材料和试剂

DNA LoBind 1.5和2.0ml离心管（Eppendorf，目录号分别为22431021和22431048）
AMPure磁珠（Beckman Coulter，目录号：A63881）
乙醇（70％v/v，乙醇/水）
TruSeq DNA样品制备试剂盒（Illumina，目录号：FC-121-2001）
SYBR Safe（Life Technologies，目录号：S33102）
50b阶梯（Thermo Fisher Scientific，目录号：SM0373）
一次性无菌手术刀（Thermo Fisher Scientific目录号12-460-452）
Falcon TM 15ml锥形离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：14-959-49B）
QIAquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28704）
Qubit dsDNA HS测定试剂盒（Life Technologies，目录号：Q32851）
EpiTect亚硫酸氢盐试剂盒（QIAGEN，目录号：59104）
MinElute PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28004）
PfuTurbo Cx hotstart DNA聚合酶（Agilent，目录号：600410-51）
KAPA文库定量试剂盒（Kapa Biosystems，目录号：KK4824）
TE缓冲区（参见配方）
洗脱缓冲液（见配方）

设备

S2自适应聚焦声波破碎器（Covaris）
具有AFA纤维的微管与预切割卡扣帽（Covaris，目录号：520045）
冷冻水浴循环器（Thermo Fisher Scientific，型号：SC100-A10）
Thermomixer R（Eppendorf，目录号：022670107）
MiniSpin Plus TM sup/TM离心机（Eppendorf，目录号022620100）
磁性架（Life Technologies，目录号4457858）
涡旋混合器（Thermo Fisher Scientific，目录号02-215-365）
2100 BioAnalyzer（Agilent，目录号G2943CA）
Qubit 2.0荧光计（Life Technologies，目录号Q32866）
Horizon 11-14，水平凝胶电泳系统（Apogee Designs，型号：11068020）
Safe Imager 2.0蓝光透射仪（Life Technologies，型号：G6600）
ABI7900HT实时PCR系统（Life Technologies）
热循环仪（C1000 Touch）（Bio-Rad Laboratories，型号：185-1196EDU）
移液器（RAININ，各种型号）

程序

该过程的整体工作流程如图1所示。

图1.全基因组亚硫酸氢盐测序的文库构建工作流程

通过超声破坏DNA片段
1. 将从拟南芥叶组织中提取的〜2μg高质量，高分子量基因组DNA溶解在130μlTE缓冲液中，并转移至具有AFA纤维的6×16mm玻璃微管中，具有预狭缝卡口。使用常用的CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）方法提取的基因组DNA是合适的，只要基因组DNA以高分子量（> 12kb）运行并且作为在0.8％琼脂糖凝胶中的纯单带。基因组DNA的质量也可以用2100 BioAnalyzer监测（图2A）
  
