（SDS-PAGE运行盒，电源，振荡器，转移盒，PVDF膜等）
组织培养装置（CO 2培养箱，组织培养罩等）

软件

MetaMorph

程序

LC3B免疫荧光
1. 放置一个盖玻片每孔在24孔板，加入约0.5毫升70％乙醇1分钟，以盖玻片灭菌。吸出乙醇，让其干燥5-10分钟。在实验前一天将组织培养的细胞接种在24孔板上，以使它们附着于盖玻片。 [对于要在盖玻片上电镀的细胞，这取决于实验的药物治疗的时间，使得最终细胞融合将是观察的最佳（80-90％）]。
2. 在实验当天，用不同浓度的小分子化合物处理所需时间。
3. 通过替换为0.5毫升冷的100％甲醇（预先存储在-20°C）固定细胞和固定5分钟。由于冷的甲基纤维素预先存储在-20℃并且固定时间短，所以该步骤可以在室温下在台上进行。细胞也可以在室温下在PBS + 4％甲醛中固定20-30分钟，然后用TBS-Tx透化20分钟。
4. 用0.5 ml PBS洗涤盖玻片一次，并更换为0.5 ml AbDil-Tx封闭。嵌段步骤可以从室温30分钟至4℃过夜。例如，人们可以使用RT 30分钟，1小时，2小时或4℃2小时过夜
5. 准备一抗。来自细胞信号传导的LC3B抗体可以在AbDil-Tx中以1/200-1/500稀释。通常一个盖玻片需要30-100μl
6. 转移盖玻片到潮湿的房间。其可以由15cm圆形组织培养板制成。切一块方形或矩形石蜡膜，可以适应板的底部。使用手指和镊子向下压，以使石蜡膜紧密粘附在板的底部。盖玻片然后可以坐在石蜡膜上，液体在顶部。使用可以覆盖板的盖子的箔片，以保护盖玻片免受光。在这个潮湿的室中孵育盖玻片将保护盖玻片在所有步骤中的光。使用湿清洁垫保持潮湿室潮湿，以防止抗体蒸发
7. 添加稀释的LC3B抗体到盖玻片上。在室温下孵育1-4小时或在4℃下孵育过夜。如果孵育过夜，确保在每个盖玻片上至少加入50μl，并在潮湿箱中湿润kimwipes，以防抗体蒸发。
8. 在孵育时，通过将荧光标记的抗兔二抗稀释到AdDil-Tx中制备二级抗体。
9. 孵育后，通过用一只手握住装有TBS-Tx的转移移液管和连接到液体瓶和真空泵的管道以除去洗涤溶液来洗掉LC3B抗体。让TBS-Tx流过盖玻片以清洗抗体。每次盖玻片需要洗涤3次，每次约2ml的TBS-Tx。
10. 加入稀释的二抗在盖玻片上，并在室温下孵育约1-2小时。孵育后，以与上述相同的方式洗涤盖玻片
11. 在孵育结束前约10分钟，将带有DAPI的ProLong ^® Gold Antifade Reagent在冰箱中取出，使其升温至室温。将一小滴（约2-3μl）固定介质挤出到载玻片上。
12. 将盖玻片上的液体尽可能完全地吸走，并将盖玻片放在载玻片上，放在ProLong ^® Gold Antifade Reagent和DAPI封固剂的顶部。记住保持电池侧面朝下，并使它们与固定介质保持直接接触。
13. 具有DAPI封固剂的ProLong ^® Gold Antifade Reagent通常需要过夜固化，此步骤需要在室温下进行。将幻灯片放在抽屉或其他避光的地方，一夜之间让其干燥
14. 当载玻片准备好后，将其带到荧光显微镜观察和拍照（图1）。
  
  图1.LC3B免疫荧光显示Torin2诱导细胞中的自噬。 Hela细胞用指定浓度的Torin2处理3天，用针对LC3B和DAPI的特异性抗体染色。
LC3B蛋白印迹
1. 在实验前一天将组织培养细胞接种在12孔板（或6孔板）上，以使细胞附着到盖玻片上。
2. 在实验当天，在1小时前将10μg/ml的E64d /胃蛋白酶抑制剂A加入细胞中以增加自噬转换。然后将不同浓度的小分子化合物加入细胞中
3. 在所需的温育时间后，用PBS洗涤细胞一次。然后通过在细胞上直接覆盖100-200μl裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的M-PER）裂解裂解缓冲液中的细胞，并在冰上（或4℃）孵育10-20分钟。
4. 在孵育结束时，收集细胞裂解物在1.5ml管中，并在最高速度和4℃下旋转1分钟，以除去细胞碎片。
5. 将上清液转移到新管，标准化，并加入样品缓冲液。对于治疗几个小时的药物，通常不需要将其标准化，因为它们通常不影响细胞数量。然而，对于更长的治疗（长于几个小时），人们应当使样品中的蛋白质浓度标准化。煮沸并装载在SDS-PAGE上。可以使用15％SDS-PAGE或4-15％Mini-PROTEAN TGX预制凝胶，用于分离LC3B条带。
6. 将凝胶转移到PVDF膜中作为标准Western印迹方案
7. 使用5％脱脂奶粉在室温下在摇床上将TBS-吐温（"TBS-T"）中的PVDF膜阻断1小时。
8. 用TBS-T洗涤5分钟，3次。通过以1/1000稀释到AbDil-Tw来制备LC3B抗体
9. 在室温下将膜在稀释的LC3B中孵育2-3小时或在4℃过夜
10. 用TBS-T洗涤5分钟，3次。通过将其以1/1000稀释到AbDil-Tw中来制备HRP缀合的二抗
11. 在稀释的二抗中在室温孵育膜1小时
12. 用TBS-T洗涤5分钟，3次。
13. 轻轻使用纸巾干燥膜，将其正面朝上并平放在一片塑料包装上。
14. 使用准备的ECL来检测蛋白质。排出ECL，轻轻使用纸巾和金属湿巾干燥膜
15. 用塑料包装膜包裹膜。
16. 将其暴露于X射线胶片或使用成像机（图2）。
  
  图 2 。 LC3的蛋白质印迹显示Torin2诱导细胞凋亡和自噬。在增加浓度的AZD8055或Torin2处理细胞系3天，然后通过使用抗LC3B和抗微管蛋白抗体的蛋白质印迹分析进行分析
吖啶橙测定
1. 在导入LC3B免疫荧光前一天，将组织培养的细胞接种在24孔板的盖玻片上。
2. 在实验当天，用不同浓度的小分子化合物处理细胞达所需量的时间，然后加入1μg/ml吖啶橙15分钟。
3. 将细胞用PBS洗涤一次，固定在PBS + 4％甲醛中，用TBS-Tx洗涤，然后用DAPI安装在Prolong Gold中，这与步骤A11和A12相同。
4. 通过荧光显微镜拍摄照片（图3，左图）。
5. 使用MetaMorph定量每个帧中吖啶橙的总荧光，并除以框架内的细胞总数。然后将数字归一化为DMSO处理的细胞，以显示吖啶橙色折叠变化（图3，右图）
  
  图 3 。吖啶橙测定显示Torin2诱导细胞自噬。 Hela细胞用不同浓度的Torin2处理3天，然后用吖啶橙和DAPI染色。

食谱

TBS
50mM Tris-Cl 150mM NaCl，pH 7.5
TBS-Tween
TBS
0.1％Tween-20
AbDil-Tw
TBS
0.1％Tween 20
2％BSA
0.1％NaN 3
过滤，在4℃下保存
TBS-Tx
TBS
0.1％Triton X-100
AbDil-Tx
TBS
0.1％Tween 20
2％BSA
0.1％NaN 3
过滤，在4℃下保存
运行缓冲区
25 mM Tris碱
190 mM甘氨酸 0.1％SDS
传输缓冲区
25 mM Tris碱
190 mM甘氨酸 20％甲醇

致谢

该协议改编自以前发表的论文Qingsong等人（2013）。本议定书的实施得到了"千人计划"的支持和"百人才计划"的支持。

参考文献

Liu，Q.，Xu，C.，Kirubakaran，S.，Zhang，X.，Hur，W.，Liu，Y.，Kwiatkowski，NP，Wang，J.，Westover，KD，Gao，P.， D.，Niepel，M.，Thoreen，CC，Kang，SA，Patricelli，MP，Wang，Y.，Tupper，T.，Altabef，A.，Kawamura，H.，Held，KD，Chou，DM，Elledge， SJ，Janne，PA，Wong，KK，Sabatini，DM和Gray，NS（2013）。 Torin2的表征，是ATP竞争性mTOR，ATM和ATR的抑制剂。 Cancer Res 73（8）：2574-2586。
Qingsong，W.，Yeming，G.，Xuechun，L.，Hongjuan，L.and Jing，W。（2013）。自由基清除剂依达拉奉改善了兔子急性一氧化碳中毒后延迟的神经心理后遗症。 a> Undersea Hyperb Med 40（3）：223-229。