  图2.通过本协议中所述程序的工作流程处理的拟南芥DNA样品（OE）的BioAnalyzer痕迹。 A.基因组DNA; B.超声断裂的DNA;超声破碎和磁珠清除DNA; D.通过基于琼脂糖凝胶的选择回收的接头连接的DNA片段; E.最终测序文库（PCR后扩增）。
2. 使用以下设置（用于片段化大多数片段在150-450bp范围内的DNA）将基因组DNA剪切成平均大小为300bp的片段在S2自适应焦点声学破碎器中（图2B）：
  占空比10％
  强度4
  周期/突发200
  时间132秒
  温度6°C
  S2仪器连接到设定在6℃的冷却水浴循环器，以便在超声处理过程中保持恒定的温度。
3. 转移到1.5毫升微量离心管，并用吸移管管理员估计回收的体积。通常，回收125μl的DNA溶液
4. 以0.73：1（v/v）的珠子与样品比例加入AMPure磁珠的悬浮液（浆液）。在构建测序文库之前，这种珠子与样品之比用于收集超过200bp的DNA片段
5. 在室温下孵育混合物15分钟，在Thermomixer R中以700rpm摇动，使DNA与珠结合。
6. 脉冲旋转收集管底部的混合物，然后将管在磁力架上1-2分钟，直到溶液完全透明。磁珠将被吸引到磁体，从而允许去除上清液。取出并弃去上清液。
7. 离开管在磁力架上，洗涤珠两次，如下：每次洗涤加入1毫升新鲜制备的70％乙醇，轻轻吸取珠上下六次，让珠子坐30-60秒，然后通过移液除去上清液而不干扰珠粒
8. 在第二次洗涤后，脉冲旋转管以收集痕量的乙醇，然后将管置于磁性支架上。用细尖移液器移除乙醇痕迹。
9. 在室温下将磁珠空气干燥1至3分钟。
10. 洗脱DNA如下：从磁力架上取下试管，放在塑料架上，加入30μl洗脱缓冲液，剧烈涡旋10秒，将试管放回磁力架，直到溶液变得完全澄清，然后使用移液器将含有DNA的上清液转移到干净的微量离心管中。通过加入另外30μl如上的洗脱缓冲液重复洗脱。合并两个洗脱级分。
11. 根据产品说明，将3μlDNA样品保存在Qubit 2.0荧光计中进行定量（ http ：//www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/Q32854 ）和用2100BioAnalyzer确认片段大小（图2C）。片段的所需大小范围应为200-450bp 此时，DNA可以储存在-20℃下备用
图书馆建设
根据制造商的方案，使用低通量TruSeq DNA样品制备试剂盒制备测序文库（ TruSeq DNA样品制备指南），并做了一些修改（见下文）。该试剂盒中包含的衔接头是甲基化的，因此与亚硫酸氢盐测序兼容，用于DNA甲基化分析
1. 在以下反应中修复DNA片段：
  50μl以上DNA样品（〜1.5μg）
  10μl末端修复反应缓冲液（包含在TruSeq Kit中）
  40μl末端修复混合物（包含在TruSeq Kit中）
  在30℃孵育30分钟。除了珠与样品的比率为1:1（v/v）之外，如上所述用AMPURE磁珠清洁反应混合物（DNA断裂部分：步骤A4-10）。洗脱在17.5微升洗脱缓冲液中的DNA。这种珠子与样品比率用于收集基本上所有的DNA片段
2. 在以下反应中将末端修复的DNA片段3'-腺苷酸化：
  15μl末端修复的DNA
  2.5μl3'-腺苷酸化反应缓冲液（包含在TruSeq试剂盒中） 12.5μlA-tail混合物（包含在TruSeq Kit中）
  在37℃孵育30分钟。腺苷酸化混合物与连接反应相容;因此，在这一步骤不需要清理
3. 在以下反应中将甲基化的衔接子连接到3'-腺苷酸化的DNA片段：
  30μl腺苷酸化DNA（来自步骤B2的整个腺苷酸化反应） 2.5μl连接反应缓冲液（包含在TruSeq试剂盒中） 2.5μl连接混合物（包含在TruSeq试剂盒中） 2.5μl适配器（包含在TruSeq Kit中）
  在30℃孵育10分钟。加入5微升连接终止缓冲液。使用如上所述的AMPure磁珠清洁样品（DNA断裂部分：步骤A4-10）。具有1:1（v/v）珠子与样品比率。在22.5μl洗脱缓冲液中洗脱接头连接的DNA
4. 如下在2％TAE琼脂糖凝胶中大小选择接头连接的DNA片段（250-500bp）。在500ml锥形烧瓶中制备100ml溶液，在微波炉中加热直至琼脂糖完全溶解，向熔融的琼脂糖溶液中加入SYBR安全染色（1：10,000v/v染料与凝胶比），并旋转混合，然后将凝胶 - 染料溶液倒入适当设置的凝胶电泳装置中。将10孔梳子放置在凝胶浇铸托盘的一端以形成孔。允许凝胶完全固化（〜30分钟）。在凝胶孔之一中加载50 bp梯度以帮助估计大小。将样品与合适的样品加载染料混合，并加载到任何额外的孔中。将电极连接到电源，并在100 V电泳，直到最快的移动染料达到3/4的凝胶长度从孔。当如本文所述加入染料时，不需要后电泳染色。使用SYBR Safe代替溴化乙锭以避免DNA片段的UV损伤（在观察期间）。在Safe Imager 2.0蓝光透射仪上观察凝胶。切割含有片段的凝胶区域 250-500 bp范围内使用无菌，一次性解剖刀（图3）。将凝胶切片转移到DNA LoBind 2.0ml离心管中。如果凝胶切片太大，它们可以放置在15ml锥形管中。琼脂糖凝胶溶解后（见下面的步骤5），如有必要将溶解体积分成DNA LoBind 2.0ml管用于DNA提取。
  
  图2.在琼脂糖凝胶中接头连接的DNA片段的大小选择将两个拟南芥基因组DNA样品（A和B）在S2自适应焦点声学破碎器中片段化，末端修复，3'-腺苷酸化，接头连接，并在2％TAE琼脂糖凝胶中分离。使用10孔形成梳（8mm宽孔）形成凝胶孔。将10μl即用载荷的50bp梯度装载在凝胶样品的侧翼位置用于切除过程。左：切除前;右：切除后。
5. 使用QIAquick凝胶提取试剂盒，根据制造商的说明从凝胶中提取DNA（ http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/qiaquick-gel-extraction-kit #resources ）。用22μl洗脱缓冲液（包括在QIAquick凝胶提取试剂盒中）洗脱DNA
6. 取出2μl，根据产品说明书用Qubit dsDNA HS测定试剂盒定量Qubit 2.0荧光计中的文库（ http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/Q32854 ）。使用该方案的最终文库产量通常为300-400ng（图2D），其对应于13-18DNA ng /μl的浓度。
  此时，DNA文库可以储存在-20℃下备用

亚硫酸氢盐处理
根据制造商的说明书（ http://www.qiagen.com/products/catalog/assay-technologies/epigenetics/epitect-bisulfite-kits - resources ）。简要地说：
1. 使用MinElute柱按照MinElute PCR纯化试剂盒中的说明进一步纯化和浓缩DNA（ http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/minelute-pcr -purification-kit＃resources ）。在15μl洗脱缓冲液（包括在MinElute PCR纯化试剂盒中）洗脱DNA 此时，亚硫酸氢盐转化的文库可以储存在-20℃下备用

图书馆丰富

使用尿嘧啶不敏感的PfuTurbo Cx hotstart DNA聚合酶和Illumina TruSeq文库构建试剂盒中包含的引物混合物扩增约1ng亚硫酸氢盐转化的文库，反应如下：
17.25μl双蒸水
15μlDNA模板（〜1ng，通常是上述文库的整个洗脱液） 5μlPfu Turbo Buffer（含Pfu Turbo聚合酶）
2.5μlDMSO
1.25μldNTP（10mM） 5μl引物混合液（包含在TruSeq Kit中）
1μlPfu Turbo Cx Hotstart聚合酶
扩增条件为：98℃变性30秒，14-18个循环（98℃15秒，60℃30秒，72℃1分钟），最后在72℃延伸1次5分钟。根据亚硫酸氢盐处理步骤的产量，PCR扩增循环的数目应尽可能小。该步骤是选择性富集在两端具有甲基化衔接子的DNA文库片段，并产生用于精确定量的足够的DNA。
使用如上所述的AMPURE磁珠（DNA断裂部分：步骤A4-10）以0.85：1（v/v）的珠与样品比例清洗PCR扩增产物两次。洗脱DNA在30μl洗脱缓冲液中。这种珠子与样品之比用于去除dNTP和引物，同时保留所有DNA扩增片段超过150bp。
使用1微升的DNA样品用于2100 BioAnalyzer的片段大小确认。通过该方案产生的文库的平均插入大小为〜360bp（图2E）。通过调整DNA超声裂解条件（DNA断裂部分：步骤A2），并通过在大小选择步骤（文库构建部分：步骤B4）选择所需的范围，可以获得不同的平均大小。
使用1μlDNA样品在Qubit 2.0荧光计中定量，1μl用于通过qPCR用ABAP7900HT实时PCR系统上的KAPA文库定量试剂盒定量。这种扩增方案产生50-200ng的库在〜26μl。
该库现在已准备好进行测序。如果需要，通过用洗脱缓冲液稀释（参见配方）将文库浓度调节至10nM，并提交测序。

食谱

洗脱缓冲液
10mM Tris，pH8.0
TE缓冲区
10mM Tris-HCl，pH8.0 1mM EDTA

致谢

该方案改编自Wang等人（2013）。这项工作得到国家科学基金会（IOS-0842716）授予Z.M.的资助。

参考文献

Lister，R.，O'Malley，R.C.，Tonti-Filippini，J.，Gregory，B.D.，Berry，C.C.，Millar，A.H。和Ecker，J.R。（2008）。拟南芥中表观基因组的高度整合的单碱基分辨率图。/a> 电池 133（3）：523-536。

TruSeq DNA样品制备指南（PE-940-2001）
（ http://nextgen.mgh.harvard.edu/attachments/TruSeq_DNA_SamplePrep_Guide_15005180_A.pdf）
Wang，Y.，An，C.，Zhang，X.，Yao，J.，Zhang，Y.，Sun，Y.，Yu，F.，Amador，D.M.and Mou，Z.（2013）。拟南芥 Elongator复合亚基2表观遗传调节植物免疫反应。植物细胞 25（2）：762-776。